Transcript FcgRIIB a
Die Rolle von FcgRIIB in der
B-Zell-Entwicklung
Dipl. Ing. Anne Bärenwaldt
AG Nimmerjahn
Fc Rezeptoren (FcR)
Rezeptoren für Immunglobuline
Expression auf Immunzellen
Binden konstante Domäne der schweren Kette von Antikörpern
Verbindung zwischen adaptiven Immunsystem und
Effektorfunktionen des angeborenen Immunsystems
FcR Arten
Für jeden AK Typ gibt es Fc Rezeptoren
Fc Rezeptor für
•
•
•
•
•
IgA Fc a R
IgG Fc g R
IgE Fc e R
IgM Fc m R
IgD Fc d R
Maus 4 Gene für
•
•
•
•
FcgRI
FcgRII
FcgRIII
FcgRIV
Mensch 8 Gene für
•
•
•
FcgRI (A, B, C)
FcgRII (A, B, C)
FcgRIII (A, B)
Fc g Rezeptoren
Größte und am häufigsten vorkommende Gruppe von FcR
verschiedene Spezifität, Affinität, Struktur, Expression und biochem. Funktion
FcgRI
FcgRIIB
FcgRIII
FcgRIV
g2 a
g2 a
Mouse
ITAM
g2 a
high affinity
FcgRI
ITIM
a
low/medium affinity
FcgRIIB
FcgRIIA
hFcgRIIIA
Human
ITAM
g2 a
ITIM
a
a
g2 a
FcgR
Aktivierende FcgR
• FcgRI, FcgRIIA, FcgRIII
Inhibierende FcgR
• FcgRIIB
werden gemeinsam auf Effektorzellen exprimiert
• Makrophagen, Neutrophile, NK, dendritische Zellen (DC), Mastzellen
Bindung von Immunkomplexen (IC) aktiviert aktivierenden und
inhibitorischen Signalweg
Schwellenwert für Aktivierung der Zelle wird gesetzt die Stärke der
Immunantwort bestimmt
Vielzahl an downstream Antworten wird dadurch reguliert
• Degranulation, Phagozytose, Antigen-Präsentation, antibodydependend cellular cytotoxity (ADCC)
Signalleitung
FcgRI
Aktivierende FcgR benötigen für Signalleitung
assozierte Adaptermoleküle
ITAM
Adaptormolekül ist vom Zelltyp abhängig
g2 a
Am häufigsten ‚common g chain‘
Adaptor hat immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)
Inhibitorischer Rezeptor besitzt immunoreceptor tyrosine-based
inhibitory motif (ITIM)
FcgRIIB
Braucht kein Adaptormolekül
ITIM
a
Signalleitung aktivierender FcgR
downstream signaling pathways (ERK, p38, JNK)
cell activation
-ADCC
-Phagocytosis
-Cytokine release
-Oxidative burst
Src-family Kinase phosphoryliert
ITAM
SH2 Bindedomäne entsteht
Syk bindet
Signalkaskade wird eingeleitet
Ras/Raf/MAP Kinase pathway
wird aktiviert
Kalzium abhängige Signalwege
aktiviert
Signalleitung inhibitorischer + aktivierender FcgR
Co-Ligation beider FcgR führt zu
Phosphorylierung des ITIM vom
FcgRIIB
SHIP bindet an entstandene SH-2
Dömäne
Blockiert Ras Weg und
Kalziumsignalkette (Btk und PLC-γ)
Inhibitorischer FcgRIIB (CD32)
Größe: 40 kDa
Aufbau:
• 2 extrazelluläre Domänen
• 1 Transmembranregion
• 1 cytoplasmatischer Schwanz
FcgRIIB
ITIM
a
geringe Affinität für monomeres IgG
hohe Avidität für Immunkomplexe
Signalleitung mittels ITIM (immunoreceptor tyrosine-based
inhibitory motif)
2 Isoformen
• IIB-1 Signalwirkung
• IIB-2 Signalwirkung + Internalisiert/phagozytotisch
Einziger FcR auf B-Zellen
FcgRIIB Signalleitung in B-Zellen
Co-Ligation mit:
• Sich selbst führt zu Apoptose
• BCR Verminderung des BCR
Aktivierungssignal
anti-apoptotisches Signal
Co-Ligation mit BCR führt zur
Aktivierung der Kinase Lyn
Lyn phosphoryliert ITIM des
FcgRIIB
Initiation des Signalwegs (SHIP)
Blockiert Ras Weg und Kalziumsignalkette (Btk und PLC-g)
FcgRIIB als Toleranzkontrollpunkt
FcgRIIB setzt Schwellenwert für Aktivierung von B-Zellen
Induzierte Apoptose durch Selbst-Ligation
mögliche Beteiligung an Erhalt der Toleranz
mögliche Deletion selbst-reaktiven B-Zellen
FcgRIIB wichtig für B-Zell Toleranz
Untersuchung von Toleranz:
Autoimmunanfällige Mausstämme (NZB, BXSB, NOD, MRL/lpr)
entwickeln spontan Autoimmunität (z.B. SLE)
FcgRIIB und Toleranz
Bolland und Ravetch 2000
Fcgr2b -/- Mäuse
(Balb/C und C57.B6)
Balb/C
• Wie WT
B6
• Erhöhte Sterberate
• Entzündungen in Vielzahl von
Organen
• Erhöhter Proteingehalt im Urin
• Glomerulonephritis
• Nierenversagen
genetischer Hintergrund ist sehr
wichtig
Test auf anti-nucleäre AK
Immunfluoreszenzfärbung von
Hep-2 Zellen
Inkubation mit Serum der Mäuse
Detektion von gebundenem IgG
mit FITC-anti-mouse IgG
ELISA IgG AK gegen:
• dsDNA
• dsDNA mit Histon 1
• dsDNA mit Histon 2A und 2B
Toleranzverlust in FcgRIIB-/-
Bolland und Ravetch 2000
Wiederherstellung der Toleranz durch FcgRIIB
McGaha et al. 2007
Retroviraler Vektor für Expression von FcgRIIB
Gewinnung von KM-Zellen aus
autoimmunanfälligen und FcgRIIb-/- Mäusen
Fcgr2b
Kontrollvektor
Transduktion mit retroviralem Vektor
Rekonstitution bestrahlter Mäuse
mit autologem tranduziertem KM
FcgRIIB
Mock
Untersuchung der Mäuse
Überlebensrate NZM2410
Indirekter Immunofluoreszenzassay
ANA Reaktivität gegen fixierte HepG2 Zellen
Fcgr2b
Mock
ELISA
Verbessertes Überleben
Weniger Auto-AK
McGaha et al.
Schlussfolgerung
FcgRIIB ist wichtig für den Erhalt der Toleranz
Bei Fehlen des Rezeptors entsteht
• IgG anti-DNA AK
Verlust von Toleranz
Herstellung der Toleranz durch Wiederherstellung des FcgRIIB
Levels
Ist wichtiger Kontrollpunkt in peripherer Toleranz
Einfluss von FcgRIIB in B-Zell-Entwicklung
Wo genau reguliert er?
Keimzentrum (germinal center)
Induzierbare lymphoide Mikroumgebung
Entstehen durch Antwort auf T-abhängige Antigene
Entstehen durch Einwanderung aktivierter B-Zellen in die
Lymphorgane
AG wird im GC als Immunkomplex (IC) von folliculären
dendritischen Zellen (FDC) präsentiert
Hohe Mutationsfrequenz in variabler Region
des BCR in GC-B-Zellen
Selektion von hoch affinen B Zell Varianten
Formation von Memory B Zellen
Keimzentrum
Durch Mutation auch BCR mit verminderte Affinität
muss Mechanismen geben, die zwischen hoch und niedrig
affinen B-Zellen unterscheiden
Annahme: B Zellen mit hoch-affinem BCR werden bevorzugt
stimuliert
Aufnahme von AG und Präsentation für Th Lymphozyten
Dieses Modell bezieht sich nur auf den BCR
Ignoriert den Schwellenwert von FcgRIIB bei der B-Zell Selektion
durch IC Interaktion
FcgRIIB kann durch Apoptosesignal niedrig affine B-Zellen
eliminieren
Rao et al. 2002/Jiang et al. 1999
Untersuchung der Expression von FcgRIIB in Keimzentrumszellen
Reduzierte FcgRIIB Expression in GC-B-Zellen
Facs
Milzzellen
2.4G2 FcgRIIB
K9.361 FcgRIIB
B220+IgD+GL7- Nicht GC Zellen
B220+IgD-GL7+ GC B-Zellen
Immunisiert mit NP-CGG
Histologie 9 Tage nach Immun.
Histologie
Milz
2.4G2 FcgRIIB
GL7 GC
Chimäre
Mäuse
• Bestrahlte IIB -/- Mäuse
• Rekonstitution mit KM von IIB+/+ Mäusen
Färbung des IIB Rezeptors im GC
nur bei B-Zellen
FcgRIIB in GC, auch in FDC reichen Regionen
reduzierter Schwellenwert für B-Zell Aktivierung
Rao et al. 2002
Verminderte FcgRIIB Expression in GC
B-Zellen von autoimmunanfälligen Mäusen
Milzzellen von 8-Mo. alten immunisierten
Tieren
Autoimmunanfällig (SLE)
•
•
NZB
(NZB x NZW)F1
Nicht-anfällig
•
NZW
geringere Expression von FcgRIIB auf
GC-B-Zellen in allen Mäusen
In autoimmunanfälligen Mäusen ist
FcgRIIB Expression auf GC B-Zellen
geringer als bei nicht anfälligen Mäusen
Jiang et al. 1999
Zusammenfassung Rao et al./Jiang
Expression von FcgRIIB ist in GC B Zellen herunterreguliert
FcgRIIB Expression in Autoimmunanfällige Mausstämme noch
geringer
Wirkmechanismus von FcgRIIB?
Aufgabe von FcgRIIB im GC/ bei der Affinitätsreifung?
Welchen Effekt hat die verringerte FcgRIIB Expression im GC?
Rolle von FcgRIIB in Toleranzerhaltung?
Modellsystem 3H9 Maus
Transgenes knock-in Modell für Anti-DNA exprimierende B-Zellen
Rearrangiertes schweres Kettengen (anti-DNA) wird benutzt
• Aus DNA bindendem Hybridoma aus MRL.lpr Maus
• Insertion im Igh Locus (IgMa Allel)
Editierung der leichten Kette ist wichtig für den Erhalt von Toleranz
Durch Kombination mit verschiedenen Leichten Ketten entstehen
autoreaktive AK
Weiterentwicklung des 3H9 Modells durch Einfügung weiterer
Argininreste DNA Bindung von AK meist über Arg-Reste
• 3H9/56R ein Arg Rest
• 3H9/56R/76R zwei Arg Reste
Modellsystem 3H9 Maus
Mit steigender Arg Anzahl steigt Autoreaktivität der produzierten AK
(je basischer höhere Autoreaktivität)
Fukuyama et al. 2004
Verwendung von 3H9 und 3H9 56R Mäusen mit und ohne Fcgr2b
Expression
• Balb/C und C57.B6
Untersuchung der Toleranzerhaltung
Spezifität des genetischen Hintergrundes
Balb/C Hintergrund:
• Sowohl bei niedrig-affinem 3H9 Allel als auch beim hoch-affinen 56R
Allel wurde Toleranz in Balb/C Mäusen erhalten
C57.B6 Hintergrund:
• Höhere IgM und IgG Produktion bei 56R
ELISA
IgM
Anti-DNA
IgG
Serum
C57.B6: 12 Wochen alt
Fukuyama et al.
Mechanismus zum Erhalt der Toleranz
Untersuchung zur Auswahl der leichten Kette in den Mausstämmen
• Vκ21D Leichte Kette, die am effektivsten die Autoimmunität der
schweren Kette unterdrückt
• Vκ38c weniger effizient
Veränderte Benutzung von leichten Ketten in den Mausstämmen
Unabhängig von FcgRIIB
Fukuyama et al.
FcgRIIB Defizienz steigert IgG anti-DNA Produktion
ELISA
Serum
Fcgr2b Defizienz erhöht Anzahl
von IgG anti-DNA
IgG
Anti-DNA
IgM
durch erhöhtes Auftreten von
IgG produzierenden
Plasmazellen/Plasmablasten
Splenocyten
Fukuyama et al.
IgG anti-DNA ist pathologisch
Histologie der Niere
C57.B6 Fcgr2b-/- entwickeln nach
6 Mo. starke Glomerulonephritis
Nur 56R Fcgr2b-/- zeigte gleiche
Pathologie wie pos. Kontrolle
(Fcgr2b -/-)
•
•
•
Glomerulonephritis
Immun-Komplex Ablagerung
Komplement C3 Ablagerung
Nach 9 Mo.
Fukuyama et al.
Zusammenfassung Fukuyama et al.
„Editing“ ist der primäre zentrale Mechanismus um autoreaktive
B-Zellen in unschädliche B-Zellen umzuwandeln
• Nutzung verschiedener leichter Ketten in unterschiedlichen
Mausstämmen
FcgRIIB Defizienz führt zu Produktion von IgG produzierenden
Plasmablasten
negatives Feedback-Signal ist gestört
Proliferation autoreaktiver Plasmazellen
Paul et al. 2007
Rolle von FcgRIIB in der peripheren B-Zell Toleranz
Prinzip:
follicular exclusion
• Ansammlung von autoreaktiven B-Zellen an der T-B Grenze von
Milzfollikeln
Hypothese:
folliculare exclusion ist abhängig von normalem FcgRIIB signalling
Versuchsprinzip:
3H9 Mäuse defizient in FcgRIIB
wenn FcgRIIB an peripherer Toleranz und follicular exclusion
beteiligt ist, sollte in 3H9FcgRIIB-/- Tieren ein Verlust der folliculärer
Exclusion auftreten
Erhöhte Anzahl autoreaktiver B-Zellen in FcgRIIb -/Milz
Bei Paarung von 3H9 mit λ1
leichter Kette entsteht
autoreaktiver AK
λ1 B-Zellen exprimieren
transgenen IgMa Allotypen
FcgRIIb-/- Mäuse haben erhöhte
Frequenz von λ1 B-Zellen
autoreaktive AK für weitere
Nachweise
Paul et al.
Verlust der follicular exclusion bei FcgRIIb Defizienz
Histologische Untersuchung der Milz
λ1 B Zellen
B-Zell Zone
T-Zell Zone
• 3H9FcgRIIB+/+B6 Mäuse:
λ1 B Zellen an T-B Grenze von
Milzfollikeln
• 3H9FcgRIIB-/-B6 Mäuse:
λ1 B Zellen in gesamten Follikel
verteilt
• Stärkere Keimzentrumsaktivität
in FcgRIIB-/- Mäusen
• λ1 B-Zellen im Keimzentrum
100-fach
600-fach
Paul et al.
Erhöhte Anzahl von Plasmazellen in 3H9RIIB-/- Tieren
FACS
Milz
B220: B-Zell Marker
CD138: Marker für Plasmazellen
ELISPOT
Kein Unterschied bei IgM antiDNA produzierenden B-Zellen
8x höhere Anzahl an IgG anti-DNA
produzierenden B-Zellen in
3H9RIIB-/- Tieren
Klassenwechsel der autoreaktiven
B-Zellen hat stattgefunden
Anti-DNA
Paul et al.
Erhöhte Anzahl von anti-DNA-AK im Serum
Serum Anti-DNA
3H9FcgRIIB-/- Mäuse:
• Höhere Anzahl an IgG und IgM
anti-DNA AK
Alle Beobachtungen waren
Altersabhängig:
• Junge 3H9FcgRIIB-/- Mäusen
(2 Monate alt) zeigten WT
verhalten
• Alte 3H9FcgRIIB-/- Mäusen
(9 Monate) zeigte IgG Anti-DNA
Paul et al.
Zusammenfassung Ergebnisse (Paul et al.)
FcgRIIB ist notwendig um Zellen aus Keimzentrum auszuschließen
Klassenwechsel zu IgG wird dadurch verhindert
Keine Plasmazellentwicklung von autoreaktiven B-Zellen
Zusammenfassung: Bedeutung von FcgRIIB
FcgRIIB hat wichtige Funktion in der peripheren Toleranz
Ist innerhalb und außerhalb des Keimzentrums unterschiedlich
exprimiert (Rao et al.)
In autoimmunanfälligen Mäusen im Keimzentrum noch schwächer
exprimiert (Jiang et al.)
Reguliert Anzahl IgG produzierender Plasmazellen/-blasten
Verhindert das Einwandern autoreaktiver B-Zellen in die Milzfollikel
(Paul et al.)
Unser Projekt
Untersuchung der Funktion von humanem FcgRIIB bei
der Toleranzerhaltung
FcgRIIB und Toleranz beim Menschen
systemischer Lupus Erythematodes (SLE)
• hohe Anzahl von autoreaktiven IgG Antikörpern
Allele Varianten von FcgRIIB
• Ile232Thr
Assoziation in verschiedenen Asiatischen Bevölkerungen
keine Assoziation in Europäern
Promoter Polymorphismus
• in Europäern
Verminderte Expression in memory B-Zellen
• in SLE Patienten in der Afrikanisch-Amerikanischen Bevölkerung
Hohe Heterogenität im Menschen
Genetischer Hintergrund ist sehr wichtig
Mensch vs. Maus
• FcgR von Maus und Mensch unterschiedlich
• Bisher nur epidemiologische Assoziationen beim Menschen
Testsystem notwendig, dass menschliches Immunsystem darstellt
humanisierte Maus
Sind Ergebnisse aus Mausstudien auch für das menschliche
Immunsystem gültig?
Versuchsaufbau
Vorbereitung der hHSC:
Promoter
GFP
Reporter
Gen
miRNA
n
Isolation
hHSC
Transduktion mit lentivirus
kodierter miRNA
Vorbereitung der Mäuse:
Bestrahlung
Neugeborenen Rag2-/NOD/SCID
Rekonstitution
mit hHSC
Mäuse entwickeln
menschliches Immunsystem
Untersuchung des Immunstatus
Gesundheitszustand
• Überleben
• Vitalität
Veränderte B-Zell Antwort
•
•
•
•
•
•
Schwellenwert
Antikörper-Affinität
Veränderter Klassenwechsel
anti-DNA AK
antinucleäre AK
anti-Chromatin AK
Untersuchung des Auftretens von SLE
• Entwicklung von Glomerulonephritis
• Nierenfunktion
• Proteingehalt im Urin
• histologische Untersuchung der Leber
Derzeitige Arbeit
Klonierung von Fc g Rezeptoren (inhibitorisch and aktivierend),
CD22 und CD72
Stabile Transfektion von CHO Zellen mir diesen Plasmiden
Zelllinien exprimieren diese Rezeptoren
Klonierung von miRNA/shRNA
Stabile Transfektion von CHO Zelllinien und primären B-Zellen
FcgRIIB, CD22, CD72
Effektivitätstest der miRNA/shRNA
(positive Kontrolle)
Aktivierende FcgR
miRNA/shRNA sollten keinen
Einfluss auf diese haben
(negative Kontrolle)
Vielen Dank für die Aufmerksamkeit