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奈良先端科学技術大学院大学
植物グローバル教育プロジェクト
平成25年度ワークショップ
やってみようよ！画像、統計、ゲノム・トランスクリプトーム
解析ハンズオン実習
ImageJ によるバイオ画像解析チュートリアル
ダウンロード版
2013-06-06
東京大学 大学院新領域創成科学研究科 先端生命科学専攻
朽名 夏麿，秋田 佳恵，湖城 恵
朽名 担当スライド
( 3 - 56 )
生命現象のスケールと画像
塩基配列
生体分子
超微細構造
0.1 nm
(10-10 m)
電顕
2000 km
200 nm
10 nm
(10-8 m)
オルガネラ 細胞
10 mm
(10-5 m)
組織 器官 個体
個体群
10 mm
(10-2 m)
1m
1 km
(103 m)
地球環境
105 km
(108 m)
スケール
画像 (バイオイメージング)
衛星画像
デジタル画像は生命科学の広いスケールで扱われる実験データ．
その解析法を習得することで，共焦点顕微鏡だけでなく，電顕や
デジカメ，Google Earth のような衛星画像を用いた研究も容易に．
生物以外の分野でも多方面に応用可能 (ネット上のデータの 80%
が画像などの非構造化データと言われている)．
デジタル画像解析をはじめる前に
顕微鏡で撮影する際
適切な撮像設定(レンズ，励起光強度，露光時間，ピンホール径等)．
留意点: S/N(シグナル-ノイズ比)，ダメージ，サチュレーション防止等
適切な画像解析の環境
良いソフトウェア: 現時点では ImageJ の利用を勧める．
マシン: OSは問わない．速くてメモリが多いもの．64 bit OS 推奨．
良いモニタを正しく設定して使う．
インストールと基本画面
ImageJ と KBI plugins のインストール
http://hasezawa.ib.k.u-tokyo.ac.jp/zp/Kbi/ImageJTutForNaist2013
ImageJ の基本画面
← メニューバー
← ツールバー
← ステータスバー
← 画像タイトル
画像情報(サイズ等)
← 画像ウインドウ
タバコBY-2 液胞膜
ツールバー
赤い線: 頻用するもの．
青い線: selection (ROI)．
http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/tools.html
赤い三角形の付く
アイコンは右クリック
で機能切り替え可．
本実習での表記
メニュー操作に関して:
File - Open…
File から Open… を選択する．
ショートカット操作に関して:
t
Windows : t キー．
Mac : コマンド + t キー．
Shift + c
Windows : Shift を押しながら c キー．
Mac : コマンド と Shift を押しながら c キー．
※コマンド一覧は Plugins - Shortcuts - Control Panel… でツリー形式，
Plugins - Shortcuts - Create Shortcut の Command 欄でプルダウン形式で確認できる．
※メニューの一部は ij.jar 内の IJ_Props.txt を編集することでカスタマイズ可能．
JARはZIP形式として展開できる．
メニューを完全に変更したい場合は ImageJ.java をいじる．
※ ショートカットの一覧表示や追加は Plugins - Shortcuts メニューから可能．
一部のショートカットはソース中に埋め込まれている ( t とか < とか) ．
デジタル画像の基本
画素と画素数
←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K
159
153
+ キーで拡大
- キーで縮小
(3200%) ： 拡大・縮小率
画素, pixel (picture element)
画像ウインドウ左上に青い枠が表示されている場合，
ウインドウに画像全域が収まっていない．
現在表示されている部位が，画像全域のどこに相当する
かを示している．
座標系と画素と輝度
←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K
x
(3, 0)
輝度30
(x,y) = (0, 0)
輝度 35
y
(3, 2)
輝度 21
ImageJ では左上を原点(0, 0)とし，右に X 軸，下にY軸が伸びる．
各画素には輝度 (強度，intensity．明度 brightness とも言う)
が割り当てられている．
※ 「0 から数えること」「左上が原点であること」 に注意．
159
座標系と画素と輝度
File - Save As - Text Image…
153
x
(3, 0)
輝度30
(x,y) = (0, 0)
輝度 35
(3, 2)
輝度 21
159列
y
表示を縮小
Excel で開いた例
153行
PowerPoint 等での強拡大に注意
PowerPoint
で拡大
補間なし
PowerPoint や Photoshop 等で補間を
ともなう"強拡大"をするとデジタル的
な解像度や分解能と関係なく擬似的
にズームしたようになるが，解像度や
分解能が上がる訳ではない．
データ解釈を誤らないよう注意．
補間あり
Brightness & Contrast による表示状態の変更 ( Shift + c キー)
真っ白
真っ黒
スライドバーを動かすことによる調整は，表示上の"明るさ"を
変えているに過ぎない．→ 輝度は変化しない．
8-bit 画像の場合は Apply ボタンを押すことによって，その時の
表示範囲が0～255にスケールされる．→ 輝度が変化する．
輝度ヒストグラム ( h キー )
h
位置情報を無視した上で，全画素について
輝度の分布を可視化したもの．
輝度の基本的な統計量(最小，最大，平均，
標準偏差等)も表示されている．
輝度のタイプ
輝度のデータ型．
ビット深度(bit depth), bits per pixel,
量子化ビット数等とも呼称．
グレイスケール画像, 濃淡画像
≠白黒画像
8-bit: 0～255 の整数(integer)
16-bit: 0～65535 の整数(integer)
32-bit: 浮動小数点数(float)
実数の近似値．±3.4*1038 の
範囲で7桁位の精度．
(3, 0)
輝度30
(0, 0)
輝度 35
(3, 2)
輝度 21
カラー画像
8-bit Color: 使わない．
RGB Color: 赤緑青の3チャネルを
重ねることによるカラー表現．
各チャネルのデータ型は8-bit，
16-bit, 32-bit のいずれかで，
チャネル間では統一されている．
輝度のビット深度
輝度
255
グレイスケール画像, 濃淡画像
≠白黒画像
8-bit: 0～255 の整数(integer)
16-bit: 0～65535 の整数(integer)
32-bit: 浮動小数点数(float)
実数の近似値．±3.4*1038 の
範囲で7桁位の精度．
8 bits/pixel
0
28 ＝256 段階
位置(pixel)
原画像のビット深度はカメラによって異なり，8～16 bits/pixel が主．
12 bits/pixel (212 , 0～4095) や 14 bits/pixel (214 , 0～16383)の
カメラで得た画像は 16 bits/pixel の画像フォーマットとして扱う
(大は小を兼ねる)．
輝度には必ずノイズが混じるので，深度が大きい方が一概に
高性能というわけではない．
画像処理的には内部で 32-bit (float) を用いることも多い
(小数やマイナスの値が扱えるので) ．
画像情報の修正 (ビット深度，スケール情報)
ビット深度: Image - Type - …
スケール情報: Analyze - Set Scale…
この章のまとめ: デジタル画像の基本
まず解析対象をさまざまな「見方」で見よう．
表示上の"明るさ"をさまざまに設定し，必ず一度は「サチる」状態
までコントラストを上げる． Shift + c キー
ズーム機能によって，必ず「画素」の大きさが認識できる倍率まで
拡大する．
+ キーで拡大，- キーで縮小
回転(Image - Transform -...)，白黒反転(Image - Lookup Tables Invert LUT)，擬似色表示(Image - Lookup Tables - ...)も有効．
画像処理・画像解析の基本的概念を覚えておこう．
画素(pixel)，輝度(intensity)，ビット深度(bit depth)，
輝度ヒストグラム(intensity histogram)
実習
班ごとに指定した画像ファイルを用いて，以下について解析せよ．
Q1. 以下の表を埋めよ．
水平画素数
中央の画素の座標と輝度
垂直画素数
最小輝度
全画素数
最大輝度と，その画素の座標
ビット深度
平均輝度
※ 複数枚の画像(Z軸や時間軸がある画像)の場合， Image - Stack - Z Project… Max Intensity によって1枚の投影画像に変換してから解析すること．
Q2. ヒストグラムウインドウで Live ボタンを押した後(赤文字になる)，
画像に下記の処理(ガウスぼかしによるノイズ抑制)を行なった
場合に，ヒストグラムがどのように変化するかを述べよ．
処理: Process - Filter - Gaussian Blur… にて Preview を ON，
Sigma(Radius)の値を0，1，2，4，8，16，32と増やす．
注意: ヒストグラムウインドウでなく画像に対して処理すること．
カラー画像の基礎と画像合成
カラー画像の基礎
輝度 (179, 39, 4)
輝度 (5, 70, 134)
輝度 (111, 111, 13)
カラー画像 (RGB画像の場合) は
Red, Green, Blueの輝度のバランス
により色が表現される．
Image – Color – Split channels
Red
Green
Blue
画像合成
Image – Color – Merge channels…
画像合成の注意点
伝わるデザイン
http://tsutawarudesign.web.fc2.com/index.html
細胞工学 色覚の多様性と色覚バリアフリーなプレゼンテーション
http://www.nig.ac.jp/color/barrierfree/barrierfree3-4.html
画像合成の注意点
画像合成は
MagentaとGreenの
使用が推奨されることが
多い．
MagentaとGreenは
グレースケールで
示しても良い
形の解析: 二値化，粒子解析，繊維解析
手作業でのROI設定を介した形状解析： 長さ
t
Excel 等にペースト or
テキストファイルに保存して
R スクリプトで統計処理 等.
線分や曲線をマウスで引き， t キーで ROI Manager に登録，を繰返す．
ROI Manager の「Show All」をチェックしておくと見やすい．
Measure ボタンで登録済の ROI 全部をまとめて測定．
角度や長さ(画素単位)が得られる． Excel等でμmに変換し，統計処理．
ROI: region of interest，関心領域，注目領域
手作業でのROI設定を介した形状解析： 面積
or
t
測定項目は Analyze - Set Measurements... で決定．
「測定対象領域をマウスで指定し，
t キーで ROI Manager に登録」を繰返す．
Measure ボタンで測定．
二値化による領域抽出 ( Shift + t キー)
二値画像
(白黒画像)
グレイスケール画像
(濃淡画像)
or
蛍光像の場合，「高い輝度の領域」が「測定対象領域」の
場合が多い．閾値となる輝度を決め，二値画像(白黒画像)
に変換することで，領域抽出(領域分割， segment)ができる．
ではどのように閾値を決めればいいのか?
人間の目視による閾値決定
作業者の感覚が頼り．
同じ人が作業しても，
閾値が同じになるとは
限らない(部屋やモニタ
の明るさの影響など)．
自動閾値決定
Threshold ウインドウでは，
人間による閾値決定だけでなく
自動閾値決定もできる．
右図のように，
複数のアルゴリズムから選択する．
いずれも輝度ヒストグラムをもとに
「ある明るさ」を閾値として
背景と背景(解析対象)を分ける．
画像自体と解析対象に関する
輝度分布の性質によって，
適切なアルゴリズムは異なる．
二値化を介した粒子解析の例
二値画像
グレイスケール画像
Analyze Analyze Particles…
二値化を介した繊維構造の解析例
シロイヌナズナ気孔
アクチン繊維
共焦点画像
バンドパスフィルタ
による繊維等の強調
二値化像
気孔開閉の指標
短径 / 長径
長径
短径
灰色: 気孔領域
黒色: アクチン繊維
この場合，
短径 / 長径＝0.47
細線化像
アクチン繊維の配向の指標
気孔に対する
アクチン繊維の角度
qq
気孔
この場合，
アクチン繊維の角度＝54.3°
バンドパスフィルタ
輝度プロファイル(左図の黄色い線)
細胞表層微小管のプラス端
Process - FFT - Bandpass Filter...
注目している物を，おおよその大きさを指定することで
強調する処理．ノイズや細胞形状の影響を抑制する．
この章のまとめ: 形の解析
領域抽出 (segmentation，領域分割) の方法
* マウス等で測定部位を描いて ROI を設定する．
* 輝度を閾値として二値化する． Shift + t キー．
* 人間による閾値決定．
* 自動閾値決定．
粒子解析
(ノイズ除去等) → 領域抽出 → (ノイズ除去等) → 測定
繊維解析
濃淡画像→二値画像→細線画像の場合:
(ノイズ除去等) → 領域抽出 → … → 細線化 → … → 測定
濃淡画像→細線画像の場合:
(ノイズ除去等) → … → 細線化 → … → 測定
実習
Q3. 班ごとに指定した画像ファイルを ImageJ で読み込み，
適切な画像解析手法を用いて，以下の表を埋めよ．
ミトコンドリア
ゴルジ体
解析に用いた領域抽出手法
1個あたりの面積
細胞内密度
※ 輝度を閾値とした二値化手法を用いた場合，閾値を決めた方法と，閾値がいくつかも示せ．
※ 細胞内密度の単位は「1000 * 1000 pixel あたりの個数」とせよ．
※ 大きさの単位は「pixel」とせよ．
ヒント: 画像が背景領域を含む場合は，事前に解析領域を
矩形ROIで選択し，Shift + x で切り出すことができる．
実習
Q4. 指定した画像中のアクチン繊維の配向を解析せよ．
手順1. 最大輝度投影
Image - Stack - Z Project … - Max Intensity
BP1
手順2. 画像の複製 Shift + d キー
手順3. バンドパスフィルタ
BP2
Process - FFT - Bandpass Filter... - 右図
※ 赤く囲ったパラメタ(BP1，BP2)は強調する対象の
大きさの範囲．適切に設定せよ．
手順4. 二値化 (適切な手法を採用すること)
手順5. 細線化 Process - Binary - Skeletonize
手順6. 細線画像からの配向解析(画像全体からの測定)
Plugins - kbi - Kbi_LinesAngle - mode = eachSlice
※ theta: 平均角度，normAvgRad: 並列度，totalPair: 全長
手順7. 細線画像からの配向の可視化
Plugins - kbi - Kbi_LinesAngle - mode = map
※ 黄色い丸で囲ったパラメタは解析領域の大きさとステップ．
BP1
BP2
二値化法と閾値
平均角度
並列度
全長
手順3
手順6,7
動きの解析
スタック画像
時系列画像(動画像，動画，XYT)
や，焦点面を変えて撮影した連続
画像(立体画像，XYZ)はともに
スタック画像として操作できるが，
ZとTの区別が無いことに注意．
スタック画像を構成する2次元画像
をスライスとかフレームと呼ぶ．
タバコ培養細胞
微小管プラス端
表示中のスライスを変更
ステータスバーの z=2 は
「Z座標の値が2」を示す
(0から数えている． 0-origin) ．
画像情報欄の 3/10 は
「全10枚中3枚目」を示す
(1から数えている．1-origin)．
再生 (速度設定: Image - Stacks - Tools - Animation Options...)
動き解析のための輝度投影
Brightness & Contrast, Image - Type - 8-bit
Image - Stacks - Z Project - Max Intensity
最大輝度投影
Plugins - kbi - Kbi_StkFilter - maxHsvProject
輝度投影(疑似色)
time
動き解析のための粒子追跡
輝度投影
(疑似色)
平均速度:
(pixel/slice)
1スライス目
10スライス目
T－1
T: スライス数
動き解析のためのカイモグラフ
最大輝度投影
1スライス目
10スライス目
Plugins - kbi - Kbi_DynProf - kymoStatic
位置
p
t
時間
平均速度:
(pixel/slice)
オプティカルフロー
動き解析のためのオプティカルフロー法
Plugins - kbi - Kbi_Flow
シロイヌナズナ胚軸表皮 小胞体
CSU, EM-CCD, 50 ms * 100 frame
Plugins - kbi - Kbi_DynProf - kymoStatic
位置
時間
この章のまとめ: 動きの解析
スタック画像:
2次元画像のもつX，Y軸に加え，時間軸(T軸)をもつ3次元データ．
動きの可視化と計測:
* ムービーとして再生．
* 輝度投影．
* 粒子追跡．
* 手動．
* 自動．
* カイモグラフ．
* オプティカルフロー法．
実習
Q5. 指定した画像中に分布するミトコンドリアやゴルジ体について，
個々の時間平均速度を測定せよ．
その後，オルガネラ平均速度を測定せよ．
単位: pixel / frame
カイモグラフ法
1
2
3
4
5
6
7
8
平均
粒子追跡法 or
1
オプティカルフロー
2
3
4
5
6
7
8
平均
ミトコンドリア
ゴルジ体
ミトコンドリア
ゴルジ体
※ オプティカルフローを試したい班は声をかけて下さい．
まとめ
なぜ画像解析をするのか?
* 撮影した画像をどのように扱うか，という問題．
典型的な何枚かを原稿に貼り付け，legend を書いて終わり?
定量性，そして客観性．
同じ画像から，解析次第で様々な情報が引き出せる．
* 何のために可視化したり撮影するのか，という問題．
可視化，撮像，解析までトータルに考えて実験計画を立てる．
研究者のツールとしての画像解析，という段階へ．
もう少し詳しく学ぶには
省略したがバイオイメージングで重要な事項
* blur (ボケ) と PSF(点像分布関数, point-spread function)．
蛍光ビーズによるPSF測定．blur の影響と対策．
* ノイズ，とくにGaussノイズとショットノイズ．
撮像法との関係と，ノイズ抑制の手法．
* 背景 (background) 輝度の高さと分布の扱い．
参考になる本
田村秀行 (2002) コンピュータ画像処理
オーム社，ISBN-13: 978-4274132643
Burger W & Burge MJ (2007) Digital Image Processing:
An Algorithmic Introduction using Java
Springer, ISBN-13: 978-1846283796
※ ImageJ 本．バイオ指向．プラグインの作例が豊富．
参考になるサイト
英語なら ImageJ 公式サイトを起点に充実．翻訳??
謝辞
* Plant Organelles Database2 で公開されている画像を例として一部で
用いました．
Mano S et al. (2008) Nucleic Acids Res 36: D929-D937.
http://podb.nibb.ac.jp/Organellome/
* 小胞体流動の画像提供と KbiFlow 開発への協力を
下記グループからいただきました．
京都大 理学研究科
西村いくこ先生，嶋田知生先生，田村謙太郎先生，上田晴子先生
* 本発表に示した研究例の一部は，JSPS科研費 24770038 の助成を
受けたものです．
補遺: ImageJ の主なメニュー項目の紹介
File メニュー: ファイルの読み込み・書き込み等
New: 新規作成．
System Clipboard で他アプリから画像の
読み込みができる．
Open...: 画像ファイル等を開く．
Import: 各種フォーマットの
画像ファイル等を開く．
Close: 画像ウインドウを閉じる．
Save: 画像ウインドウの内容をファイルに
保存する．
※ Save しない限り，ファイルは書き
変わらない．
Quit: ImageJ を終了する．
Edit メニュー: 画像の切り貼り，描画
Undo: 直前の作業の取消し．
1ステップ限定かつ
一部のみ対応．
Cut, Copy, Paste:
画像の切り貼り．
対象は画像全域かROI ．
Copy to System:
他アプリへのコピー．
Clear, Fill, Draw: 単色描画．実際の色は
Color Pickerで色は設定．
Selection: ROI の制御．
(Selection = ROI)
Add To Manager:
複数のROI を管理．
Image メニュー: 種別，色，スタック，変形，複製等，色々
Type: 輝度タイプの変換．
8-bit, 16-bit, 32-bit, RGB color...
Adjust: 表示上の明るさの調整や二値化等．
Color: グレイスケール画像とカラー画像の
変換等．
Stacks: 時系列画像(動画像)，立体画像の
処理．輝度投影，スライス一覧(montage)
の作成等．
Crop: ROI 部分の切り出し．
Duplicate: 画像ウインドウの複製．
Rename: 画像ウインドウのタイトル変更．
Scale: 画像解像度の変更．つまり画像サイズ
の拡大・縮小．
※表示の拡大・縮小と混同しないよう注意．
Process メニュー: 基礎的な画像処理(フィルタ等)
Find Edges: 輪郭強調．
Binary: 2値画像(白黒画像)処理．
Math: 加減乗除等による
各画素の輝度変更．
Filters: ノイズ抑制等のフィルタ．
Image Calculator:
画像と画像の間
の演算．
加減乗除等．
Analyze メニュー: 測定やグラフ関係
Measure: ROI 部分の諸パラメタの測定．
Analyze Particles...: 粒子解析．
Set Measurements...: 'Measure' で測定する
パラメタの選択．
Set Scale...: 1画素が何 mm かを設定する．
Histogram: 輝度ヒストグラムの表示．
Plot Profile: 輝度プロファイルの表示．
他のメニュー
Plugins: プラグイン，マクロ，ショートカット
キー設定等．
Window: 画像ウインドウ，ログウインドウ等
の一覧や並び換え．
Help:ブラウザにウェブ上のマニュアルを
表示する等．
湖城 担当スライド
( 58 - 69 )
x = r ・ cos q
y = r ・ sin q
x = Sat ・ cos (Hue)
y = Sat ・ sin (Hue)
秋田 担当スライド
( 71 - 80 )
奈良先端科学技術大学院大学
植物グローバル教育プロジェクト
平成25年度ワークショップ
やってみようよ！画像、統計、ゲノム・トランスクリプトーム
解析ハンズオン実習
ImageJ によるバイオ画像解析チュートリアル
奈良先端科学技術大学院大学
植物グローバル教育プロジェクト
平成25年度ワークショップ
やってみようよ！画像、統計、ゲノム・トランスクリプトーム
解析ハンズオン実習
ImageJ によるバイオ画像解析チュートリアル
やってみて、いかがでしたか？
～ まず 「良いユーザー」 を目指しましょう ～
東京大・院・新領域 博士課程3年
秋田 佳恵
定量性
客観性
生物学・解析学の知識をもち、研究を行うのが望ましい
パソコンは苦手
独学は不安、質問できる相手がほしい
いわゆる”wet / dry”なら wet の方が好き
そのうち学びたいが、優先したい仕事がある
定量性
客観性
⇒ 受託 or 共同研究として画像解析を依頼
この 依頼 によって、研究は大きく変わります
解析の依頼①
何を言ってるかサッパリわからん
こういうプログラムで良いのかな…
プログラム①
知りたい情報が得られなかった
せっかく未発表データも見せたのに…
何を知りたいのかわからなかった
せっかく時間かけてプログラムしたのに…
解析の依頼②
それならあの解析法が使えるな！
プログラム②
定量的・客観的な研究になった！
あの解析法は俺の研究にも応用できるな！
では、 プログラム② を書いてもらうための
解析の依頼②
とは？
実例 1 教わりながら、自分で画像処理した
実例 2 目的を伝えて、画像処理を依頼した
（注） 未発表データのため、ダウンロード版では
該当部分（実例紹介）のスライドを削除しております。
また、一部のフォントを変更しました。
プログラマーが プログラム② を書きやすい依頼
ができる 「良いユーザー」 を目指しましょう
・ できる作業は自分で行う
・ 何のために測定したいのか明確に伝える
（研究目的・研究全体を把握している必要がある）
・ 結果の予想をたてておく
（生物学者の知識や、観察者の印象は重要）
・ 実画像を見せて相談できると良い
・ 現象を記述する方法の相談でも良い
（目的と方法が逆にならないよう注意）
・ ユーザーや修行中の人に相談するのも良い
ご静聴ありがとうございました
楽しい ImageJ 生活を！