Transcript Qui - Cannabis Terapeutica

Caratterizzazione fitochimica mediante tecniche analitiche
avanzate di Cannabis sativa L.
Candidato: Davide Maran
Relatore: Prof.ssa Stefania Benvenuti
Correlatore: Dott. Gianpaolo Grassi
Questo progetto di tesi sperimentale è iniziato con un tirocinio di 200 ore presso il Centro di
Ricerca CREA nella sede distaccata di Rovigo, che attualmente rappresenta il centro di eccellenza
per lo studio della Cannabis. Grazie all’accoglienza del Primo ricercatore Dott.Gianpaolo Grassi e
alla sua conoscenza sulla canapa maturata in oltre 20 anni di studi, ho potuto dedicarmi allo studio
analitico mediante tecniche gascromatografiche di oltre 180 accessioni di canapa, caratterizzate da
variabilità agrocolturali ed ambientali.
Successivamente le attività di ricerca sono continuate presso il laboratorio “Phyto and MORE”
del Dipartimento di Scienze della Vita dell'Università di Modena e Reggio Emilia, responsabile
Prof.ssa Stefania Benvenuti. Qui sono state svolte numerose indagini volte ad identificare,
quantificare, separare e isolare i principali cannabinoidi.
In particolare, gli obiettivi di questo progetto di tesi sono stati principalmente 3:
1) ANALISI QUALITATIVA
• Sviluppo e ottimizzazione di una metodica TLC per consentire in modo rapido la
separazione e l’identificazione dei principali fitocannabinoidi;
• Identificazione dei principali fitocannabinoidi nelle infiorescenze di Cannabis mediante
tecniche GC-FID, HPLC-UV/DAD, HPLC-ESI-MS e MS2;
2) ANALISI QUANTITATIVA
• Quantificazione dei principali fitocannabinoidi nelle infiorescenze di Cannabis mediante
tecniche GC-FID e HPLC-UV/DAD e comparazione dei risultati ottenuti;
3) ESTRAZIONE E ISOLAMENTO
• Applicazione di differenti tecniche di estrazione sul materiale vegetale di C. sativa L.;
• Isolamento dell'acido cannabidiolico e cannabidiolo dal materiale vegetale di C. sativa L. e
caratterizzazione NMR.
Nella tesi sono riportati cenni di carattere storico, botanico e legislativo della Cannabis.
Vengono descritte la composizione chimica, gli effetti biologici e le attività terapeutiche di questa
pianta, secondo quanto riportato dalla più recente letteratura scientifica. Vengono inoltre trattate le
principali metodologie estrattive e analitiche attualmente utilizzate nell'ambito della ricerca.
Finalità del lavoro è quindi la riscoperta, attraverso la selezione di varietà, il controllo analitico
e le tecniche di estrazione più efficaci, di alcuni principi attivi della canapa, magari meno famosi di
altri ad attività psicotropa, di notevole interesse fitoterapico e nutraceutico.
1) ANALISI QUALITATIVA
TLC
Dopo differenti test siamo riusciti a trovare un buon metodo per la visualizzazione dei
principali cannabinoidi all'interno della pianta di Cannabis sativa L.
A)
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI:
-400 mg di infiorescenze sbriciolate;
-Si eseguono 3 estrazioni con 20 ml etanolo
ciascuna; ad ogni estrazione segue una
sonicazione di 15 min a 40°C in bagno ad
ultrasuoni;
-Filtrazione con filtro a pieghe in pallone;
-Concentrazione al rotavapor a 40° e si porta a
volume in un matraccio da 10 ml.
Dopo aver deposto sulla TLC i campioni in esame, si fanno eluire in camera cromatografica con 10
ml di cloroformio e 1 goccia di acido acetico (30-33 minuti). Per la visualizzazione si immerge in
soluzione di ammonio molibdato e cerio solfato con conseguente riscaldamento.
CBD
CBG
CBDA
CBGA
Analisi TLC CAN15 delle varietà Carmagnola (deposizione 1 e 3, rispettivamente 10 e 20 µl) e Santhica (deposizione 2
e 4, rispettivamente 20 e 10 µl)
HPLC-UV/DAD
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
-Le infiorescenze sono state private di semi e
materiale legnoso, quindi sono state macinate con
mulino a martelli in modo da ottenere una
granulometria idonea al processo di estrazione (si
è prestata particolare attenzione a non
surriscaldare i campioni);
-Si pesano 250 mg di infiorescenze tramite
bilancia analitica e posizionamento in beuta;
-Si eseguono due estrazioni da 10 ml di metanolo
e una da 5 ml (volume totale 25 ml); ad ogni
estrazione segue una sonicazione di 15 min a
40°C in bagno ad ultrasuoni;
-Si filtra con filtro di carta a pieghe e si porta a
volume con metanolo in un matraccio tarato;
-Si esegue una seconda filtrazione per mezzo di
membrane di acetato di cellulosa, quindi si ripone
in vial ambrati per HPLC.
Dopo aver testato differenti colonne
cromatografiche la miglior colonna per separare i cannabinoidi è risultata essere la Ascentis®
Express Express C18 [(15 cm x 3 mm, 2.7 μm, Supelco Analytical (USA)]. Si ottiene una
risoluzione soddisfacente, è la più sensibile e selettiva nei confronti di questi analiti, i picchi
risultano separati fino a “base line”, con buona simmetria e l’analisi puo essere condotta in tempi
relativamente brevi con durata massima di 40 minuti. Il post run è stato impostato a 15 min.
Gradiente ottimale
Fasi mobili
Tempo
H2O (0,1% HCOOH)
ACN (0,1% HCOOH)
0'
40%
60%
13'
40%
60%
17'
20%
80%
22'
10%
90%
Condizioni cromatografiche.
Allo scopo di determinare la natura dei componenti presenti nel campione Santhica, è stata
effettuata l’analisi HPLC-UV/DAD. I n base ai dati riportati in letteratura, i quattro picchi più
abbondanti appartengono alla classe dei cannabinoidi: cannabigerolo e cannabidiolo hanno un
massimo di assorbimento a 210 nm, mentre acido cannabigerolico e acido cannabidiolico
possiedono un massimo di assorbimento intorno ai 220 nm (Peschel and Politi, 2015).
Cannabigerolo e cannabidiolo hanno mostrato spettri di assorbimento molto simili, quindi sono
stati discriminati in base ai loro differenti tempi di ritenzione. Inoltre, per un’ulteriore conferma,
sono state eseguite analisi HPLC-ESI-MS e MS2 grazie alle quali sono stati confermati in base ai
pesi molecolari delle due sostanze.
Fig. 74. Spettri di assorbimento associati ai picchi dell'analisi HPLC-UV/DAD
1: CBDA; 2: CBGA; 3: CBG; 4: CBD
HPLC-ESI-MS E MS2
I dati cromatografici, come i tempi di ritenzione e gli spettri UV, da soli non possono fornire
sufficienti informazioni per la corretta identificazione dei costituenti di matrici complesse. Per
questo motivo, sono state condotte analisi HPLC-ESI-MS in trappola ionica, in modalità full-scan
per individuare lo ione quasi-molecolare. Sono stati inoltre eseguiti esperimenti MS 2 per studiare la
frammentazione dei composti. Le analisi MS e MS2 sono state eseguite in modalità positiva e in
modalità negativa, in quanto in entrambe le modalità i composti di interesse ionizzano in modo
soddisfacente, fornendo maggiori informazioni sulla loro corretta identificazione. Tramite la
letteratura presente, (Aizpurua-Olaizola et al., 2014) è stato possibile identificare in modo affidabile
quattro componenti principali nell’estratto di Cannabis sativa L..
È stato utilizzato un sistema Agilent Technologies modular model 1200, costituito da un
degasatore sotto vuoto, una pompa binaria, un autocampionatore, accoppiato ad uno spettrometro di
massa a trappola ionica 6310A (IT) con una sorgente ESI, seguendo le stesse condizioni
cromatografiche HPLC. Le molecole allo stato gassoso, impattando con gli elettroni, hanno dato
luogo a delle specie radical-anioniche. Gli ioni così formati, a causa dell’eccesso di energia fornita,
hanno frammentato in una serie di molecole, le quali sono state separate in base al rapporto m/z, da
un analizzatore a trappola ionica. I risultati ottenuti sono descritti nelle figure seguenti.
Analisi HPLC-ESI-MS di un estratto metanolico del campione Santhica. L’asse y rappresenta l’intensità del segnale,
l’asse x rappresenta il tempo (min) e l’asse z il rapporto massa/carica. In nero (t=25,92) acido cannabidiolico, in rosso
(t=25,95) acido cannabigerolico, in blu (t=26,22) cannabigerolo, in viola (t=26,42) cannabidiolo e in verde “Base peak
chromatogram”.
Extracted Ion Chromatograms in modalità positiva a valori di m/z 315.3, ione pseudo-molecolare di cannabidiolo.
Extracted Ion Chromatograms in modalità positiva a valori di m/z 317.3, ione pseudo-molecolare di cannabigerolo.
Extracted Ion Chromatograms in modalità positiva a valori di m/z 361.3, ione pseudo-molecolare di acido
cannabigerolico.
Extracted Ion Chromatograms in modalità positiva a valori di m/z 359.3, ione pseudo-molecolare di acido
cannabidiolico.
I risultati ottenuti hanno confermato i dati riportati in letteratura e i problemi legati alla
decarbossilazione degli acidi nell’analisi in HPLC-ESI-MS (Aizpurua-Olaizola et al., 2014).
2) ANALISI QUANTITATIVA
ANALISI GC-FID
Per la preparazione dei campioni è stato utilizzato come solvente etanolo con 0,01% Prazepam
come standard interno e 0,01% squalene come riferimento.
Le analisi sono state condotte tramite un apparato SHIMADZU GC-2010 PLUS, dotato di
rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID-2010 PLUS) su colonna capillare Rxi-5ms (30m x 0,25
mm I.D. x 0,25 µm) fornita da RESTEK. Le condizioni operative adottate sono le seguenti:
• Flusso di aria 400 ml min-1, flusso di idrogeno 30 ml min-1, flusso di azoto 40 ml min-1
• FID miscela aria/idrogeno in rapporto 10:1
• Iniezione di 1 μl mediante uno Split con rapporto di splittaggio 1/25 ml min-1
• Temperature: colonna 240°C, iniettore 280°C; rilevatore 300°C.
Sono state condotte un totale di 183 analisi che hanno permesso la quantificazione dei principali
cannabinoidi: CBDV, THCV, CBD, THC, CBG, CBN.
Vista l'enorme quantità di analisi, di seguito vengono riportati solo alcuni gas-cromatogrammi di
particolari varietà:
Cannabis con alto contenuto di THCA. THC rilevato intorno al 21%;
Cannabis con prevalente contenuto di THCV.
ANALISI HPLC-UV/DAD
La linearità del metodo analitico e i valori di LOD e LOQ sono stati determinati direttamente
dalle curve di calibrazione di cannabigerolo, cannabidiolo, acido cannabigerolico e acido
cannabidiolico. Di seguito i cromatogrammi di due varietà.
Cromatogramma HPLC del campione Santhica.
Cromatogramma HPLC del campione Carmagnola.
CONFRONTO GC-FID E HPLC-DAD
Sono stati scelti 7 campioni per eseguire un confronto tra le metodiche analitiche utilizzate.
RISULTATI GC
CBD mg/g
2,8
175,6
55,9
4,4
7,7
23,4
0,2
Campioni
Santhica
2077
Carmagnola
Carmaleonte
Codimono
Eletta campana
Ermo
CBG mg/g
16,1
5,1
2,7
0,5
0,1
0,9
0
THC mg/g
0,2
7
2,1
0,3
0,3
1,3
0,4
RISULTATI HPLC-UV/DAD
campione
Santhica
2077
Carmagnola
Carmaleonte
Codimono
Eletta
campana
Ermo
SD
SD
SD
SD
CBDA mg/g
1,36
CBGA mg/g
12,17
CBD mg/g
3,82
CBG mg/g
7,25
0,09
0,9
0,25
0,27
127,7
<LOQ
25,4
<LOQ
1,06
35,74
1,82
24,5
1,96
0,24
0,03
0,36
0,1
3,79
<LOQ
2,86
<LOQ
0,1
7,27
SD
SD
SD
0,17
0,13
<LOQ
0,05
4,2
<LOQ
0,07
20,22
0,9
0,18
0,27
0,63
0,02
0,1
0,02
0,25
0,17
0,1
0,05
0,09
0,02
0,05
0,06
Grazie ai risultati ottenuti, è stato possibile delineare un profilo fitochimico delle diverse
varietà di Cannabis sativa L.
Possiamo concludere che nell'analisi gas cromatografica non vengono visualizzati i
cannabinoidi acidi. In linea di massima, le quantità dei cannabinoidi neutri corrispondono alla
sommatoria dei cannabinoidi neutri ed acidi rilevati in HPLC. Visto che la gas cromatografia si basa
sul riscaldamento del campione ad elevate temperature, i cannabinoidi acidi si trasformano nei loro
corrispettivi neutri. Come già descritto, i cannabinoidi neutri sono degli artefatti di estrazione;
derivano dalla decarbossilazione degli acidi dovuta al trattamento durante i processi di raccolta;
all'esposizione alla luce; alle alte temperature; al pH. Resta comunque da valutare il valore più
basso riscontrato in GC rispetto all'HPLC. Tali discordanze possono dipendere da diversi fattori:
dalla stagionatura della droga, dai metodi di estrazione, da tutte le variabili strumentali: nel GC
avviene la decarbossilazione a differenza dell'HPLC e una parte dei cannabinoidi viene degradata;
nelle analisi GC è stato valutato il contenuto di cannabinoidi grazie allo standard interno, nell'HPLC
tramite le curve di taratura con lo standard.
3) SEPARAZIONE ED ISOLAMENTO
SCELTA DEL METODO ESTRATTIVO
Sono stati sperimentati diversi metodi di estrazione per la C.sativa ai fini di ottenere un estratto
con il più alto contenuto di cannabinoidi possibile. I risultati delle prove effettuate sono stati i
seguenti:
n° Metodo estrattivo
Resa% Cannabinoidi estratti
1
Estrazione con agitatore
magnetico
5,67
Buon contenuto di cannabinoidi neutri, scarsi gli
acidi
2
Soxtec
6,52
Numerosi cannabinoidi sia neutri che acidi
3
Bagno ad ultrasuoni in acetone
5,84
Alto contenuto di cannabinoidi acidi
4
Bagno ad ultrasuoni in metanolo
7,20
Alto contenuto di cannabinoidi acidi
5
Soxhlet
7,73
Numerosi cannabinoidi, principalmente neutri
Alla luce dei dati ottenuti dalle prove estrattive, si è optato per l’utilizzo della metodica 5 per
isolare il CBD, e della metodica 4 per estrarre il CBDA.
Tramite la cromatografia liquida preparativa su colonna è stato possibile quindi isolare i due
fitocannabinoidi CBD e CBDA rispettivamente dalle varietà Carmagnola e Codimono. Per
aumentare la purezza del CBDA è stato necessario suddividere l’isolamento in due step di
separazione, più precisamente in due colonne, una successiva all’altra.
La colonna è stata impaccata ad umido utilizzando gel di silice, ed è stata scelta, come fase
mobile, il cloroformio. In testa alla colonna è stato caricato l'estratto ottenuto solubilizzato in pochi
ml di cloroformio. Per favorire l’eluizione della colonna si è utilizzato azoto. Durante la procedura
si è passati a un gradiente cloroformio-metanolo fino ad arrivare a una fase mobile al 100% in
metanolo.
A sinistra: separazione dei componenti principali tramite
cromatografia su colonna; a destra il riassunto su TLC delle
frazioni principali: in alto la visualizzazione sotto luce UV a
365 nm. In basso le frazioni derivatizzate con reattivo ammonio
molibdato e cerio solfato.
Cromatogramma e 3D plot della provetta 35 – C1 (99.6 % di purezza; resa del 1,10% rispetto all'estratto di partenza)
Cromatogramma e 3D plot della frazione C3 F7 bis (92,5% di purezza; resa del 1,25% rispetto all'estratto di partenza)
La frazioni ottenute sono state caratterizzate mediante spettroscopia a risonanza magnetica nucleare
(NMR) per confermare la presenza di CBDA e CBD; i dati ottenuti sono stati confrontati con quelli
presenti in letteratura (Choi et al., 2004). Sono stati eseguiti sia esperimenti 1H-NMR sia 13C-NMR.
CBDA
CBGA
CBD
CBG
Aizpurua-Olaizola, O., Omar, J., Navarro, P., Olivares, M., Etxebarria, N., Usobiaga, A., 2014.
Identification and quantification of cannabinoids in Cannabis sativa L. plants by high
performance liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 406, 7549–
7560. doi:10.1007/s00216-014-8177-x
Choi, Y.H., Hazekamp, A., Peltenburg-Looman, A.M., Frédérich, M., Erkelens, C., Lefeber, A.W.,
Verpoorte, R., 2004. NMR assignments of the major cannabinoids and cannabiflavonoids
isolated from flowers of Cannabis sativa. Phytochem. Anal. 15, 345–354.
Peschel, W., Politi, M., 2015. 1H NMR and HPLC/DAD for Cannabis sativa L. chemotype
di st incti on, extract profi ling and s peci fi cati on. Tala nta 140, 150–165.
doi:10.1016/j.talanta.2015.02.040