Transcript Bekijk online - Universiteit Gent
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2015-2016
KWANTIFICERING VAN COLLAGEEN CROSS-LINKS IN URINE ALS MOGELIJKE METHODE VOOR HET ONTDEKKEN VAN AFWIJKEND COLLAGEEN METABOLIMSE BIJ HET FRIESE PAARD
Door Liesbeth HAEGEMAN Promotoren: Prof. Dr. Richard Ducatelle Drs. Veronique Saey Literatuurstudie in het kader van de Masterproef
VOORWOORD
Graag zou ik mijn promotor Prof. Dr. Richard Ducatelle en copromotor Drs. Veronique Saey willen bedanken voor de mogelijkheid om mee te werken aan dit enorm interessante onderwerp. Ook zou ik Drs. Veronique Saey speciaal willen bedanken voor de vlotte communicatie en de goede begeleiding bij het schrijven van mijn masterproef.
INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING
Gezien de zeer hoge inteeltgraad binnen het Fries paarden ras, lijdt dit ras onder een frequenter voorkomen van bepaalde aandoeningen, waaronder aorta ruptuur, dwerggroei, waterhoofd, retentie van de placenta en megaoesophagus. De ver doorgedreven selectie op de typische uiterlijke kenmerken en de typische ‘elastische’ gang heeft mogelijks geleid tot het ontstaan van bindweefsel aandoeningen binnen dit ras. Meerdere recente onderzoeken wijzen in de richting van een mogelijks systemische collageen aandoening bij de friezen. Een mogelijke afwijking in het aantal of type collageen cross-links zouden gepaard kunnen gaan met verlies van weefsel sterkte en zou de laxiteit van de pezen en afwijkingen ter hoogte van de aorta en slokdarm kunnen verklaren. Om dit te kunnen aantonen zou het nuttig kunnen zijn het aantal pyridinium cross-links hydroxypryridinoline (=HP=PYD) en pyridinoline (=LP=DPD) te bepalen in de urine van warmbloeden en Friese paarden.
Dit zijn cross-links in collageen die na afbraak van collageen vrijkomen in het bloed en via de urine uitgescheiden worden. Men verwacht dat er bij het Friese paard een mogelijks hogere afbraak en dus ook urinaire uitscheiding aanwezig is. De crosslinks kunnen worden gemeten aan de hand van LC-MS/MS. De urinaire concentratie van de pyridinium cross-links bij Friese paarden zou dan kunnen worden vergeleken met deze bij warmbloeden. 1
INLEIDING
De precieze oorzaak van meerdere van deze erfelijke aandoeningen binnen het Friese paardenras is nog niet gekend. Trek-rek testen konden geen significante verschillen aantonen tussen aangetaste, niet aangetaste Friezen en warmbloeden wat betreft de biomechanische eigenschappen. (Saey et al, 2015). Ook wat betreft het elastine en collageen percentage werd geen significant verschil teruggevonden (referentie pas hierna plaatsen). Ploeg et al. (unpublished results) konden wel aantonen dat pezen van Friezen een verhoogde pyrrole crossink concentratie bevatten, hetgeen de verschillende biomechanische karakteristieken van de pezen van Friese paarden zou kunnen verklaren in vergelijking met warmbloeden (Gussekloo et al, 2011). Vermoedelijk zou een probleem in de cross-linking van het collageen aan de basis van meerdere problemen binnen het ras kunnen liggen. Collageen cross-links spelen een rol in de mechanische sterkte van het collageen. Door een defect in de cross-linking zouden Friezen mogelijks gepredisponeerd zijn voor een aantal erfelijke aandoeningen. Mogelijks is er een verhoogde turnover met een verhoogde urinaire excretie van de crosslinks. Een studie naar de urinaire excretie van hydroxylysylpyridinoline en lysylpyridinoline bij warmbloeden en Friese paarden met vergelijking zou dit kunnen aantonen. Deze literatuurstudie geeft een overzicht over de verschillende frequent voorkomende aandoeningen binnen het Friese paardenras, met nadruk op de aortaruptuur. Ook het nut van onderzoek naar de collageen cross-links binnen deze problematiek wordt aangehaald. Tot slot worden de bestaande onderzoeksmethoden van cross-links in de urine weergegeven. 2
DE HISTORIE VAN HET FRIESE PAARD
Het Friese paard is het oudste en enigste inlandse paardenras van Nederland. Het is een Barok paard dat reeds bekend is sinds de 13 de eeuw. De historie van het Friese paard gaat dus zeer ver terug. Tijdens de middeleeuwen werd de Fries gekruist met de Spaanse Andalusiër met als doel het paard fijner, eleganter en sneller te maken. Het werd in die periode frequent ingezet tijdens de krijgstochten. Tijdens de 17 de eeuw was de Fries populair onder de rijkere boeren en de adel. Het paard werd daar voornamelijk gebruikt als pronkdier, voor het trekken van de koets en af en toe ook voor het lichtere werk op de boerderijen. In de 19 de eeuw was de Fries een uiting van welstand. In die periode waren de draverijen erg in trek. Het Friese paard werd gebruikt als vermaak in de vorm van kortebaan-draverijen onder het zadel. Er werd geprobeerd het ras in te kruisen met lichtere paarden om zo een snellere draf te verkrijgen. Het paard werd hierbij ingezet in de Russische Orlov-fokkerij en in de fokkerij van de Amerikaanse draver. De invloed van het Friese paard is soms nog terug te zien bij deze dravers. Aan het einde van de 19 de eeuw en begin van de 20 e eeuw kwam het ras meer en meer in moeilijkheden. De boeren waren niet rijk genoeg meer om de friezen alleen voor het vermaak aan te houden en het Friese paard was niet sterk genoeg voor het zware werk op het land. Hierdoor schakelden de boeren over naar de aankoop van zwaardere rassen of werd de Fries gekruist met deze rassen. Het postuur van de Fries werd zwaarder en kleiner. Door de industrialisering nam de interesse in het Friese paard verder af. De Fries verloor sterk aan populariteit en stierf bijna uit. In 1879 werd het Koninklijk Friesch paardenstamboek (KFPS) opgericht. In 1913 waren er nog slechts drie goedgekeurde Friese denkhengsten beschikbaar. Door een actief aankoop en fokbeleid werd het ras van de ondergang behoed. 1 De populatie Friezen werd dus gesticht met een zeer beperkt aanbod hengsten. Er was een zeer kritische periode tussen 1900 en 1910 waarbij er een jaarlijkse registratie was van slechts gemiddeld 16 veulens. Na het jaar 1936 groeide de populatie snel uit, met 400 registraties in 1976 en 1000 in 1986.
2 In het jaar 2012 waren er meer dan 60000 paarden geregistreerd bij het KFPS en dit in meer dan 50 landen. Hoewel de huidige populatie uit 100 dekhengsten en 800 fokmerries bestaat is de volledige populatie Friezen ontstaan uit een beperkt aantal stichters. De Friese populatie wordt hierdoor gekenmerkt door een zeer hoge inteeltgraad en een lage genetisch variatie.
3 Door deze opvallend hoge inteelt vertonen de Friezen onderling een sterk verwantschap. Dit komt duidelijk tot uiting in meerdere genetische afwijkingen binnen dit ras zoals de aortaruptuur, dwerggroei, laxiteit van de pezen, retentio secundinarum en hydrocephalus die een opvallend hoge frequentie kennen in vergelijking met andere rassen. 3
1. AORTA RUPTUUR EN AORTICO-PULMONALE FISTULATIE
Aorta rupturen zijn bij zoogdieren zeer zeldzaam. Bij de mens echter is het een levensbedreigende aandoening die van multifactoriële aard is. Predisponerende factoren zijn inflammatie en genetische aanleg. Bij de mens, scheur is voornamelijk gelokaliseerd ter hoogte van de aorta abdominalis en is vaak geassocieerd met atherosclerose 3 . In een klein deel gevallen is er een scheur ter hoogte van de thoracale aorta (23%) 4 . Bij niet-Friese paarden komt de aandoening ook zelden voor en is deze vermoedelijk erfelijk 5 . De scheur bevindt zich in de meeste gevallen aan de basis van het hart, ter hoogte van de sinussen van Valsalva 6 . Bij het niet-Friese paard treedt de aorta ruptuur vooral op bij dekhengsten na het dekken of soms ook na zware arbeid 7 . Bij deze paarden leidt dit doorgaans tot acute sterfte.
8 De etiologie hiervan is nog niet goed gekend. Bij het Friese paard zien we echter een ander patroon. De aandoening komt relatief frequent voor, namelijk bij 2% van de populatie 4 . De ruptuur is typisch gelokaliseerd ter hoogte van de thoracale aorta. Het is een dwarse ruptuur die zich juist proximaal (1-2 cm) van het litteken van de voormalige ductus arteriosus van Botalli bevindt.
9 (figuur1) De reden waarom de aortaruptuur bij friezen zich specifiek op deze plaats bevindt is nog niet goed gekend. Gezien de hoge inteeltgraad en de consistente locatie van de ruptuur, wordt er aangenomen dat deze aandoening erfelijk is bij de Fries.
Figuur 1: ruptuur in de aorta bij een Fries paard. Foto: Koen Chiers.
Bij het Friese ras kunnen drie klinische vormen onderscheiden worden: de acute, de subacute en de chronische vorm. Bij de acute vorm zien we dat de paarden plots sterven en dit gebeurt meestal tijdens activiteit. Hierbij vertonen de paarden geen voorafgaande symptomen. Bij de subacute vorm leidt de scheur tot acute bloeding met vorming van een hemopericard met tekenen van acuut hartfalen waarna de dood snel intreedt. Uniek bij het Friese paard is de chronische vorm. Hierbij blijven de paarden nog weken tot zelfs maanden na de scheur overleven. De chronische vorm vertegenwoordigt 4
een groot deel van de gevallen van aortarupturen. In een onderzoek van ploeg et al. (2012) werd de anamnese van 24 Friezen met aorta ruptuur onderzocht. Hieruit is gebleken dat meer dan 1/3 van de gevallen typische symptomen vertoonden ongeveer één tot twee weken tot zelf maanden voor het hartfalen en sterfte. Deze symptomen bestaan voornamelijk uit koliek zonder abnormale rectale bevindingen, anorexie, herhaaldelijk lateraal liggen, hoesten als gevolg van pulmonair oedeem, daling van het prestatie vermogen, depressie en af en toe epistaxis.
7 Na autopsie werden bij deze paarden typisch para-aorticale bloedingen en aortopulmonaire fistels teruggevonden.
9 bij aortopulmonale fistel is naast de thoracale aorta ook de truncus pulmonalis gescheurd. De beide bloedvaten staan met mekaar in verbinding door middel van een pseudoaneurysme dat typisch gevormd wordt. Door de hoge druk in de aorta wordt het bloed uit de aorta in de truncus pulmonalis geduwd. Dit leidt tot een links-recht shunt. Deze situatie kan dus gedurende enige tijd stabiel blijven doordat de paarden niet meteen intrathoracaal verbloeden waarschijnlijk doordat de tunica adventitia van da aorta de bloeding gedeeltelijk tegenhoudt, maar zal uiteindelijk steeds leiden tot ernstig hartfalen met sterfte. Dit verklaart waarom deze paarden niet acuut sterven na de aortaruptuur.
7
2. ANDERE AANDOENINGEN BINNE HET FRIESE RAS
Bepaalde aandoening komen opvallend frequent voor bij het Friese ras. Doordat de populatie Friezen ontstaan is uit een beperkt aantal stichters wordt de populatie gekenmerkt door een lage genetische variabiliteit. Alle Friezen zijn steeds op één of andere manier genetisch verwant met elkaar.
2 Dit zou kunnen verklaren waarom bepaalde aandoeningen zo talrijk zijn binnen het Friese ras in vergelijking met warmbloeden.
2.1. OESOPHAGUS DYSFUNCTIE
Megaoesophagus is een aandoening die net zoals de aorta ruptuur een duidelijk frequenter voorkomen heeft bij het Friese paard dan bij andere paardenrassen. De aandoening bestaat uit een chronische dilatatie van de slokdarm. Deze dilatatie kan veroorzaakt worden door een dysfunctie van de oesophagus of door een mechanische obstructie. Bij warmbloedpaarden wordt de megaoesophagus voornamelijk gezien na een langdurige obstructie. Hierbij zien we een dilatatie net craniaal van de obstructie.
10 Bij het Friese paard is de obstructie van de slokdarm eerder een gevolg van de dilatatie dan een oorzaak. Klinische symptomen bij aangetaste paarden bestaan uit recidiverende slokdarm obstructie, hoesten, bilaterale neusvloei, ptyalisme, dysfagie, regurgitatie, zwelling van de slokdarm, anorexie en lethargie.
11 Een studie van Ploeg et al. uit 2014 toonde aan dat niet alle Friese paarden die een klinische dysfunctie van de oesophagus vertoonden, ook een macroscopische megaoesophagus hadden. Deze paarden waren tussen de 14 dagen en 1 jaar oud. Bij alle klinische gevallen werd er wel een verhoogde collageen afzetting gevonden rond de spiervezels van de tunica muscularis en in de lamina propria, en dit op plaatsen gelokaliseerd caudaal en craniaal van de dilatatie. Het collageen bij deze paarden was ook morfologisch afwijkend: het was minder gecondenseerd dan bij niet 5
aangetaste paarden en de vezels waren kleiner en georganiseerd in klompen.
12 Deze afwijkingen werden ook gevonden bij veulens, waardoor er vermoed wordt dat de aandoening een genetische basis heeft. Doordat de meeste jonge paarden nog geen macroscopische afwijkingen vertonen maar wel reeds afwijkend collageen hebben zou de afwijking traag progressief zijn en mogelijks veroorzaakt worden door een genetische afwijking in het collageen.
12
2.2. HYDROCEPHALUS
Hydrocephalus is een zeldzame congenitale aandoening die gezien wordt bij verschillende diersoorten zoals de muis, de rat, de hond en het paard, en ook bij de mens. De prevalentie wordt geschat op 0.06%.
13 Bij de Fries echter zien we een hoger voorkomen dan bij andere paardenrassen en diersoorten. Vermoedelijk is deze hoge prevalentie te wijten aan de hoge inteeltgraad bij het Friese ras. Hydrocephalus wordt gekenmerkt door een uitzetting van de ventrikels in de hersenen, waarbij ook de arachnoidale ruimte betrokken kan zijn. Deze uitzetting kan veroorzaakt worden door een obstructie van de afvoer van het cerebrospinaalvocht, een verhoogde productie door de choroidale plexus of door een gewijzigde absorptie ter hoogte van de arachnoidale villi in de veneuze sinussen van de hersenen. Bij de Fries lijkt de oorzaak te liggen bij een stenose van het foramen jugulare aan de basis van de schedel, en is waarschijnlijk veroorzaakt door een genetische mutatie. Dit defect in het foramen jugulare is gelinkt aan chondrodysplasie en werd ook reeds gezien bij Friese veulens met dwerggroei. Een gelijkaardige pathogenese werd gezien bij een hondenpopulatie met een beperkte genetische pool.
13
2.3. DWERGGROEI
Dwerggroei is een aandoening die amper gezien wordt bij paarden. Het is enkel beschreven bij miniatuur paarden, maar is sinds meerdere jaren ook gekend binnen het Friese paardenras. (Backt et al. 2008) Ook deze aandoening zou het gevolg zijn van de hoge graad van inteelt en is erfelijk. Dwerggroei wordt gekenmerkt door een groeiachterstand van de groeiplaten. Bij aangetaste veulens zijn de voor- en achterbenen 25% korter dan normale dieren en hebben 50% minder lichaamsgewicht. De aandoening tast ook de ribben aan. Na de geboorte groeien deze dieren trager dan normaal. De groei is disproportioneel: het hoofd en de rug groeien sneller dan de ledematen en de ribben. Dit leidt tot een relatief gezien abnormaal groot hoofd, een te lange rug en een bredere borstkast met een versmalling ter hoogt van de costochondrale junctie. Doordat de ledematen relatief gezien te kort zijn tegenover de pezen zien we een hypertensie van de kogels. De aandoening wordt veroorzaakt door een metaplasie van de metafyse in de groeiplaat ter hoogte van de distale metacarpus en metatarsus.
14 6
2.4. LAXITEIT VAN DE PEZEN
Onderzoek W.S.Gussekloo et al. (2011) toonde aan dat de pezen van Friese paarden significant langer waren i n vergelijking met andere rassen (pony’s). Hierdoor wordt een lichte hyperflexie van de kogel veroorzaakt. De pezen bij Friese paarden zijn ook meer elastisch en gaan verder uitrekken bij rektesten. Dit defect is algemeen aanwezig in de Friese populatie maar is meer uitgesproken bij Friezen met dwerggroei.
15 Door de grotere laxiteit en de hyperextensie van de kogel is het Friese paard gevoeliger aan peesblessures en dit voornamelijk in het ligamentum palmare en ter hoogte van de oppervlakkige buiger. De sterkte en laxiteit van pezen wordt bepaald door de oriëntatie van de collageen vezels en door de mate van crosslinking.
16 Vooral de pyrrole crosslinks hebben een grote invloed op de sterkte van collageen, alhoewel deze in veel lagere concentratie aanwezig zijn dan de pyridinium crosslinks hydroxypyridinoline (HP) en pyridinoline (LP). Dit kan verklaard worden doordat pyrrole drie fibrillen kan crosslinken, en hydroxypyridinoline en pyridinoline maar in staat zijn om twee fibrillen te cross-linken. Bij de fries wordt een verhoogde pyrrole concentratie terug gevonden ter hoogte van de pezen.
17 Dit staat in contrast met de hogere flexibiliteit van de pezen. Vermoedelijk zou een defect in de oriëntatie van de pyrrole crosslinks aanwezig zijn waardoor de mechanische sterkte ervan zou afnemen.
2.5. RETENTIO SECUNDINARUM
De partus van de merrie bestaat uit drie fasen: in eerste fase gaat de activiteit van het myometrium toenemen, daarna zal de vrucht uitgedreven worden en tot slot worden de foetale membranen uitgescheiden. Retentio secundinarum, ook wel het ophouden van de placenta genoemd, wordt gedefinieerd als het niet uitscheiden van de foetale membranen (placenta) binnen de drie uur na de geboorte van het veulen.
18 Deze aandoening is goed gekend in de paardenwereld (2-10%), maar heeft een uitzonderlijk hoog voorkomen bij de Fries (35%).
19 De uitscheiding van de placenta zou in gang gezet worden door het afscheuren van de navelstreng waardoor er een collaps ontstaat van de foetale placenta met inkrimping van de chorionale villi. De uterine contracties na de partus, die van de top van de baarmoederhoorn richting de cervix lopen, zorgen voor een verkleining van de baarmoeder en een daling van het bloedvolume in de baarmoeder. Dit zorgt voor een loslating van de placenta. De allantochorion inverteert en wordt naar buiten geduwd. Een verstoring van dit mechanisme zou kunnen leiden tot placenta retentie, maar de precieze etiologie van deze aandoening is nog niet gekend.
18 7
3. COLLAGEEN
3.1. BETEKENIS EN TYPES
Collageen is het meest voorkomende proteïne bij zoogdieren. Het zorgt voor stabiliteit, sterkte en stevigheid van verschillende weefsels gaande van pezen en ligamenten tot huid, cornea, bloedvaten, kraakbeen bot en dentine. Het is terug te vinden in elk bindweefsel.
21 Reeds 28 types collageen werden terug gevonden bij de vertebraten. Het collageen kan opgedeeld worden in fibrillair en non-fibrillair collageen. Binnen het fibrillair collageen kunnen verschillende types onderscheiden worden. Collageen type 1 is het meest voorkomende proteïne. Het bevindt zich in nagenoeg elk extracellulair weefsel met een mechanische functie. In pezen en ligamenten draagt dit collageen de kracht over van de spier op het bot, en slaat elastische energie op. Collageen type 1 is ook aanwezig in de meeste organische matrices van bot en dentine. Het is voornamelijk dit type collageen dat deze weefsels zo stevig maakt. Het is ook aanwezig in de huid en bloedvaten, en bevindt zich als matrix rond de contractiele spiervezels in de spier. Collageen type 2 is zeer weefselspecifiek en bevindt zich voornamelijk in het gewrichtskraakbeen. De collageentypes hebben elk een licht verschillende structuur. Collageen type 2 bestaat uit dikkere collageenvezels dan type 1.
20 Collageen type 3 bevindt zich in relatief elastische weefsels zoals de embryonale huid, de long en bloedvaten. Het type 5 collageen wordt in kleine hoeveelheden terug gevonden in associatie met collageen type 1, en dit voornamelijk ter hoogte van de cornea. Tot slot is het collageen type 9 terug gevonden in associatie met type 2 in kraakbeen.
22 De fibrillaire collageen molecule bestaat steeds uit drie alfa-ketens. Deze drie ketens kunnen ofwel uit drie dezelfde ketens bestaan (homotrimerisch) zoals in type 2 en 3 collageen, of ze kunnen uit drie verschillende ketens bestaan (heterotrimerisch). Het non-fibrillair collageen wordt ook opgedeeld in verschillende subtypes en komt vooral voor in de basaalmembranen, ter hoogte van verschillende weefsels, of in associatie met andere types.
21
3.2. OPBOUW EN SYNTHESE
Collageen wordt gekenmerkt door een typische hiërarchische structuur. Op het kleinste niveau bestaat het uit drie linksdraaiende polypetide ketens die gevormd worden ter hoogte van het endoplasmatisch reticulum (RER) van collageen produceerde cellen. Deze polypeptideketens gaan op hun beurt samen een rechtsdraaiende tripple helix vormen dat het procollageen genoemd wordt (figuur 1). De drie ketens worden samen gehouden door waterstofbindingen. Er zijn telkens 2 waterstofbindingen per triplet.
20 Kenmerkend aan deze polypeptiden in collageen is dat ze bestaan uit een herhaling van 3 aminozuren waarvan de derde steeds glycine is (XaaYaaGly). De aminozuren op positie Xaa en Yaa zijn voornamelijk proline (Pro) en hydroxiproline (Hyp), maar kunnen in principe elk aminozuur voorstellen. De triplet ProHypGly is het meest voorkomende triplet in collageen (10.5%).
23 8
Figuur 2: structuur en opbouw collageen fibril.
Ter hoogte van het RER gebeurt er een hydroxylatie van lysine en proline aminozuren. Verder vindt er glycosylatie van specifiek hydroxylysine plaats. Het procollageen wordt verder vervoerd via het Golgi apparaat waar het verpakt wordt in vesikels en verder getransporteerd wordt naar de extracellulaire ruimte. Ter hoogte van de extracellulaire ruimte wordt het procollageen enzymatisch ontdaan van zijn niet helicale amino en carboxyl uiteinden door middel van peptidasen om zo een collageenmolecule te vormen. Na het afsplitsen van deze uiteinden kunnen de collageenmoleculen spontaan met elkaar interageren met de vorming van microfibrillen. Een microfibril bestaat steeds uit 5 collageenmoleculen. Ter hoogte van de collageenmolecule zorgt het lysyl oxidase voor de vorming van crosslinks tussen de verschillende microfibrillen met vorming van collageen vezels.
22 Binnen de collageen fibril kunnen 2 types onderscheiden worden namelijk het T-type en het C type. Het T-type bestaat uit grote heterogene fibrillen die grote trekkrachten kunnen weerstaan. Het is voornamelijk terug te vinden in peesweefsel, ligamenten en botweefsel. Het C-type bestaat uit kleinere homogene fibrillen georganiseerd in een helische structuur en is terug te vinden in meer elastische weefsels zoals bloedvaten, huid en zenuwweefsel.
24 Door de hiërarchische structuur kan collageen op vele niveaus modificaties ondergaan waardoor het verschillende eigenschappen kan hebben. Het collageen ter hoogte van de cornea is bijvoorbeeld doorzichtig, terwijl het collageen ter hoogte van de pezen een grote weerstand kent tegen mechanische krachten.
21
3.3. COLLAGEEN CROSSLINKS
Collageen cross-links zijn noodzakelijk voor de sterkte en de stabiliteit van het collageen. Ze spelen ook een grote rol in het metabolisme. Zo nemen ze onder andere deel aan het verouderingsproces van collageen. De crosslinks worden gevormd tussen de afzonderlijke fibrillen. Dit neemt plaats ter hoogte van de extracellulaire ruimte. De crosslinking gebeurt enzymatisch door middel van het lysyl oxidase. Het is het enige gekende enzyme betrokken bij de cross-linking, met als cofactor koper.
25 Het is voornamelijk het lysyl oxidase dat instaat voor de 9
kwaliteit van de cross-link. De cross-links worden gevormd aan het uiteinde van de collageen moleculen ter hoogte van de telopetptide regio’s. Ter hoogte van deze regio zorgt het lysyl oxidase voor de omzetting van lysine en hydroxylysine in aldehyden door middel van deaminering. De lysine aldehydes en hydroxylysine aldehydes gaan spontaan reageren met lysine of hydroxylysine residuen in de helicale regio’s van aangrenzende collageenmoleculen. Dit leidt tot de vorming van immature bivalente cross-links. Deze immature cross-links ondergaan verder spontane, niet-enzymatische reacties met vorming van mature trivalente crosslinks, namelijk pyridinoline crosslinks (lysylpyridinoline en hydroxylysylpyridinoline) (fig 1) en pyrrole crosslinks (lysyl-pyrrole en hydroxylysyl-pyrrole).
17
Figuur 3: chemische structuur hydroxylysylpyridinoline (HP) en lysylpiridinoline (LP) referentie artikel 25
HP en LP vertegenwoordigen het grootste aantal crosslinks in collageen. Pyrrole cross-links zijn minder uitgesproken aanwezig maar hebben wel een groter effect op de sterkte van het collageen.
17 De mate van cross-linking is voornamelijk afhankelijk van het type weefsel.
26
3.4. DE ROL VAN COLLAGEEN IN AORTA RUPTUUR.
De wand van de aorta is opgebouwd uit verschillende lagen. De binnenste laag, de tunica intima genaamd, bestaat uit endotheliale cellen en een basaalmembraan met daaronder een dunne laag bindweefsel die voornamelijk uit collageen bestaat. De middelste laag is de tunica media en is de voornaamste laag van de aortawand. Ze bestaat uit glad spierweefsel ondersteund door collageen en elastine vezels. De buitenste wand, de tunica externa of tunica adventitia genaamd, bestaat in hoofdzaak uit dikke bundels collagene vezels en elastine vezels. Tussen deze vezels dringen bloedvaten naar binnen welke zorgen voor de voeding van de buitenste lagen.
27 De hoofd functie van de wand is het opvangen van de pulserende bloedstroom veroorzaakt door de hoge druk in het hart, in functie van de systemische circulatie. Elastine vangt voornamelijk bij 10
lage druk de pulsaties op. Bij hoge druk zal het collageen er voor zorgen dat de wand niet te sterk zal uitrekken om zo scheuren te voorkomen.
28 Aorta ruptuur is een frequent voorkomende aandoening bij Friese paarden.
7 Mogelijks ligt een genetische afwijking van het collageen metabolimse in de aortawand aan de basis van dit probleem. Door afwijkende cross-links verliest het collageen een deel van zijn functie waardoor het spontaan kan scheuren. Bij de mens is reeds gekend dat het collageen in de aorta wand voornamelijk uit collageen type 1 en type 3 bestaat.
29 Bij een studie naar de concentratie van pyridinium cross-links in verschillende boviene weefsels is gebleken dat de aorta een hoge concentratie hydroxypyridinoline bevat in zowel collageen type 1 en collageen type 3.
26 De rekbaarheid van de wand wordt bepaald door het collageen type 3. Bij een afname van de rekbaarheid zal dit sneller leiden tot aneurysme van de wand en ruptuur.
29
Figuur 4: tabel concentratie cross-links in verschillende bovine weefsels. referentie artikel 29
In een muis model werd reeds de rol van cross links aangetoond bij aorta rupturen.
30 In een studie van A. Daugherty en L.A. Cassis (2004) werden muizen geproduceerd met een genetische mutatie waardoor er een abnormale koper absorptie was. Koper is een belangrijke cofactor van het lyslyl oxidase, het enzym dat zorgt voor de vorming van crosslinks. Hierdoor werd de collageen en elastine crosslinking verstoord. Bij deze muizen werden aorta aneurysmen aangetoond met een hoge prevalentie in rupturen, en dit ter hoogte van de thoracale aorta. Een andere groep muizen werd ontwikkeld met een genetische deficiëntie van het lysyl oxidase. Deze muizen waren niet leefbaar door aorta rupturen in de thoracale aorta, die reeds bij de foetale stadia aanwezig waren. 11
3.5. GENETISCHE BINDWEEFSEL AANDOENINGEN
3.5.1. Ehler danlos
Het Ehler danlos sydroom is een erfelijke aandoening die voorkomt bij zowel de mens als bij verschillende dierensoorten. Het werd eerst beschreven bij het rund, later ook bij het schaap, de kat en de hond.
Het wordt gekenmerkt door verschillende gemeenschappelijke symptomen zoals gewrichtslaxiteit, hyperuitrekbaarheid van de huid en broze huid en wordt veroorzaakt door een abnormale structuur van het collageen.
31 Bij de mens wordt de ziekte geclassificeerd in verschillende subtypes. Het Ehlers-Danlos syndroom type IV, ook wel het vasculaire type genoemd, wordt gekenmerkt door het gemakkelijk ontwikkelen van blauwe plekken, een dunne huid met zichtbare venen, ruptuur van arteriën, uterus of ingewanden.
32 Bij dit subtype wordt gezien dat de fibroblasten een afwijkend collageen type 3 produceren. Collageen type 3 wordt in grote hoeveelheden terug gevonden in de bloedvat wand waardoor deze broos is. De typische symptomen van Ehler-Danlos zoals hyperlaxiteit van de pezen en rekbaarheid van de huid, worden bij dit type niet gezien. 32 Dermatosparaxie wordt bij dieren vaak gelinkt aan het Ehler-Danlos sydroom type VIIc bij de mens. De aandoening werd reeds vastgesteld bij het rund, het schaap, de kat en de hond. Het is een erfelijke aangeboren afwijking van het bindweefsel dat veroorzaakt wordt door een defect in het type 1 procollageen N-proteinase. Dit enzym zorgt normaal gezien voor de afsplitsing van de amino-uiteinden van het procollgeen van het collageen type 1. De afsplitsing van de uiteinden is noodzakelijk voor de vorming van de microfibrillen. De procollageen moleculen waarvan de uiteinden niet afgesplitst werden gaan zich opstapelen ter hoogte van de weefsels met vorming van afwijkende fibrillen. Hierdoor hebben de weefsels een afwijkende weerstand tegenover mechanische stress. Dieren met dit defect vertonen een broze huid, hypermobiele gewrichten en sterven meestal vroegtijdig ten gevolge van sepsis veroorzaakt door avulsie van delen van de huid.
33
3.5.2. Marfan
Het Marfan’s syndroom is een erfelijke aandoening van het bindweefsel dat vooral het cardiovasculair, oftalmologisch en musculoskeletaal systeem aantast. Het wordt gekenmerkt door progressieve dilatatie van de ascenderende aorta, een dorsale kanteling van de lens en meerdere skeletale afwijkingen zoals arachnodactylie, scoliose en gewrichtslaxiteit. Sterfte wordt veroorzaakt door hartfalen of door het optreden van een aortaruptuur ter hoogte van de ascenderende aorta. Bij de mens wordt de ziekte veroorzaakt door een afwijkend metabolisme van fibrilline, een component van de microfibrillen in elastine. Bij het rund werd een verlaagde expressie gevonden van het fibrilline ter hoogte van de dermale fibroblasten, de gladde spiercellen van de aortawand en de extracellulaire matrix. Door dit defect is er een verminderde functie van het elastine.
34 12
4. BEPALING VAN CROSSLINKS IN DE URINE
4.1. BEÏNVLOEDING VAN DE UITSCHEIDING VAN CROSS-LINKS
Collageen crosslinks worden uitgescheiden in de urine wanneer er afbraak of turnover van collageen aanwezig is. Bij volwassen dieren vinden we turnover vooral terug ter hoogte van botweefsel of op plaatsen met schade waar heling aan de gang is. Ter hoogte van andere weefsels zoals de huid en pezen is er een trage turnover die bijna onbestaand is.
22 Het grootste aandeel van de crosslinks in de urine zijn in normale omstandigheden dus afkomstig uit het bot. Studies hebben echter aangetoond dat bij bepaalde fysiologische en pathologische omstandigheden een groot deel van de fractie LP en HP afkomstig is uit andere weefsels.
35 Dit zou ook het geval kunnen zijn bij de aorta ruptuur bij Friezen. LP is voor het grootste gedeelte terug te vinden in het botweefsel en dentine, maar in andere weefsels zoals bijvoorbeeld vasculair weefsel bevat het collageen een zelfde concentratie aan LP (in moles LP/ mole collageen) als in bot. Ook in de cornea en de huid is LP vertegenwoordigd.
26,35 HP is voornamelijk terug te vinden in botweefsel en kraakbeen, maar wordt ook in aanzienlijke hoeveelheden terug gevonden in andere weefsels zoals ligamenten, pezen, longe, darmen en de aorta, maar is niet terug te vinden ter hoogte van de huid en de cornea. HP is vooral terug te vinden in collageen types 1,2,3 en 5.
26 De urinaire excretie van HP en LP wordt beïnvloed door de leeftijd, het tijdstip van de dag en de activiteit. Ze verhoogt ook bij sommige aandoeningen zoals osteoartritis en reumatoïde artritis.
36
4.1.1. Leeftijd en geslacht
Studies bij de mens hebben aangetoond dat bij een stijgende leeftijd het collageen in de beenderen afneemt, terwijl de mineralisatie toeneemt. Er is echter geen verschil in urinaire concentratie van HP en LP tussen de verschillende leeftijden bij volwassen (18 tot 96 jaar).
37 Er werd wel een significant verschil aangetoond in de urinaire concentraties van zowel HP als LP tussen kinderen (2 tot 15 jaar) en volwassenen (21 tot 70 jaar).
38 Een studie bij paarden (Black at al.) toonde ook aan dat er een significant verhoogde uitscheiding is van LP tijdens de groeiperiode en puberteit in vergelijking met volwassen paarden.
39 Bij veulens (4 tot 5 maand) was de concentratie van LP 10-14 keer hoger dan bij volwassen dieren (12 tot 21 jaar). De groei bij jonge dieren wordt gekenmerkt door een hoge snelheid van bot turnover waardoor er ook een hogere urinaire uitscheiding aanwezig is. Er was geen significant verschil tussen geslachten.
37 13
4.1.2. Tijdstip
Pyridinoline concentraties in de urine variëren bij de mens niet significant in functie van het dag en nacht ritme of het seizoen.
39 Er werd wel een diurnaal ritme aangetoond in de uitscheiding van HP en LP. Bij de mens zijn er hogere concentraties aanwezig in de ochtend in vergelijking met de middag en avond.
40 De urinaire concentratie bij kinderen volgt een zelfde tendens 41 , terwijl er bij baby’s tussen de 4 en 12 maanden oud geen duidelijk patroon aanwezig is.
42 Bij adulte paarden werden er piekconcentraties tussen 02u00 en 08u00 aangetoond. De laagste concentraties zijn aanwezig tussen 11u00 en 17u00, en 20u00 en 02u00. (A. Black et al. 1997) Bij veulens is er geen significant verschil aangetoond gedurende de dag en nacht.
39
4.1.3. Activiteit
Verschillende studies bij mensen tonen aan dat de uitscheiding van HP en LP significant verhoogt onder invloed van fysieke activiteit. Zo werd een duidelijke toename in uitscheiding gevonden bij een onderzoek naar HP en LP in de urine bij lopers. Bij onderzoek naar de uitscheiding bij andere sport disciplines (turners, gewichtheffen, wandelen) werden verschillende resultaten bekomen, met zowel dalingen als geen veranering.
43 Bij paarden werd een gelijkaardig onderzoek gedaan naar de uitscheiding van het pyridinoline cross-linked telopetide domein van type 1 collageen. Bij de getrainde paarden (drie keer per week in de stapmolen) werd eerst een stijging gevonden, waarna de uitscheiding na ongeveer 4 maand terug daalde.
44 Doordat de leeftijd van de onderzochte paarden echter 2 jaar was, zou hier een interferentie aanwezig kunnen zijn met de leeftijd gerelateerde daling. Verder onderzoek is nodig om het effect van training aan te tonen.
4.1.4. Aantasting van het gewricht
Osteoartritis is een veel voorkomende aandoening bij oudere paarden, maar kan elke leeftijd aantasten. De aandoening kan primair ontstaan bij afwijkend kraakbeen, of secundair door ontsteking van een gewricht of bij overbelasting. Bij osteoartritis wordt het kraakbeen aangetast waardoor er meer druk op het onderliggende bot komt te staan. Hierdoor ontstaan veranderingen in het onderliggend botweefsel en de omgevende weke delen. Bij aangetaste dieren is de urinaire uitscheiding van HP en LP verhoogd. De mate van stijging is afhankelijk van de graad van aantasting van het botweefsel en het kraakbeenweefsel.
45 Ook bij de mens werd aangetoond dat patiënten met osteoartritis en reumatoïde artritis een verhoogde uitscheiding hebben.
46 14
4.2. BEWARING VAN URINE VOOR BEPALING VAN CROSS-LINKS
HP en LP kunnen langer dan een jaar bewaard worden bij een temperatuur van -20°C. Er werd ook geen afbraak gezien gedurende 9 maanden bij bewaring tussen de 20°C en -70°C. Minder dan 5 vries-dooicycli zullen de concentraties aan HP en LP niet beïnvloeden.
47 HP en LP opgelost in water zijn zeer gevoelig aan UV-licht. De gevoeligheid aan UV is echter afhankelijk van de pH van de oplossing. De crosslinks zijn zo bijvoorbeeld in urine (licht alkalisch bij het paard) veel minder gevoelig aan UV-licht. Ook de vorm van de cross-links is bepalend voor de gevoeligheid. De vrije vorm zal sneller afgebroken worden door UV dan de aan eiwit gebonden vorm. Gehydrolyseerde urine zal dus gevoeliger zijn. Kunstlicht heeft geen invloed op de degradatie van cross-links in urine.
47
4.3. METHODES VOOR HET BEPALEN VAN CROSS-LINKS IN DE URINE
4.3.1. HPLC fluorometrie
HPLC fluometrie is een van de oudere technieken die beschreven werd voor het meten van de cross-links in urine. De aanwezige stoffen in de urine worden hierbij gescheiden door middel van reversed-phase HPLC. Na de scheiding kunnen HP en LP gedetecteerd worden door middel van een fluorometer, aangezien ze auto-fluorescent zijn. De techniek heeft een redelijke sensitiviteit en selectiviteit. In de urine zijn HP en LP onder verschillende vormen aanwezig 40% bevindt zich in de vrij vorm en 60% is gebonden aan ewitten.
48 De urine van paarden moet eerst gehydrolyseerd worden vooraleer het kan geïnjecteerd worden in de HPLC kolom aangezien vooral de vrije fractie aan HP en LP gedetecteerd wordt. Hydrolyse gebeurt door middel van HCl en zorgt ervoor dat de gebonden cross-links loslaten van de eiwitten. Verder moet de urine ook opgezuiverd worden voor analyse. HP en LP worden hierbij geëlueerd door middel van water en acetonitrile. Na centrifuge zijn HP en LP aanwezig in de onderstaande fractie. Hierna wordt de urine geïnjecteerd in een CF1 cellulose kolom. Deze kolom zorgt voor het scheiden van de stoffen waarna deze één voor één gedetecteerd kunnen worden door fluorometrie.
48 De HPLC fluorometrie is een goede techniek voor het meten van HP en LP in de urine. Het grote nadeel is dat deze techniek zeer tijdrovend is doordat de urine niet zomaar geïnjecteerd kan worden en er ook een voorbereiding nodig is voor het prepareren van de cellulose kolommen.
4.3.2. Enzyme-linked immunoassay
De ELISA methode is gebaseerd op de binding van antistoffen op HP en LP. Er wordt gebruik gemaakt van polyklonale antipyridinoline antistoffen die gevormd werden in muizen door inspuiting van pyridinolines. Hierbij wordt eerst urine samen gevoegd met verdund 15
antiserum. Na incubatie wordt hierna Anti-ratten IgG geproduceerd in geiten toegevoegd die gelabeld is door middel van een enzym (alkaline fosfatase). Als laatste stap wordt een stof toegevoegd die een kleurreactie ondergaat met het enzym. Hiervan wordt de optische densiteit gemeten. Er werd een hoge correlatie vastgesteld tussen de HPLC fluorometrie en de ELISA. Het voordeel van de ELISA is dat de methode zeer gemakkelijk uit te voeren valt en er geen hydrolyse stap nodig is. Er kunnen tevens veel stalen tegelijk kunnen bemonsterd worden. De ELISA techniek heeft echter een lagere sensitiviteit dan de HPLC fluorometrie welke te laag is voor een goede analyse van de stalen.
48
4.3.3. LC-MS/MS
Voor de bepaling van de concentratie crosslinks in de urine kan ook gebruik gemaakt worden van LC-MS/MS. Dit is een techniek beschreven door Tang J. et al. (2014). Hierbij wordt 0,5 ml urine samen gevoegd met HCl, I.S. en een cellulosesuspensie. In het chromatografie toestel worden de verschillende stoffen gescheiden op basis van hun retentietijd. LC zorgt voor het scheiden van de stoffen waarna deze gedetecteerd en gekwantificeerd kunnen worden in het MS toestel.
49 Het grote voordeel van deze techniek is dat meerdere stalen tegelijk kunnen geanalyseerd worden en dat LC-MS/MS een heel hoge specificiteit heeft. Er kunnen door middel van LC MS/MS ook lagere concentraties gemeten worden dan bij de andere methodes. Er zijn wel nog steeds arbeidsintensieve voorbereidende stappen nodig. 16
BESPREKING
Verder onderzoek is nodig naar de pathogenese van aorta ruptuur en andere aandoeningen bij het Friese paard. Een genetische afwijking van het collageen metabolisme werd in meerdere onderzoeken bij het Friese paard geopperd. In functie van het aantonen van een collageen defect bij de fries wordt best gefocust op de pyridinium cross-links HP en LP, aangezien een vorige studie reeds een verschil aantoonde tussen warmbloeden en Friese paarden wat betreft de pyridinium cross-links in peesweefsel (ongepubliceerde resultaten). Het voordeel van deze cross-links is dat deze in het bloed vrijkomen na afbraak van collageen en direct in de urine worden uitgescheiden zonder voorafgaande metabolisatie door de lever. De urinaire uitscheiding van HP en LP worden ook niet beïnvloed door het dieet, aangezien deze stoffen niet worden geabsorbeerd via de darm.
36 Onderzoek naar de uitscheiding van crosslinks bij de Fries zou dus een grote meerwaarde kunnen betekenen, hoewel toch nog een aantal obstakels overwonnen moeten worden. Enerzijds kan de specificeit van de pyridinium cross-links HP en LP in twijfel getrokken worden aangezien zij vooral worden uitgescheiden na turnover van bot, en het bindweefsel maar een klein aandeel omvat van de totale uitscheiding. Toch zou een algemene verhoging van de uitscheiding binnen het Friese ras ten opzichte van andere paarden al een indicatie kunnen geven over de oorzaak van de aandoening. Hierbij moet er nauwkeurig rekening gehouden worden met de toestand/training van de onderzochte dieren, de leeftijd en de mogelijke toegediende medicatie. Deze kunnen namelijk een invloed hebben op de uitscheiding van de cross-links en hiervoor moet gecorrigeerd worden. Zo zullen paarden met osteoartritis, een veel voorkomende aandoening bij oudere paarden, een sterk verhoogde uitscheiding hebben wat kan leiden tot een foutieve interpretatie van de resultaten. Ook osteochondrose is een veel voorkomende aandoening bij jonge paarden welke een invloed zou kunnen hebben op de uitscheiding van HP en LP. Bij aangetaste paarden werd reeds een verhoogde concentratie aan HP en LP gevonden ter hoogte van het gewricht.
50 Onderzoek van de urine naar de uitscheiding van de cross-links bij osteochondrose zou dus nuttig zijn. Het zou bijzonder interessant zijn om een aantal Friezen met aorta ruptuur in het onderzoek te kunnen betrekken. Doch aangezien het aantal Friese paarden in België beperkt is en een groot aantal aangetaste paarden vermoedelijk de kliniek niet bereikt, is dit moeilijk haalbaar. Opvangen van urine bij paarden kan op verschillende manieren gebeuren. Men kan gewoon midstream urine opvangen in een potje. Dit vergt zeer veel tijd en geduld. Sommige paarden weigeren ook te urineren in het bijzijn van de mens. Een andere methode is de 24 uur collectie. Hierbij wordt een speciaal ontworpen harnas aangebracht bij het paard, welke de urine automatisch opvangt telkens het paard urineert.
39 Dit harnas kan ook na een gewenste tijd geleegd worden (voorbeeld om de 3 uur). Deze harnassen zijn helaas niet overal beschikbaar. Een derde mogelijkheid is opvangen van urine doormiddel van blaas katheterisatie. Dit is een tijdrovend werk waarbij de paarden telkens gesedeerd worden. Het nadeel hiervan is dat de sedatie een invloed zou kunnen hebben op de 17
urinaire concentraties. Onderzoek naar de invloed van sedatie op uitscheiding van cross-links werd nog niet beschreven. Verder zijn de technieken voor het bepalen van cross-links in de urine vooral ontwikkeld voor de detectie bij mensen. De urine van paarden is troebel en bevat veel mucus afkomstig uit de accessoire geslachtklieren wat moeilijkheden kan geven bij de analyse. Voor paarden werden ook nog geen standaarden opgesteld voor HP en LP in de urine. Genetische testen zijn essentieel in het verdere onderzoek naar aortaruptuur en andere aandoeningen binnen het Friese paarden ras. Er werd vastgesteld dat Friese paarden met aorta ruptuur een grote verwantschap onderling hebben in vergelijking met de verwantschap met de rest van de populatie. Dit doet de aanwezigheid van een recessief overdraagbare aandoening vermoeden. Het ontwikkelen van een DNA test, zou het opsporen van dragers en zo een aanpassing van de selectie binnen het Friese ras mogelijk maken. Gezien de hoge inteelt binnen dit Friese ras is het echter mogelijk dat alsnog andere, mogelijks nog ongekende erfelijke ziekten de kop opsteken. 18
REFERENTIES
1. https://www.kfps.nl/ , Historie van paard 2. Ducro B.J., Bovenhuis H., Neuteboom M., Hellinga I. (2006). GENETIC DIVERSITY IN THE DUTCH FRIESIAN HORSE. 8 th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, Brazil. 3. Saey V., Famaey N., Smoljkic M., Claeys E., van Loon G., Ducatella R., Ploeg M., Delesalle C., Gröne A., Duchateau L., Chiers K. (2015). Biomechanical and biochemical properties of the thoracic aorta in warmblood horses, Friesian horses, and Friesians with aortic rupture. BMC Veterinary Research 11:285. 4. Ploeg M., Saey V., de Bruijn C.M., Gröne A., Chiers K., van Loon G., Ducatelle R., van Weeren P.R., Back W., Delesalle C. (2011). Aortic rupture and aorto-pulmonary fistulation in the Friesian horse: Characterisation of the clinical and gross
post mortem
findings in 24 cases. Equine Veterinary Journal. Equine Veterinary Journal 45(1), 101-106. 5. Sijsling A.M. (2015). Pyrrole cross-links and glycosaminoglycans and their role in aortic rupture in the Friesian horse. Research Project University of Utrecht. 6. Sleeper M.M., Durando M.M., Miller M., Habecker P.L., Reef V.B. (2001). Aoric root disease in four horses. Journal of the American Veterinary Medical Association 219(4), 491-496. 7. Ploeg M., Saey V., Delesalle C., Gröne A., Ducatelle R., de Bruijn M., Back W., van Weeren P. R., van Loon G., Chiers K. (2014). Thoracic Aortic Rupture and Aortopulmonary Fistulation in the Friesian Horse: Histomorphologic Characterization. Veterinary Pathology 2015 52(1), 152-159. 8. Rooney J.R., Prickett M.E., Crowe M.W. (1967). Aortic Ring Rupture in Stallions. Veterinary Pathology 4(3), 268-274. 9. van der Linde-Sipman J.S., Kroneman J., Meulenaar H., Vos J.H. (1985). Necrosis and Rupture of the Aorta and Pulmonary Trunk in Four Horses. Veterinary Pathology 22, 51-53. 10. Broekman L.E.M., Kuiper D. (2002). Megaesophagus in the horse. A short review of the literature and 18 own cases. Veterinary Quarterly 24(4), 199-202. 11. Sutton G.G.M. (2015). Diagnosing disorders of the equine oesophagus. Equine Veterinary Education 27(6), 291-294. 12. Ploeg M., Gröne A., Saey V., de Bruijn C.M., Back W., van Weeren P.R., Scheideman W., Picavet T., Ducro B.J., Wijnberg I., Delesalle C. (2014). Esophageal Dysfunction in Friesian Horses: Morphological Features. Veterinary Pathology 1-6. 13. Sipma K.D., Cornillie P., Saulez M.N., Stout T.A.E., Voorhout G., Back W. (2013). Phenotypic Characteristics of Hydrocephalus in stillborn Friesian Foals. Veterinary pathology 00(0), 1-6. 14. Back W., Van Der Lugt J.J., Nikkels P.G.J., Van Den Belt A.J.M., Van Der Kolk J.H., Stout T.A.E. (2008). Case Report. Phenotypic diagnosis of dwarfism in six Friesian horses. Equine Veterinary Journal 40 (3), 282-287. 15. Gussekloo S.W.S., Lankester J., Kersten W., Back W. (2011). Effect of differences in tendon properties on functionality of the passive stay apparatus in horses. American Journal of Veterinary Research 72(4), 474-483. 16. Thorpe C.T., Stark R.J.F., Goodship A.E., Birch H.L. (2010). Mechanical properties of the equine superficial digital flexor tendon relate to specific collagen cross-link levels. Equine Veterinary Journal 42, 583-543. 19
17. Hazeleger E. (2013) The biochemical differences of the superficial digital flexor tendon and the common digital extensor tendon between Warmbloods, Friesians and Thoroughbreds. Utrecht University, Department of Equine Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht. 18. Sevinga M., Hesselink J.W., Barkema H.W. (2002). Reproductive performance of Friesian mares after retained placenta and manual removal of the placenta. Theriogenology 57, 923-930. 19. Sevinga M. Barkema H.W., Stryhn H., Hesselink J.W. (2004). Retained placenta in Friesian mares: incidence, and potential risk factors with special emphasis on gestational lenght. Theriogenology 61, 851-859. 20. Shoulders M.D., Raines R.T. (2009). Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem 78, 989 958. 21. Wess T.J., Avery N.C., Bailey A.J. (2008). Collagen, Structure and Mechanics. Fratzl P. Chapter 3, p51-53, Chapter 4, p83-91. 22. Nimni M.E. (1983) Collagen: Structure, Function, and Metabolism in Normal and Fibrotic Tissues. Seminars in Arthritis and Rheumatism 13(1), 1-66. 23. Ramshaw J.A.M., Shah N.K., Brodsky B. (1998). Gly-X-Y Tripeptide Frequencies in Collagen: A Context for Host-Guest Triple-Helical Peptides. Journal of Structural Biology 122, 86-91. 24. Ottani V., Raspanti M., Ruggeri A. (2001). Collagen structure and functional implications. Micron 32, 251-260. 25. Ricard-Blum S., Ville G. (1989). Minireview. Collagen cross-linking. Int. J. Biochem. 21(11), 1158 1189. 26. Wu J., Eyre D.R. (1985) Studies on the Distribution of Hyrdroxypyridinium Cross-Links in Different Collagen Types. The children’s Hospital and Harvard Medical School Bosten, Massachusetts. 27. Sijsling A.M. (2015). Pyrrole cross-links and glycosaminoglycans and their role in aortic rupture in the Friesian horse. Research Project University of Utrecht. 28. Saey V., Famaey N., Smoljkic M., Claeys E., van Loon G., Ducatelle R., Ploeg M., Delesalle C., Gröne A., Duchateau L., Chiers K. (2015). Biomechanical and biochemical properties of the thoracic aorta in warmblood hroses, Friesian horses, and Friesians with aortic rupture. BMC Veterinary Research 11, 285 29. Menashi S., Campa J.S., Greenhalgh R.M., Powell J.T. (1987). Collagen in abdominal aortic aneurysm: Typing, content, and degradation. Journal of Vascular Surgery 6, 578-582. 30. Daugherty A., Cassis L.A., (2004). Mouse Models of Abdominal Aortic Aneurysms. Journal of the American Heart Association 24, 429-434. 31. Sinke J.D., van Dijk J.E., Willemse T. (1997). A case of Ehlers-Danlos-like syndrome in a rabbit with a review of the disease in other species. Veterinary Quarterly, 19(4); 182-185. 32. Pepin M, Schwarze U., Superti-Furga A., Byers P.H. (2000). CLINICAL AND GENETIC FEATURES OF EHLERS-DANLOS SYNDROME TYPE IV, THE VASCULAR TYPE. Journal of Medicine, 342(10, 673-680. 33. Smith L.T., Wertelecki W., Milstone L.M., Petty E.M., Seashore M.R., Braverman I.M., Jenkins T.G., Byers P.H. (1992). Human Dermatosparaxis: A Form of Ehlers-Danlos Syndrome That Results from Failure to Remove the Amino-terminal Propeptide of Type I Procollagen. Am.J.Hum 51, 235-244. 34. Potter K.A., Besser T.E. (1994). Cardiovascular Lesions in Bovine Marfan Syndorme. Veterinay Pathologie 31(5), 501-509. 20
35. Eyre D.R. (1995). The specificity of collagen cross-links as markers of bone and connective tissue degradation. Acta Orthopaedica Scandinavica 66, 166-170. 36. Kamel S., Brazier M., Desmet G., Picard C., Mennecier I., Sebert Jl. (1992). High Performance liquid chromatographic determination of 3-hydrocypyridinium derivatives as new markers of bone resorption. Journal of Chromatography 574, 255-260. 37. Bailey A.J., Sims T.J., Ebbesen E.N., Mansell J.P., Thomsen J.S., Mosekilde Li. (1999). Age Related Changes in the Biochemical Properties of Human Cancellous Bone Collagen: Relationship to bone strength. Calcif. Tissue Int 65, 203-210. 38. Beardsworth L.J., Eyre D.R., Dickson I.R. (1990). Changes with age in urinary excretion of lysyl- and hydroxylysylpyridinoline, two new markers of bone collagen turnover. Journal of bone and mineral research 5(7), 671-676. 39. Black A., Schoknecht P.A., Ralston S.L., Shapses S. (1998). Diurnal Variation and Age Differences in the Biochemical Markers of Bone Turnover in Horses. Journal of Animal Science 77(1), 75-83. 40. Schlemmer A., Hasseger C., Jensen S.B., Christiansen C. (2009). Marked diurnal variation in urinary excretion of pyridinium cross-links in premenopausal women. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 74(3), 476-480. 41. Fujimoto S., Kubo T., Tanaka H., Miura M., Seino Y. (2009). Urinary pyridinoline an deoxypyridinoline in healthy children and in children with growth hormone deficiency. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 80(6), 1922-1928. 42. Lutchman E.C., Hardwick T.A., Biener R., Chowdhury H.A., trout J.R., Shapses S.A. (1998). Longitudinal study of urinary hydroy-pyridinium cross-links and growth in healthy infants: higher values with breastfeeding and after daytime sleep. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 106(1), 51-56. 43. 46 Vesper H.W., Demers L.M., Eastell R., Garnero P., Kleerekoper M., Robins S.P., Srivastava A.K., Warnick G.R., Watss N.B., Myers G. (2002). Assessment and Recommendations on Factors Contributing to Preanalytical Variability of Urinary Pyridinoline en deoxypyridinoline. Clinical chemistry 48(2), 220-2235. 44. Price J.S., Jackson B., Eastell R., Wilson A.M., Russell R.G.G., Lanyon L.E., Goodship A.E. (1995). The Response of the Skeleton to Physical Training: A Biochemical study in Horses. Elsevier 17(3), 221-227. 45. Arican M., Köylü Ö., Uyaroglu A., Erol M., Calim K.N. (2004). Diagnostic Importance of Deoxypyridinoline and Osteocalcine in Equine Osteoarthritis. Acta Vet. BRNO 73, 491- 496. 46. Takashashi M., Kushida K., Hoshino H., Suzuki M., Sano M., Miyamoto S., Inoue T. (1996). Concentrations of pyridinoline and deoxypyridinoline in joint tissues from patients with osteoarthritis or rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases 55, 324-327. 47. Vesper H.W., Demers L.M., Eastell R., Gernero P., Kleerekoper M., Robins S.P., Srivastava A.K., Warnick G.R., Watts N.B., Myers G.L. (2002). Assessment and Recommendations on Factors Contributing to Preanalytical Variability of Urinary Pyridinoline and Deoxypyridinoline. Clinical Chemistry 48(2), 220-235. 48. Kamel S., Brazier M., Picard C., Boitte F., Samson L., Desmet G., Sebert J.L. (1994). Urinary excretion of pyridinolines crosslinks measured by immunoassay and HPLC techniques in normal subjects and in elderly patients with vitamin D deficiency. Bone and Mineral 26, 197-208 49. Tang J.C.Y., Dutton J.J., Piec I., Green D., Fisher E., Washbourne C.J., Fraser W.D. (2014). LC MS/MS Measurement of Urine Free Collagen Crosslinks Pyridinoline and Deoxypyridinolin: Urine Markers of Bone Resorption. University of East Anglia, Norwich Medical School. 21
50. van de Lest C.H.A., Brame P.A.J., van El B., DeGroot J., van Weeren P.R. (2004). Extracellular matrix changes in early osteochondrotic defects in foals: a key role for collagen? Elsevier 1690(1), 54-62. 22