Valutazione dei risultati ottenuti dal lavaggio broncoalveolare in una

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❚ Medicina Interna
Valutazione dei risultati ottenuti
dal lavaggio broncoalveolare in una popolazione
di cavalli sportivi
M. Sgorbini, V. Marchetti, C. Stefani*, M. Corazza
Dipartimento Clinica Veterinaria, Università di Pisa
*Libero professionista, Prato (FI)
RIASSUNTO
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare dei campioni di BAL ottenuti da cavalli
sportivi con dati anamnestici compatibili con
scarso rendimento atletico, utilizzando dei valori di riferimento intermedi a quelli indicati da
alcuni autori.
Materiali e metodi - Sono stati analizzati 82
BAL raccolti in cavalli diversi per razza, sesso
ed età. Tutti i soggetti sono stati sottoposti a
visita clinica, esame ecografico delle pleure, esame endoscopico delle vie aeree e lavaggio
broncoalveolare. Il campione di liquido raccolto è stato analizzato quantitativamente mediante conta cellulare e qualitativamente mediante
il calcolo delle percentuali di macrofagi, linfociti, neutrofili, eosinofili e mastociti.
Risultati - La IAD è stata diagnosticata in
55/82 (67,1%) di queste 12/82 (14,6%) erano di
tipo eosinofilico e 43/82 (52,4%) di tipo misto;
la RAO è stata osservata in 12/82 (14,6%),
l’EIPH in 4/82 (4,9%). Undici/82 (13,4%) soggetti sono risultati nella norma tanto nella conta
totale che nel quadro citologico. La IAD eosinofilica è stata diagnosticata in soggetti di età
media 2,87±1,46, la IAD mista in cavalli di
3,97±1,75, la EIPH in cavalli di età media 4±1,41
e la RAO in cavalli di età media 11,5±4,20.
INTRODUZIONE
Le affezioni delle basse vie respiratorie, dopo quelle dell’apparato muscolo-scheletrico, rappresentano la più importante causa di scarso
rendimento atletico, o poor performance nel cavallo da competizione.
Esse spesso determinano l’interruzione degli allenamenti e, in alcuni
casi, un prematuro ritiro dei soggetti colpiti dalle competizioni con
conseguenti gravi perdite economiche (Malikides e Hodgson, 2003).
Nei soggetti giovani le malattie delle basse vie respiratorie (Inflammatory Airway Disease/IAD) e l’emorragia polmonare da sforzo (Exercise-induced pulmonary haemorrhage, EIPH) rappresentano le cause
più frequenti di poor performance, mentre nei soggetti di età maggiore ai 5 anni possono essere osservate anche forme iniziali o sub-cliniche di ostruzione ricorrente delle vie respiratorie (Recurrent Airway Obstruction o RAO) (Ferrucci, 2003; Rush e Mair, 2004; Couetil
et al., 2007).
Nelle ultime due decadi sono stati pubblicati numerosi studi che hanno avuto come scopo quello di standardizzare: a) le manovre tecniche del lavaggio bronco-alveolare (BAL), b) le modalità di conservazione del campione, c) la conta totale delle cellule nucleate, d) l’allestimento dei preparati e le colorazioni da utilizzare, etc., e) l’interpretazione del quadro citologico. Esistono comunque pareri discordanti
relativamente alle percentuali cellulari sia nei soggetti sani che in
quelli affetti da patologie delle basse vie respiratorie (Fogarty e Buckley, 1991; McGorum e Dixon, 1994; Hare et al., 1994; Rush e Mair,
2004; Hare e Viel, 1998; Ferrucci et al., 2000; Hewson e Viel, 2002; Couetil et al., 2007).
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare dei campioni di
BAL ottenuti da cavalli sportivi con dati anamnestici compatibili con
scarso rendimento atletico, utilizzando dei valori di riferimento intermedi a quelli indicati da alcuni autori (Fogarty e Buckley, 1991; Hare et
al., 1994; Rush e Mair, 2004; Hare e Viel, 1998; Ferrucci et al., 2000; Couetil et al., 2001; Di Fabio et al., 2003; Couetil et al., 2007).
MATERIALI E METODI
In questo studio sono stati analizzati 82 BAL effettuati su soggetti
adulti presentati alla nostra attenzione per scarso rendimento atletico. In particolare i proprietari/allenatori riportavano una riduzione
“Articolo ricevuto dal Comitato di Redazione il 29/04/2009 ed accettato per la pubblicazione dopo revisione il 20/10/2009”.
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TABELLA 1
Distribuzione dell’età della popolazione dei
cavalli esaminati
FOTO 1 - Due preparati citologici ottenuti nello stesso
soggetto da un lavaggio tracheale (TW) e da un lavaggio
bronco alveolare (BAL). Notare la differenza nell’intensità della colorazione che indica la più elevata cellularità del
lavaggio tracheale.
del rendimento atletico e scarse capacità di recupero post-esercizio. Le anamnesi dei soggetti, a
causa della difficoltà nell’ottenere informazioni
sempre verosimili, non ci hanno permesso in
molti casi di conoscere se era presente tosse e
in quali frangenti veniva rilevata. L’anamnesi riportava la regolare esecuzione dei trattamenti
per parassitosi gastrointestinali e delle vaccina-
FOTO 2 - BAL 100X. Macrofagi, linfociti, due neutrofili e (in alto a destra) un eosinofilo coartato mal riconoscibile.
12
N.ro soggetti
Età
12
2 anni
25
3 anni
11
4 anni
4
5 anni
8
6 anni
5
7 anni
5
8 anni
12
>9 anni
zioni per influenza, mentre non risultavano regolarmente effettuate le vaccinazioni per rinopolmonite equina.
I cavalli erano rappresentati da 58 trottatori, 11
PSI, 5 PSA, 8 sella; 15 erano castroni, 26 maschi e
41 femmine. La distribuzione dell’età è riportata in
Tabella 1.
Sono stati inclusi nello studio solo i soggetti in cui
sono state escluse le patologie causa di scarso
rendimento atletico di pertinenza non respiratoria. Tutti i cavalli sono stati sottoposti a: 1) visita
clinica e, per ciò che riguarda l’esame obiettivo
particolare dell’apparato respiratorio, l’auscultazione è stata effettuata anche con rebreathing bag
per identificare rumori patologici altrimenti non
evidenziabili; 2) esame ecografico delle pleure
(COREL-VISION-PRO®, Toshiba, Giappone, sonda
convex multifrequenza 7,5-10 MHz) per diagnosticare eventuali formazioni ascessuali, alterazioni
del foglietto pleurico viscerale e/o raccolte liquide; 3) esame endoscopico (colonscopio Olympus
CF Type EL, centralina CLE 10, Giappone) per visualizzare muco, sangue, modificazioni a carico
della mucosa delle vie aeree, ecc.; 4) BAL: per questa procedura i soggetti sono stati sedati con detomidina (0,03-0,05 mg/kg pc, IV). La presenza di
muco visibile è stata annotata, ma non quantificata tramite un punteggio.
Per ogni soggetto sono stati raccolti almeno 30-40
ml di liquido refluo dal polmone in una siringa da
60 ml e il campione è stato immediatamente utilizzato per la conta cellulare (media di 2 letture) su
contacellule (HecoVet, Seac, Firenze) e successivamente citocentrifugato (Cytofuge 2, StatSpin, USA).
I preparati così ottenuti sono stati fissati all’aria e
colorati con Diff Quik® (Dade Spa, Milano) (Foto
1). Per ogni campione sono state contate 400 cellule e ottenute le percentuali di macrofagi, linfociti, neutrofili, eosinofili (Foto 2, 3) e mastociti. La
diagnosi di IAD è stata emessa in quei soggetti
con conta totale delle cellule nucleate/µl superiore a 300 e considerando nella conta differenziale
le indicazioni di AA per i valori normali (Fogarty
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Buckley, 1991; Hare et al., 1994; Rush e Mair, 2004;
Hare e Viel, 1998; Ferrucci et al., 2000; Couetil et
al., 2001; Couetil et al., 2007).
Nella nostra indagine abbiamo arbitrariamente
usato valori intermedi a quelli degli autori sopracitati considerando normali: macrofagi <65%, linfociti <30%, neutrofili <5%, eosinofili <1%, mastociti <2%. I casi di IAD sono stati classificati dal
punto di vista citologico in: 1) IAD mista con linfocitosi, monocitosi e neutrofilia; 2) IAD eosinofilica per eosinofilia >1%; 3) IAD mastocitaria nel
caso di mastociti >2% (Hewson e Viel, 2002; Malikides e Hodgson, 2003; Rush e Mair, 2004).
La diagnosi di RAO è stata emessa nei soggetti
con conta totale delle cellule nucleate/µl inferiore
a 300 e con neutrofilia nel BAL superiore al 20%
(Foto 4) (Ferro et al., 1998; Ferrucci et al., 2000;
Couetil et al., 2007).
La diagnosi citologica di EIPH è stata emessa attraverso il rilievo di emosiderofagi, eritrofagociti,
e/o emosiderofagi e/o macrofagi contenenti cristalli di ematoidina, in relazione alla temporalità
dell’evento emorragico (Foto 5a, b, 6, 7) in percentuale elevata (>25%), contenenti materiale ematinico abbondante e derivante da più episodi stabiliti in base al colore del materiale fagocitato
(McKane et al., 1993; Meyer et al., 1998; Slocombe, 2000; Di Fabio et al., 2003). Abbiamo stabilito
il valore >25% di eritrofagi come cut off, sommando la media e la deviazione standard dei risultati
ottenuti da Di Fabio et al. (2003) in una popolazione di cavalli trottatori con EIPH.
FOTO 3 - BAL 100X. Tre macrofagi al centro, due linfociti e due eosinofili.
RISULTATI
Nel nostro studio il 70,7% dei soggetti esaminati
erano trottatori, il 13,4% PSI, il 6,1% PSA, il 9,7%
sella. Il 18,3% erano castroni, il 31,7% maschi e il
50% femmine. Per quanto riguarda l’età, il valore
della mediana è di 4 anni, il 14,6% aveva 2 anni, il
30,5% 3 anni, il 13,4% 4 anni, il 4,9% 5 anni, il 9,7%
6 anni, il 6,1% 7 anni, il 6,1% 8 anni, il 14,6% maggiore o uguale a 9 anni.
L’esame fisico, ed in particolare l’esame semeiologico dell’apparato respiratorio, usando la rebreathing bag per migliorare i rilievi auscultatori,
non ha fornito dati importanti ai fini della diagnosi definitiva. L’esame ecografico delle pleure in
nessun caso ha permesso di rilevare alterazioni
degne di nota.
La IAD è stata diagnosticata in 55/82 (67,1%) di
queste 12/82 (14,6%) erano di tipo eosinofilico e
43/82 (52,4%) di tipo misto. In 2/12 (16,7%) appartenenti al gruppo delle IAD eosinofiliche ed in 7
soggetti/43 (16,3%) appartenenti al gruppo delle
IAD miste è stato osservato anche un quadro associato di EIPH.
Considerando il tipo di classificazione proposto
da Ferrucci et al. (2000), delle 43 IAD che noi ab-
FOTO 4 - BAL 40X. Quadro prevalentemente neutrofilico con muco abbondante
sul fondo e presenza di un macrofago.
biamo classificato come miste, 18/43 (41,9%) sarebbero state identificate come neutrofiliche e
25/43 (58,1%) come miste. Inoltre, 4/18 delle IAD
classificate come neutrofiliche e 3/25 delle IAD
miste presentavano un quadro associato di EIPH.
La RAO è stata diagnosticata in 12/82 (14,6%)
soggetti, mentre l’EIPH in 4/82 (4,9%) cavalli. In
questi ultimi erano presenti emosiderofagi, eritrofagociti, e/o macrofagi contenenti cristalli di ematoidina che rappresentavano il 42±5% dei macrofagi totali. Inoltre gli emosiderofagi contenevano
costantemente voluminosi granuli di emosiderina
di differente colorazione, testimoniando così diIppologia, Anno 21, n. 1, Marzo 2010
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A
B
FOTO 5A e B - BAL 20X e 100X. Macrofagi contenenti abbondante materiale di origine eritrocitaria di un episodio di EIPH non recente.
versi episodi di emorragia polmonare. Infine, nei
soggetti con EIPH è stata rilevata una percentuale
di eosinofili elevata (4±1, mediana 5). Undici/82
(13,4%) soggetti sono risultati nella norma tanto
nella conta totale che nel quadro citologico.
L’età media dei vari gruppi è risultata la seguente:
IAD eosinofilica 2,87±1,46; IAD mista 3,97±1,75;
EIPH 4±1,41 e RAO 11,5±4,20 anni.
Nel 50% dei casi di IAD e nel 63% dei casi di RAO
è stata annotata la presenza di abbondante muco
in trachea.
La valutazione quantitativa delle cellule infiammatorie (macrofagi, eritrofagi ed emosiderofagi, linfociti, neutrofili, eosinofili) per ciascuna patologia è
riportata in Tabella 2.
FOTO 6 - BAL 100X. Una cellula multi nucleata e due macrofagi contenenti materiale di origine ematica di un episodio di EIPH più recente delle immagini 5 a e b.
FOTO 7 - BAL 100X Blu di Prussia. Macrofagi contenenti abbondante materiale di
origine ematica.
14
DISCUSSIONE
E CONCLUSIONI
L’esame citologico del lavaggio broncoalveolare in
teoria non dovrebbe offrire difficoltà perché i macrofagi alveolari, i linfociti, i neutrofili, gli eosinofili
e i mastociti e le cellule epiteliali (Foto 8, 9) sono
cellule facilmente identificabili. Gli eventuali errori
possono consistere nell’interpretazione errata di
cellule danneggiate, nella discriminazione tra i mononucleati ed in particolare, tra linfociti e neutrofili con nucleo coartato, ed infine tra alcuni monociti e cellule epiteliali. Nella nostra esperienza, allo
scopo di evitare quanto sopra, abbiamo evitato di
considerare nella conta tutte le cellule la cui morfologia era dubbia. I risultati che abbiamo ottenuto dalla disamina dei lavaggi broncoalveolari sono
relativamente in linea con quelli riportati dalla letteratura corrente, sebbene le percentuali di IAD
da noi diagnosticate (67,1%) siano superiori a
quella di altri AA (Rush e Mair, 2004). Le differenze potrebbero derivare dal fatto che la nostra popolazione è rappresentata per lo più da trottatori
molto giovani.
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TABELLA 2
Media (X), deviazione standard (DS) e mediana (Med) della percentuale di macrofagi,
Em/er/m-e (emosiderofagi, eritrofagociti, o macrofagi contenenti cristalli di ematoidina),
linfociti, neutrofili ed eosinofili presenti nel BALF degli 82 cavalli esaminati
Macrofagi %
Em/er/m-e%
Linfociti %
Neutrofili %
Eosinofili %
X±DS
Med
X±DS
Med
X±DS
Med
X±DS
Med
X±DS
Med
IAD mista
60±14
60
–
–
28±17
30
15±11
12
1±1
1
IAD eosinofilia
55±15
60
–
–
24±9
28
15±17
10
9±5
8
RAO
44±7
43
–
–
15±11
10
40±16
49
1±1
1
EIPH
77±6
77
42±5
43
11±9
8
6±6
6
4±1
5
Normali
70±7
68
–
–
22±12
18
14±13
5
1±1
0
Inoltre, è interessante il fatto che le IAD di tipo
eosinofilico siano state osservate in un gruppo di
soggetti mediamente più giovane (2,87±1,46 anni)
rispetto a quello colpito da IAD mista (3,97±1,75
anni). Sebbene il numero esiguo di soggetti ci imponga prudenza nella valutazione di questo risultato, è ipotizzabile che la diversità nell’età di insorgenza tra IAD eosinofilica e mista sia espressione
di un insieme di fattori quali genetica, età di insorgenza della malattia, stadio evolutivo dell’affezione,
condizioni ambientali, allenamento, infezioni pregresse, presenza associata di emorragia polmonare, etc. (Holcombe et al., 2001; Hogdson e Hogson, 2002; Malikides e e Hogson, 2003; May et al.,
2007; Ramseyer et al., 2007).
L’età dei soggetti colpiti da EIPH è relativamente
più elevata di quelli affetti da IAD come riportato
da altri (Ferrucci et al., 2000; Doucet e Viel, 2002).
Interessante il fatto che in questo gruppo sia presente costantemente eosinofilia (4±1; normale:
<1%) mentre la percentuale dei neutrofili è risultata di poco oltre la norma. Slocombe (2000), in
cavalli sani della stessa età, a riposo da oltre 4 mesi dopo inoculazione per via endoscopica di sangue autologo intrabronchiale, ha ottenuto risultati
differenti: percentuale di eosinofili normale ed elevate percentuali di neutrofili. Probabilmente queste differenze sono imputabili al fatto che i risultati di Slocombe sono stati ottenuti in condizioni
sperimentali su cavalli sani esposti in una sola occasione al sangue, mentre nei nostri casi il quadro
infiammatorio associato all’emorragia era di natura cronica e frutto di ripetuti episodi di EIPH. Elevate percentuali di eosinofili in soggetti con EIPH
sono state rilevate anche da Doucet e Viel (2002)
in BAL e da AA nei preparati istologici di lobi caudo-dorsali (O’Callaghan, 1987a,b; Gunson et al.,
1988). Le ipotesi che avanzano questi Autori per
spiegare l’eosinofilia sono: a) la presenza di un
quadro infiammatorio preesistente di natura allergica e b) il quadro infiammatorio secondario all’EIPH permette una migliore penetrazione della
mucosa agli allergeni inalati, provocando anche
una risposta di tipo I. Gunson et al. (1988) ipotiz-
FOTO 8 - BAL 100X. Cluster di cellule epiteliali cilindriche, alcune delle quali ciliate, e quattro cellule mucipare riconoscibili per il contenuto di muco che assume
tonalità eosinofile.
FOTO 9 - BAL 100X. Cluster di cellule epiteliali cilindriche ciliate.
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zano inoltre che le metalloproteinasi liberate dagli
eosinofili partecipino al processo di degradazione
delle fibre collagene dei piccoli vasi arteriosi contribuendo così all’aggravamento nel tempo degli
episodi di EIPH.
Sebbene dato atteso, la quasi totalità dei cavalli
con età superiore a 9 anni ha presentato un quadro citologico compatibile con RAO (Foto 10, 11),
come riportato da altri (Couetil e Ward, 2003).
Infine, abbiamo osservato differenze rispetto ad
altri Autori (Hare et al., 1994;Viel 1997a,b; Ferrucci et al., 2000) nelle nostre percentuali relative ai
linfociti e mastociti che sono risultate in numero
costantemente inferiore. Questi dati appaiono di
difficile interpretazione soprattutto quello che
riguarda i linfociti; un’ipotesi potrebbe essere una
errata interpretazione di cellule polimorfonucleate o mononucleate come linfoidi, legata al
fatto che, soprattutto nei campioni ricchi di materiale mucoso, la coartazione cellulare crea indi-
16
scutibili problemi di lettura. L’utilizzo della citocentrifugazione per l’allestimento del vetrino e la
scelta di non includere nella conta le cellule dubbie, rappresentano a nostro avviso importanti accorgimenti per poter minimizzare l’errore interpretativo. Per quello che riguarda i mastociti, è
invece probabile che la colorazione rapida tipo
Romanowsky da noi usata non sia abbastanza
sensibile nell’individuare le mast cell, soprattutto
quelle con scarso contenuto di granuli (Palmieri
et al., 2003).
La nostra esperienza e le difficoltà incontrate nell’interpretazione dei risultati delle letture dei preparati citologici ci spingono a riflettere su alcuni
aspetti di questa interessante pratica:
– negli articoli riportati in bibliografia, i preparati
citologici sono stati allestiti con diverse metodiche e differenti coloranti. Inoltre non è chiaro
come debba essere interpretata la presenza di
cellule intrappolate nel muco tanto al fine della
FOTO 10 - BAL 100X. Neutrofili ipersegmentati e degenerati, ed abbondante muco sul fondo.
FOTO 12 - BAL 100X . Cellula multi-nucleata al centro, alcuni piccoli linfociti, eritrociti ed in basso muco recentemente prodotto.
FOTO 11 - BAL 20X. Spirale di Curshman in un soggetto affetto
da RAO.
FOTO 13 - BAL 100X. Grande cellula multi-nucleata.
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analisi al contacellule automatico che per la
conta differenziale. Pertanto crediamo che, per
dare ulteriore credibilità alla conta totale tramite contacellule automatico, debba essere considerata l’interferenza del muco che può intrappolare le cellule e non renderle disponibili per
la lettura. Per questo dovrebbe essere almeno
quantificata la concentrazione di muco, considerando anche che studi a tal proposito, ove il liquido è stato filtrato, hanno mostrato riduzione
consistente delle popolazioni cellulari (Nicholls
e Pirie, 2001a,b);
– pensiamo possa essere di utilità stabilire valori
di riferimento che considerino non solo la percentuale, ma anche il numero totale dei singoli
elementi cellulari, come per esempio viene fatto routinariamente nella conta differenziale dell’esame emocromocitometrico. Questo, a patto, che il prelievo di liquido sia quantitativamente rappresentativo di quello inoculato;
– in bibliografia non ci sono lavori in cui viene
presa in considerazione la morfologia cellulare, in particolare il grado di attivazione dei macrofagi con la presenza anche di cellule giganti
(Foto 12, 13), la reattività delle cellule linfoidi,
l’eventuale degenerazione dei polimorfonucleati. A nostro parere, queste valutazioni qualitative potrebbero aggiungere informazioni
importanti per l’interpretazione clinica del
quadro respiratorio.
In conclusione riteniamo che, nella valutazione
dei problemi polmonari delle vie profonde, i risultati del BAL debbano essere considerati quali
esami collaterali e quindi valutati insieme agli altri dati clinici. Considerando che queste affezioni
forniscono poche indicazioni cliniche sarebbe auspicabile una migliore raccolta dell’anamnesi re-
mota, ambientale e sportiva che purtroppo per
ragioni logistiche in ippologia non sempre è possibile ottenere.
RINGRAZIAMENTI
Gli Autori ringraziano la sig.ra Simona Rela per l’esecuzione dei preparati citologici.
Parole chiave
Cavallo, BAL, IAD, RAO, EIPH.
❚ Results obtained from balf
in a population of athletic horses
Summary
The aim of the present work was to evaluate the
results obtained from BAL collected from 82
competition horses.
Materials and methods - All the subjects, different in sex, breed and age, were submitted to
clinical exam, pleural ultrasound, endoscopy and
broncoalveolar lavage. Samples collected were
used for cell count and differential count (percentages of macrophages, lymphocytes, neutrophils, eosinophils and mast cells).
Results - IAD was diagnosed in 55/82 (67,1%),
RAO in 12/82 (14,6%), EIPH in 4/82 (4,9%), 11/82
(13,4%) horses were considered healthy.
Eosinophilic IAD has been diagnosed in subjects
aged 2,87±1,46; mixed IAD 3,97±1,75 aged; EIPH
4±1,41 aged and RAO 11,5±4,20 aged.
Key words
Horse, BAL, IAD, RAO, EIPH.
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In fase di accreditamento
Seminario SIVE
PRESENTE E FUTURO NELLA DIAGNOSI E TRATTAMENTO DELLE PATOLOGIE
ARTICOLARI DEL CAVALLO: INCONTRO CON WAYNE MCILLWRAITH
Bologna - Mercoledì 15 Settembre 2010
SPEAKER
WAYNE MCILLWRAITH (USA)
PROGRAMMA
8.30 Registrazione
9.00 Saluto del Presidente SIVE, presentazione del relatore
9.15 Advances in diagnosis of equine joint disease
Progressi nella diagnosi della malattia articolare negli equini
10.45 Coffee break
11.15 Identification of new targets for joint therapy and their relationship to treatment
L’identificazione di nuovi bersagli per la terapia articolare e loro relazione con il trattamento
12.15 New concepts in the treatment of subchondral bone cysts of the stifle and management of other traumatic lesions
of the stifle
Nuovi concetti nel trattamento delle cisti ossee sucondrali della grassella e gestione di altre lesioni traumatiche
della grassella
13.15 Lunch break
14.30 Current treatments ( conventional and biological) for equine joint disease
Terapie attuali (convenzionali e biologiche) per le malattie articolari negli equini
16.30 Discussione, valutazione dell’apprendimento e consegna degli attestati
17.30 Termine del seminario