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探討披覆銀之材料使用在體外固定裝置於體外 環境下之生物相容性及基因毒性研究 References: Silver coated materials for external fixation devices: in vitro biocompatibility and genotoxicity 學生：陳聖元 指導教授：郭聰源 報告日期：101年7月13號 1 大綱 一、研究動機 二、實驗步驟及方法 三、結果 四、討論 五、結論 2 一、研究動機(1/2) 由於細菌對環境有高適應性，及手術時鄰近組織會有機率受損，所以 使用外固定裝置後常發生骨針感染的問題 體外固定裝置(外固定)是使用骨針和線圈的方式，在遠離受傷部位的 地方，連結軟骨、骨髓和骨組織進行連鎖固定 使用全身性抗生素不能控制感染，抑制細菌附著和加強組織的生物相 容性才能達到抗菌的需要 3 一、研究動機(2/2) 銀能有效的降低細菌的繁殖能力，進而達到抗菌功能，多年來在醫療 方面已有安全、穩定的應用 在材料上包覆上銀，在體內或體外環境都能有效降低細菌繁殖能力和 骨針感染 銀擁有毒性(銀質沉著症)，若使用銀薄層和基材鍵結，不僅降低對人 體的毒性，同時也不會影響其抗菌功能 本實驗研究包覆銀的不銹鋼用在體外固定骨針上之生物相容性，與最 常被使用在外科手術上的未包覆銀的不銹鋼做比較來探討相容性，細 胞毒性和細胞基因影響 4 二、實驗步驟及方法 準備材料 細胞生成試驗 細胞毒性試驗 細胞相容性試驗 統計分析 5 二、實驗內容-準備材料 1.5cm 0.5cm的AISI 316L 不銹鋼釘 用80kV離子束沉澱汽化的銀形成薄膜 用SPI-ARGENTTM法把銀包覆在不銹鋼上 吸收量6*1017離子/cm2，深度150nm 加工時溫度不超過150°C 圖(一)離子束沈澱形成薄膜示意圖 PS. 1.加工時粗糙度因為與支架相同所以不予標示 2.使用鋼釘前，以160度C持續兩小時進行消毒 6 二、實驗內容-細胞生成試驗(1/2) 觀察姐妹單染色體交換(SCEs)的次數評估 肝素(從10人取得成3組)、RPMI 1640培養液、30%胎牛血清、10μg/ml 植物凝血素、100U/ml青黴素、50U/ml鏈黴素 溫度37度C培養72小時，培養經過24H時，在生成0.25mg/ml秋水仙鹼1 小時前加入溴，以防止細胞分裂 經過氯化鉀低壓處理後，使用甲醇3:醋酸1的比例使細胞固化，再以 1.5%吉薩姆染液染色觀察 7 二、實驗內容-細胞生成試驗(2/2) 經過紀錄各個培養中30個分裂的細胞後，每個培養皿中的著絲點都在 一個橫向的面上 增植率(PRI)的計算是由細胞的動態分析查看，由誘導有機體突變的物 質和致癌物質引起，為(M1+M2+M3)/100的值除以SCEs的頻率 微核試驗使用淋巴細胞的姐妹單染色體交換，在37°C培養72小時，在 經過44小時的培養後，加入細胞鬆弛劑(Cyt-B)使濃度達到6mg/ml，以 抑制細胞在第一次分裂時胞質細胞和雙核細胞的累積 經過低壓處理(一比一的0.56%氯化鉀和0.9%氯化鈉)後，在室溫下用甲 醇和醋酸3:1使細胞凝固，用0.5%Giemsa染色因為其雙細胞核的外觀 所以很好辨認 8 二、實驗內容-細胞毒性試驗(1/2) 為了要得到培養皿中急性細胞毒性的衍生物，所以由乳酸鹽脫氫酶 (LDH)的濃度來判斷，由人骨中進行酶隔離取得的單層類成骨細胞來 研究 將直徑3-5mm的微粒鋪在90mm的裝有0.2~0.6g的骨頭在每個培養皿中， 跟細菌膠原酶放在一起，並除去纖維母組織細胞以及無明顯特徵的成 骨細胞 骨細胞外加入10ml的ISCOVE’S培養液、20%的胎牛血清50U/ml的青 黴素、15mcg/ml的鏈黴素和2mM的穀胺流胺在37°C，95%空氣和5% 二氧化碳下培養 骨細胞使用成骨細胞形貌、鹼性磷酸酶測試和PTH的激素反應測定 9 二、實驗內容-細胞毒性試驗(2/2) APA反應在成骨細胞的呈現，是使用組織化學性的染色以達到顯像的 目的，該樣本使用3%中性福馬林固定30分鐘後，以PBS清洗三次， 37°C和bromochloroinoyl phosphere/nitro blue tetrazolium培養 進行量測前，以含有20mM胰蛋白酵素(EDTA)的PBS進行沖洗，40倍 率徠卡光學顯微鏡(Leica light microscope)觀察，在錐蟲染料排出試驗 中對於類成骨細胞能做到90-95%的再現率 細胞膜被破壞會釋放出浮在培養液表面的LDH，所以可以作為細胞毒 性的指標 陰性反應組未加入其它材料，而只進行成骨細胞的培養 陽性反應組加入有害的媒介(采酮0.05%)作為試劑 10 二、實驗內容-細胞相容性試驗(1/2) 細胞相容性是利用成纖維組織細胞和類成骨細胞的附著增植情況評估 第一次是使用培養6小時的NIH3T3細胞以5*104/cm3的量放在材料上生 物化學法測定定量的DNA，培養菌用PBS(1ml中加入0.05%的采酮 )沖 洗，再加入10 IU/ml的肝素和0.5ml的核醣核酸酶 在室溫下反應0.5~1小時之後再加入0.5毫升的溴化乙錠溶液 (0.025mg/ml的PBS) 所有的樣本都經由螢光光譜儀使用590nm的放射和362nm的刺激測定 11 二、實驗內容-細胞相容性試驗(2/2) 第二次的附著繁殖研究是用志願者的人骨細胞所分離出來的類成骨細 胞進行實驗，並挑選了細胞密度為5*104細胞/cm2的樣本來得到完整的 較長培養週期的培養菌，在匯合後細胞會自發的從基材分離出來。 成骨細胞的培養實驗為取樣六小時、兩天和四天的培養結果，分別使 用PBS洗滌，並在60°C情況下固定20分鍾和用0.025%的Acridine orange solution進行核酸染色 測定：用100倍、250倍和400倍螢光顯微鏡觀察細胞的數量、形貌和 生長情況 12 二、實驗內容-統計分析 SPSS軟體進行t測試，比較細胞毒性數據和細胞附著及增生數據 Wilcoxon符號排序檢定SCE頻率分析和微核試驗的結果 檢定某母群體中成對樣本統計量(中位數)的差異 13 三、結果 細胞生成結果 細胞毒性結果 細胞相容性結果 14 三、結果-細胞生成分析(1/2) 姐妹單染色體交換的數據包覆銀與跟未包覆銀的不銹鋼差不多，代表 在細胞生成上，是否包覆銀並不會影響結果 表(一)控制組、不銹鋼組、和包覆銀組的SCEs平均次數 15 三、結果-細胞生成分析(2/2) 比較控制組(無骨釘放置的淋巴細胞培養)，包覆銀的不銹鋼比較接近控制 組，而未包覆銀的組別和控制組的差別跟包覆銀組差距較大，顯示在加入 銀後，較不易影響到細胞的成長情形(細胞分裂週期) 表格(二)在控制組、未包覆銀不銹鋼、包覆銀的不銹鋼的細胞週期，M1表示一次分裂， M2則表示二次分裂，PRI則是增植率，為細胞生長的週期 16 三、結果-細胞毒性分析 細胞毒性的結果好壞決定於乳酸鹽脫氫酶(LDH)的量化數多寡，圖二 證明銀薄層不會明顯的增加毒性 細胞培養皿中都沒有NAD+的增加，表示在和有包覆和未包覆銀的情 況下成骨細胞膜都未遭破壞，較安全 圖(二)浮在放入成骨細胞的培養皿上LDH 當量值 17 三、結果-細胞相容性分析(1/2) 由纖維母組織細胞吸附的結果評估，細胞越多，生物相容性越好 未包覆銀的不銹鋼在經過6小時和2天可以看到其細胞擴散的速度緩慢， 而有包覆銀的試件則呈現大量的細胞數目 圖(三)人體骨小樑類成骨細胞在包覆銀和未包覆的 不銹鋼上，吸附(6小時)和繁殖(2天和4天)的結果 18 三、結果-細胞相容性分析(2/2) 螢光顯微鏡技術可以看到，和未包覆銀的不銹鋼較畸形的形狀比較， 有銀包覆的試件之成骨細胞較完整 (a)100倍率-披覆銀不銹鋼 (b)400倍率-披覆銀不銹鋼 (c)100倍率-未披覆銀不銹鋼 (d)400倍率-未披覆銀不銹鋼 (圖四)經由Acridine orange staining染色的人類骨小樑類成骨細胞，培養四天後經由螢光顯微鏡 (fluorescence microscope) 19 四、討論 跟不銹鋼比起來，圖二顯示銀既沒有細胞毒性也不會影響細胞基因， 是一個做為植入物較佳的材料 由淋巴細胞控制組的動態分析結果看來，包覆銀後的不銹鋼幾乎不會 造成細胞週期延遲，表示銀對細胞成長不會造成明顯的負面影響 即使在姐妹單染色體交換時與不銹鋼差不多(表一)，銀顯示材料和組 織良好的反應(圖三和圖四) 20 五、結論 銀是良好的抗菌材質，但卻含有毒性，現階段使用在醫療用植入物的 銀採用包覆或披覆薄層的方法避免其毒性卻不會影響到其抗菌性 包覆薄層銀的不銹鋼幾乎不會對細胞有毒性、基因和相容性有影響， 是可以用於接觸人體的生醫材料 有包覆銀的骨釘確實比未包覆銀的骨釘更適合使用在人體內 21