Transcript 下載/瀏覽Download

利用脂解酵素催化醇解反應進行三苯基丁酸甘油酯前驅藥合成
吳沛玲 張春生
南台科技大學 生物科技研究所
[93-2214-E-218-001-]
Time (hr)
4.4 外部質傳限制
結果如圖四所示，在攪拌系統下三苯基丁酸甘油
酯生成速率為115.2 mM h-1 g-1，而在無攪拌系統下三
苯基丁酸甘油酯生成速率只有67.4 mM h-1 g-1，證實在
醇解反應的過程中固定化酵素確實有外部質傳限制的存
在，可藉由攪拌系統降低外部質傳限制的影響。
0.4
,
0.2
0.0
0
延續前節所敘，結果如圖七所示，在反應初期25
小時使用分子篩密閉系統，此時已無水解副反應產生，
之後將真空度壓力持續往下降，在121小時將真空度降
至1 torr，此時三苯基丁酸甘油酯平衡轉化率可高達97%。
而若以苯基丁酸乙醇酯做基質進行醇解反應 ，於上述
相同條件下，其三苯基丁酸甘油酯轉化率與基質為苯基
丁酸三氟乙酯相似，再次證實即使基質改為苯基丁酸乙
醇酯進行醇解反應，藉由分子篩密閉系統與抽真空系統
也能有助於合成三苯基丁酸甘油酯。
X,tri
0.4
0.2
0.0
0
1.0
6. 參考文獻
[1]Anna, M. F., Patrick, A., Bo, M., 1996. Glyceride
synthesis in a solvent-free system. Jaocs. 73, 1489-1495.
[2]Brusilow, S W., 2000. Triglycerides and ethyl esters of
phenylalkanoic acid and phenylalkenoic acid useful in the
treatment of various disorders. US6083984.
(a)
(b)
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0.0
0.0
0
2
4
6
8
10
12
14
0
0
20
40
60
80
120
140
4
6
8
10
12
14
10
12
14
Time (hr)
1.0
(d)
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0.0
0.0
0
2
4
6
8
10
12
14
0
2
4
Time (hr)
6
8
Time (hr)
圖五. 在開放無溶劑系統下，酵素濃度對於甘油與苯基丁酸三
氟乙酯進行醇解反應中之不同酯類產物轉化率有何影響。甘
油1 mmole，苯基丁酸三氟乙酯3 mmole，常壓，有攪拌，反
應溫度為75℃，Novo 435 lipase分別為基質總重之(●)0.5%、
(○)1% 、 (▼)2% 、 (▽)3.6% 及 (■)4% 。 圖 (a) 為 phenylbutyric
acid 轉 化 率 ， 圖 (b) 為 monophenylbutyrate 轉 化 率 ， 圖 (c) 為
diphenylbutyrate轉化率，圖(d)為triphenylbutyrate轉化率。
Time (hr)
1.0
100
2
Time (hr)
Time (hr)
1.0
60
1.0
(c)
在開放無溶劑系統下，藉由Novo 435脂解酵素於最適
反應操作下催化甘油與苯基脂肪酸酯進行醇解反應，其
三苯基丁酸甘油酯平衡轉化率可達80%。於反應初期可
先利用分子篩密閉系統降低水含量抑制水解反應，再藉
由抽真空方式將副產物三氟乙醇移除，其三苯基丁酸甘
油酯平衡轉化率可達97%。
50
圖四. 在開放無溶劑系統下，有無攪拌對醇解反應中三苯基丁
酸甘油酯轉化率之影響。甘油1 mmole，苯基丁酸三氟乙酯3
mmole，Novo 435 lipase為基質總重之3.6％，常壓，反應溫度
為75℃。(●)表示無攪拌系統，(○)表示攪拌系統，轉速為600
rpm。
5. 結論
0
20
40
60
80
160
0.8
0.8
0.6
X,tri
0.4
0.20
0.20
0.15
0.4
0.15
0.2
,
0.10
X PFA
0.05
,
0.10
0.2
0.05
0.0
0
20
40
60
0.00
80
Time (hr)
0.0
0.00
20 40 60 80 100 120 140 160
0
Time (hr)
圖一. 在開放無溶劑系統下，醇解反應之反應溫度對三苯基丁酸甘油酯轉
化率之影響。甘油1 mmole，苯基丁酸三氟乙酯3 mmole，Novo 435
lipase為基質總重之3.6％，常壓，反應溫度分別為(●)60℃、(○)65℃、
(▼)70℃、(▽)75℃及(■)80℃。
圖六. 在無溶劑開放系統、密閉系統、分子篩密閉系統及分子篩
密閉系統無放分子篩四種不同的反應環境下，對醇解反應中三苯
基丁酸甘油酯轉化率之影響。甘油1 mmole，苯基丁酸三氟乙酯3
mmole，Novo 435 lipase為基質總重之3.6%，有攪拌，反應溫度
為75℃。(●)表示開放系統，(○)表示密閉系統，(▼)表示分子篩
密閉系統，(▽)表示分子篩密閉系統無分子篩之對照組。
Time (hr)
1.0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Time (hr)
1.2
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0.8
1.0
0.6
0.8
X,tri
0.20
X,tri
0.4
0.15
,
0.10
0.2
X PFA
0.6
0.10
0.08
0.4
0.06
0.05
,
4.1 最佳反應溫度
結果如圖一所示，當溫度從60℃升到75℃時，
三苯基丁酸甘油酯平衡轉化率會隨溫度而提升，但
當溫度上升至80℃時其平衡轉化率與75℃時相同，
因此可得之醇解反應之最適反應溫度為75℃；同時
比較水解副反應在不同反應溫度下之影響，當溫度
從60℃升到80℃時，其被水解成苯基丁酸的量是隨
溫度上升而降低的，表示在醇解反應裡，提高反應
溫度有助於水分移除，可有效降低水解副反應之發
生。
4.2 酯化反應與三氟乙酯及乙醇酯之醇解反應比較
結果如圖二所示，三者中以醇解反應之三氟
乙酯可得最高三苯基丁酸甘油酯生成速率及轉化率，
表示擁有三個氟原子之三氟乙酯確實具有活化酯之
特性，因為氟原子具拉電子之特性，可幫助苯基丁
酸三氟乙酯之酯鍵打斷，而苯基丁酸乙醇酯之酯鍵
則較不易被打斷，因此三苯基丁酸甘油酯生成速率
甚至比酯化反應還低。
4.3 基質間比例
結果如圖三所示，當甘油與苯基丁酸三氟乙酯之
莫耳比為1 / 3時，其三苯基丁酸甘油酯轉化率最
佳， ，隨著苯基丁酸三氟乙酯過量的增加，苯基
丁酸將被水解得更嚴重。因此在開放系統下，甘油
與苯基丁酸三氟乙酯之莫耳比為1 / 3時，最有利醇
解反應的進行，此時三苯基丁酸甘油酯轉化率可達
81%，但仍受水解副反應之影響。
40
Time (hr)
1.0
0.6
4. 結果與討論
30
X PFA
基 質 甘 油 (glycerol) 與 苯 基 丁 酸 三 氟 乙 酯 (2,2,2Trifluoroethyl phenylbutyrate)先加熱至60 ℃使其溶解混
合，之後加入Novo 435之固定化脂解酵素進行醇解反
應 之 催 化 ， 產 物 包 含 單 苯 基 丁 酸 甘 油 酯 (glyceryl
monophenylbutyrate) 、 雙 苯 基 丁 酸 甘 油 酯 (glyceryl
diphenylbutyrate) 、 三 苯 基 丁 酸 甘 油 酯 (glyceryl
triphenylbutyrate)、苯基丁酸（phenylbutyric acid）及
三氟乙醇。
HPLC分析管柱使用RP-8 column；UV波長為216
nm；內標物為2-Nitrotoluene；流動相A為acetonitrile：
H2O ( 0.01% trifluoroacetic acid ) ＝ 65：35 ( v/v )；流
動相B為acetonitrile。
20
X PFA
3. 研究方法
10
X,mono
4.7 結合分子篩密閉系統與抽真空系統對副產物移除之
影響
0.6
X,tri
Scheme 1
0.0
80
60
0.8
X,di
R = CF3CH2n=2
40
圖三. 在開放無溶劑系統下，醇解反應之基質間比例對三苯基丁
酸甘油酯轉化率之影響。甘油分別為1 mmole、0.75 mmole、0.6
mmole、0.5 mmole，苯基丁酸三氟乙酯3 mmole，Novo 435
lipase為基質總重之3.6％，常壓，反應溫度為75℃。(●)醇 / 酯
＝1 / 3，(○)醇 / 酯＝1 / 4，(▼)醇 / 酯＝1 / 5，(▽)醇 /酯＝1 / 6。
X,PFA
結果如圖六所示，開放系統下，可得最高三苯基
丁酸甘油酯轉化率78%，但有10%會被水解成苯基丁酸，
表示開放系統雖可較順利移除三氟乙醇，但卻無法有效
抑制水解副反應之發生。密閉系統下，三苯基丁酸甘油
酯轉化率最低僅有41%，且有7%會被水解成苯基丁酸，
因為密閉環境下副產物三氟乙醇及水分都無法移除，導
致反應無法向右進行。另外分子篩不具有移除三氟乙醇
之作用，但卻可藉由分子篩除水能力，有效抑制水解副
反應之發生，因此藉此特性可在反應初期先利用分子篩
密閉系統抑制水解反應，再藉由抽真空方式將副產物三
氟乙醇移除以提高三苯基丁酸甘油酯轉化率。
+ 3R-OH
CH2O ___C (CH2)n CH2
20
Time (hr)
O
CH2OH
0.3
X,tri
C (CH2)n CH2
0.4
1.0
O
CHO
0.6
4.6 比較開放系統、密閉系統及分子篩密閉系統對副產
物移除之影響
CH2O___C (CH2)n CH2
____
80
0.2
結果如圖五所示，不同酵素濃度下，其水解成苯
基丁酸最大轉化率為20%；單苯基丁酸甘油酯轉化率則
皆低於6%；隨著酵素濃度增加，雙苯基丁酸甘油酯下
降速率愈快，且三苯基丁酸甘油酯反應生成速率也隨之
增加，此時可得最適酵素濃度為3.6%，若將酵素濃度增
加為4%時，其三苯基丁酸甘油酯反應生成速率已不再
提升。
O
lipase
60
0.1
苯基脂肪酸之苯基乙酯(phenylacetate)與苯基丁
酯(phenylbutyrate)可治療尿素循環失調 、腫瘤與癌
症 、血紅素病 及 預防老化。此種藥物療效取決於在
體內是否能長期維持在藥物之最低有效濃度，但此
類藥物代謝很快。以三酸甘油酯方式進行投藥可延
長體內藥物之半生期，能提高體內有效藥物濃度，
可減少投藥劑量，且甘油本身即為生物體代謝之正
常產物。文獻中指出三酸甘油酯若用化學法合成產
率偏低且純化較複雜，而以脂解酵素催化進行合成，
則可克服化學法的問題[1] ，在最近十幾年來已是一
個趨勢，尤其在食品添加劑及油脂改質有許多應用，
但傳統之化學合成要將甘油上的三個羥基完全酯化，
由於有立體障礙之存在，所以相當困難。因此利用
生物觸媒特性及酵素之特異性嘗試進行生物轉換。
苯基脂肪酸如苯基乙酸、苯基丁酸之三酸甘油酯，
由Brusilow於2000年獲得以三芳香族脂肪酸甘油酯前
驅藥用於治療上述提過疾病之美國專利[2]，經進一
步文獻及專利資料庫調查發現並無相關此類前驅藥
物之製程研究，因此本計畫將利用脂解酵素催化甘
油與苯基丁酯進行醇解反應，進而合成三苯基脂肪
酸甘油酯前驅藥，如Scheme 1，且因醇解反應所得
副產物為短碳鏈醇類，比酯化反應副產物水分之沸
點還低，希望藉此特點讓反應速率加快，並使反應
有利向產物形成方向進行。
O
CHOH + R OC (CH2)n CH2
40
0.8
4.5 固定化酵素濃度
2. 前言
CH2OH
20
X,tri
利用Candida antarctica脂解酵素催化醇解反應
進行三苯基脂肪酸甘油酯前驅藥合成。在開放無溶
劑系統下，於反應溫度75℃，甘油與苯基丁酸三氟
乙酯莫耳比為1 / 3，酵素濃度為3.6%之最適反應條
件下，催化甘油與苯基脂肪酸酯進行醇解反應，其
三苯基丁酸甘油酯平衡轉化率可達80%。於反應初
期可先利用分子篩密閉系統降低水含量抑制水解反
應，再藉由抽真空方式將副產物三氟乙醇移除，其
三苯基丁酸甘油酯平衡轉化率可高達97%。
0
X PFA
1.摘要
1.0
0.0
0
40
80
120
0.00
160
Time (hr)
0.04
0.2
0.02
0.0
0
40
80
120
160
0.00
200
Time (hr)
圖二. 在開放無溶劑系統下，酯化反應與醇解反應之苯基丁酸三氟乙酯
及苯基丁酸乙醇酯對三苯基丁酸甘油酯轉化率之影響。酯化反應之甘
油1 mmole，苯基丁酸3 mmole，Novo 435 lipase為基質總重之10％；醇
解反應之甘油1 mmole，苯基丁酸三氟乙酯及苯基丁酸乙醇酯分別為3
mmole，Novo 435 lipase為基質總重之3.6％，常壓，反應溫度為65℃。
(●)表示酯化反應，(○)表示醇解反應，酯類基質為苯基丁酸三氟乙酯，
(▼)表示醇解反應，酯類基質為苯基丁酸乙醇酯。
圖七. 在無溶劑分子篩密閉系統與抽真空系統下，對醇解反應中三
苯基丁酸甘油酯轉化率之影響。甘油1 mmole，苯基丁酸三氟乙酯3
mmole或苯基丁酸乙醇酯3 mmole，Novo 435 lipase為基質總重之
3.6%，有攪拌，反應溫度為75℃。0 ~ 25小時為分子篩密閉系統，
25 ~ 97小時真空度壓力為200 torr，97 ~ 121小時真空度壓力降為100
torr，121 ~ 168小時真空度壓力降至1 torr。(●)表示基質為苯基丁酸
三氟乙酯，(○)表示基質為苯基丁酸乙醇酯。