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含銅赤血鹽及白金奈米粉粒修飾平板式酵素電極應用於電流式生醫感測器之製作 The Preparation of the Screen Printed Planar Enzyme Electrode Modified by Copper(Ⅱ) Hexacyanoferrate and Platinum Nanoparticles and Its Application to Amperometric Biosensors 許文嘉、胡真熏、林浩 南台科技大學化學工程與材料工程系 摘要： 本研究中利用含銅赤血鹽(copper hexacyanoferrate, CuHCF)對於過氧化氫具有催化還原的能力，乃將含銅赤血鹽與碳粉及油墨混合製成碳糊電極(carbon paste electrodes, CPEs)，實際進行偵測過氧化 氫。此外，在碳糊中添加白金奈米粉粒，藉以增加碳糊電極對於過氧化氫的催化能力與電極導電性。經含銅赤血鹽修飾後的碳糊電極其靈敏度為176.40 µA/cm2．mM，而添加奈米白金粉粒的碳糊電 極其靈敏度為327.95 µA/cm2．mM H2O2，其電流應答提升約1倍。由實驗最佳組成做為製作酵素電極的條件，利用網板印刷技術印製平版式電極，並以網狀高分子Nafion將葡萄糖氧化酵素固定於平 版式電極上所製作之平版式酵素電極其偵測極限為 0.05 mM Glucose，線性範圍為 0.05~ 1.5 mM Glucose，相關係數為 0.9957，靈敏度為1.97 µA/cm2．mM Glucose。將酵素電極在乾燥狀態下存放於 4℃的冰箱中，3天後，其催化活性會快速下降，存放6天後，其催化活性只剩下42％。 結果與圖表： 前言： 近年來國人在飲食中經常營養攝取不均，導致因慢性病而死亡的人數日漸攀升，使得各類 慢性疾病漸漸進入我國十大死因的排名內，各種慢性病中又以糖尿病為國人高罹患率之疾病。 生醫感測器可應用於慢性病如糖尿病[1]、痛風、血脂症等病患的各種生理物質之檢測。可藉著 包埋各種不同酵素而具有偵測各對應生化物質之專一性，亦可製作成小型偵測儀器，具有操作 簡便快速、較經濟、不需貴重儀器、且因小型化而具有可攜帶性，因此可以隨時隨地做分析檢 測，提供慢性病患長期自我監測的需求，以便隨時掌握病情。 由文獻得知在含鐵、含鈷、含鎳、含銅等四種金屬赤血鹽中以含銅赤血鹽對 H2O2 催化還 原效果極具潛力[2~6]，且在弱鹼性溶液中之穩定度較佳[2, 3]，故在此研究中採用含銅赤血鹽來修 飾碳糊電極。又因金屬具有良好的導電性及催化性能，如果將金屬粉粒奈米化，則可使金屬粒 子之催化效果大大增加，故以還原法製得奈米白金粉粒，用以修飾碳糊電極並藉以偵測過氧化 圖1：利用TEM觀察由還原法製得之奈米白金粉粒,最小可 達 8 nm 氫的電流應答及靈敏度。利用網板印刷技術所印製的電極具可拋棄性、價格低、大量製作、方 便攜帶和多重設計變化的優點。將葡萄糖氧化酵素固定於網印電極上，即可製成平板式酵素電 極。則葡萄糖與氧氣藉由葡萄糖氧化酵素之催化可產生過氧化氫，再經由催化還原過氧化氫所 圖2：a 電極(未添加奈米白金粉粒)與 b 電極(添加奈米白金 粉粒)在 4 mL 0.05M 之 PBS 中, pH=7.4, 30℃, 偵測電位 0.2 V(vs. Ag/AgCl), 攪拌速率500 rpm 下操作, 以 Time-Base 模式, 每100 秒注入10 μL 100 mM H2O2之 TB 圖 產生之電流應答即可推算出葡萄糖之含量。此外可藉由改變固定於電極上的酵素，製成各種生 醫感測器，用以偵測各種對應生化物質。 實驗步驟： 1.5 mM Cu(Ⅱ)HCF 粉末製備： 0.09 M CuSO4 溶液 50 mL 離心並去除 上層液 乾燥 重複離心與清除上層 液步驟（三次） Cu(Ⅱ) HCF 粉末 0.06 M 赤血鹽 溶液 50 mL 白金奈米粒子的製備： 圖3：以 Nafion 固定葡萄糖氧化酵素於經奈米白金粒子與 含銅赤血鹽修飾的網印電極上, 於 pH 7.4之 0.05 M 4 mL 磷 酸鹽緩衝溶液(PBS)中, 偵測電位 -200 mV(vs. Ag/AgCl), 攪 拌速率 500 rpm, T=30℃, 每隔 100 秒加入不同量之 100 mM 的葡萄糖溶液之 TB 圖 加入乙二醇溶液至 50 ml 圖4：以 Nafion 固定葡萄糖氧化酵素於經奈米白金粒子與 含銅赤血鹽修飾的網印電極上, 於 pH 7.4之 0.05 M 4 mL 磷 酸鹽緩衝溶液(PBS)中, 偵測電位 -200 mV(vs. Ag/AgCl), 攪 拌速率 500 rpm, T=30℃, 每隔 100 秒加入 10 µL 之 100 mM 的葡萄糖溶液之 TB 圖 0.1317M H2PtCl6 1mL 減壓乾燥 混合 白金奈米粒子 100 µL 6.5 10 µL 100 mM mM 葡萄糖溶液 普拿疼溶液 加入乙二醇溶液至 50 ml 0.158 M NaOH 1ml 3天 200 µL 3 mM 10 µL 50 mM 尿酸溶液 維他命C溶液 10 µL 100 mM 葡萄糖溶液 N2H4 0.25g 平板式酵素電極之製備： 1. 將含銅赤血鹽粉體、碳粉即奈米 2. 將碳糊塗佈於網板上 白金粒子以 3 : 7 : 0.5 之重量比例與 印刷油墨混合，混合完全後即成碳 糊。 含銅赤 血鹽 碳粉 A 粉 取適量 A粉 之前端。 加 入 適 量 油 墨 42％ 3. 將 PE 塑膠紙放置於網板 下，利用塑膠板於網板上 來回印刷，將碳糊印製在 PE 塑膠紙上。 圖5：以 Nafion 固定葡萄糖氧化酵素於經奈米白金粒子與 含銅赤血鹽修飾的網印電極上, 於 pH 7.4之 0.05 M 4 mL 磷 酸鹽緩衝溶液(PBS)中, 偵測電位 -200 mV(vs. Ag/AgCl), 攪 拌速率 500 rpm, T=30℃, 之干擾側試圖 圖6：平板式酵素電極存放天數與電流應答之關係圖 結論： 由實驗結果顯示在碳糊電極的製作中，可藉由添加奈米化的白金粒子來增強電流應答。以 奈米白金 粉粒 Nafion 固定 GOD 於網印電極上可用來偵測葡萄糖，且可隔絕普拿疼與尿酸的干擾，但未能完全隔絕 掉維他命 C 的干擾，可能是因為維他命 C 與葡萄糖的分子大小相當接近所致，且電極之生命期只有 4. 最後取出印有碳糊的 PE 塑膠紙， 並剪裁至合適大小，即可獲得網印 電極。 6 天，目前正尋找能延長平板式酵素電極之生命期的方法與能利用於網印技術的酵素固定法。 將 2μL 的 酵素溶液 步 均勻塗佈 驟 ㄧ 於電極的 一端並風 乾之 步 驟 二 利用 5μL 的 Nafion 將酵素 固定於 電極的 一端 平 板 式 酵 素 電 極 參考文獻： 1.吳易聰, 淡江大學化學研究所碩士論文, 1996。 2.Wang, j. ; Zhang, X.; Prakash, M., Anal. Chim. Acta, 1999, Vol.395, pp.11-16. 3.Garjonyte, R. ; Malinauskas, A. , Sensor and Actuators B, 1998, Vol.46, pp.236-241. 4.Chen, S-M ; J., Electroanal. Chem., 2002, Vol.521, pp.29-52. 5.Peung, C. Y. ; Chang, L. C. ; Li, C. H.,“Electrocatalytic Reactions of Hydrogen Peroxide at Carbon Paste Electrodes Modified by Nanostructured Cobalt Hexacyanoferrate”, 2003 International Symposium on Nano Scienceand Technology, 2003, pp.63-64