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烟草基因组中NBS类抗性基
因的分析
专
业
作
物
学
答 辩 人
冷 晓
东
指导教师
樊龙江教授
综
述
• 烟草是一种重要的经济作物，烟草行业一方面能够为国家
增加税收，同时对发展国民经济和满足人民生活需要，都
起了重大的作用。
• 烟草作为模式植物，对于植物科学发展来说，无论是在基
础研究还是在应用方面都起了很大作用，尤其是在遗传、
育种、生理、生化以及采收后代谢方面。
• 烟草也是研究植物病原互作最好的模式作物之一。抗性基
因在植物与病原互作过程中，起到非常重要的作用。所以
对抗性基因的研究，无论对植物本身，还是对指导育种都
有非常重要的意义。
• 在烟草基因组测序的背景下，我们对烟草抗性基因进行了
一些基础性的研究。
研究过程
烟草基因组的分析
(基于TGI基因组序列)
NBS类抗性基因的
生物信息学分析
烟草NBS类抗性基因
遗传多态性分析
NBS类抗性
基因家族分析
与抗性基因连锁的
SSR分子标记的开发
关于TGI（Tobacco Genome Initiative
http://tgi.ncsu.edu/）
数据类型
经甲基化筛选的克
隆序列
条数/平均长度
1,082,523
(5 files)
682.2bp
16885+25023
未经筛选的克隆序 =41908
列
746.2+682.3bp
BAC克隆末端序列
BAC序列
合计
1628
360.7bp
140,156
(93 BACs)
726.9bp
1,266,215
累计长度（Mb） 占基因组比例
738.5
16.4％
12.6+17.1=29.7
0.7%
0.587
101.9
2.3％
870.7
19.3％
拼接去冗余后信息
数据类型
经甲基化筛选的克
隆序列
未经筛选的克隆序
列
BAC克隆末端序列
序列条数/平均长度
465433
984.9bp
10777+13912
927.8+926.1bp
647
432.1bp
占基因组 覆 盖 功 能 基 因 基因密度（个
数量（Mb）
比例
（比例）&
/Mb）
<458.4Mb
<10.2％
10.0+12.9
=22.9Mb
<0.5%
0.28Mb
3,285 (92BACs)
3047.2bp
10.0Mb
BAC序列（5X覆盖）
35.7contigs per BACs;
108.7kb per BAC
合计
494054
<491.2Mb
2387（18.1％）
（ 包 括 BAC 序 列 ）
20
5.10
0.87
1
0.2％
<10.9%
/
<2408(<18.2%)
/
所有数据来源
基因组序列：TGI
EST序列：TGI
Genebank
ESTobacco (European Sequencing of Tobacco
Project http://www.estobacco.info/)
TAB (Transcriptome Analysis of BY-2，
http://mrg.psc.riken.go.jp/strc/)
RGA（ Reistance gene analogue）的背景介绍
Representative gene
PK
I
II
III
IV
V
Pto
LZ/CC
NBS
LRR
TIR
NBS
LRR
TM
LRR
TM
LRR
Mi/Prf
N
Cf4/Cf9
PK
Xa21
分析流程
已知的NBS抗
性基因
同源
序列
搜索
系统
发育
树
清理
拼接
寻找
结构
域
基因
预测
蛋白
预测
已知的NBS类抗性基因
Class
motif
R
gene
RPS2
Plant
Pathigen
Avr gene
Accession
LZ-NBS-LRR
CC NB-ARC LRR5
Arabidopsis
thaliana
avrRpt2
Q42484，
P49597
RPP1
LZ-NBS-LRR
TIR NB-ARC
LRR9
CC NB-ARC LRR2
LZ-NBS-LRR
NB-ARC
RPP1
3
Arabidopsis
thaliana
Arabidopsis
thaliana
Arabidopsis
thaliana
Pseudomonas
syringae pv.tomato
& maculicola
Peranospora
parasitica
Peranospora
parasitica
Peranospora
parasitica
LZ-NBS-LRR
LZ-NBS-LRR
NB-ARC LRR5
RPM
1
Arabidopsis
thaliana
avrB,avrRp
ml
TIR-NBSLRR
TIR-NBSLRR
LZ- NBSLRR
TIR NB-ARC
LRR7
TIR NB-ARC
LRR9
CC NB-ARC LRR4
RPS4
Arabidopsis
thaliana
Arabidopsis
thaliana
Arabidopsis
thaliana
NBS-LRR
NB-ARC
Bs2
Capsicum
annuum
CC-NBS-LRR
Mla1
Hordeum vulgare
TIR NB-ARC
L6
Linum
usitatissimum
Pseudomonas
syringae
pv.maculitola
Pseudomonas
syringae
Peranospora
parasitica
Pseudomonas
syringae,Peranospor
a parasitica
Xanthomonas
campestris
pv.resicatoria
Erysiphe graminis
f.sp.hordei
Melampsora lini
TIR-NBSLRR
RPP8
RPP5
RPS5
AAC72979，
AAC83165，
Q9M667，
T51185，
AAF42832，
CAA61131
avrRps4
CAB53785，
avrRp5
AAF08790
avrRphB
Q8L3R3，
avrBs2
CAC32382,
AAG37356
AL6
Q40253,
Q40254
TIR-NBSLRR
LZ-NBS-LRR
TIR NB-ARC
LRR5
NB-ARC LRR3
M
LZ-NBS-LRR
NB-ARC
Prf
LZ-NBS-LRR
NB-ARC LRR2
Mi
NBS-LRR
CC NB-ARC
LRR11
NB-ARC
I2C-1
N
NBS-LRR
TIR NB-ARC
LRR8
CC NB-ARC
LRR10
NB-ARC2 LRR2
NBS-LRR
NBS-LRR
NBS-LRR
CC NB-ARC
NBS-LRR
TIR-NBSLRR
NBS-LRR
Linum
usitatissimum
Lycopersicon
esculentum
Lycopersicon
esculentum
Lycopersicon
esculentum
Melampsora lini
AM
Tomato virus X
PVX
Pseudomanas
syringae pv.tomato
Meloidogyne
javanica
avrPto
Fusarium oxysporum
unknown
Xal
Lycopersicon
esculentum
Lycopersicon
esculentum
Nicotiana
tabacum
Oryza sativa
Pib
Oryza sativa
Pi-ta
Cre3
Oryza sativa
Triticum
aestivum
Arabidopsis
thaliana
Arabidopsis
thaliana
Lycopersicon
esculentum
Rx2
Sw-5
LZ-NBS-LRR
RPP4
LZ-NBS-LRR
CC-NBS-LRR
RPM
1
I2
NBS-LRR
I2C-2
I2C-3
R
Lycopersicon
esculentum
Lycopersicon
esculentum
Vigna mungo
Tomato spotted silt
virus(TSWV)
Tobacco Masaic
Virus
Xanthomonas
oryzae pv.oryzae
Magnaporthe grisea
unknown
AAB47618
,
CAB56299
,
AAC49408
AAC67238
,
AAC67237
,
AAC32252
AAB63274
AAG31013
TMV
Q40392
avrXoo
O48647
BAA76281
,
AAK00132
AAC05834
Magnaporthe grisea
Heterodera avenae
AAM1846
2
Q39214
Pseudomonas
syringae
Fusarium oxysporum
f. sp. lycopersici race
2
Fusarium oxysporum
unknown
AAB63275
Fusarium oxysporum
unknown
AAB63276
AAD27815
AAQ75745
烟草基因组中鉴定出的NBS类基因结果统计
Data
Source
Intact
Species
Cultivar/Type
Partial
Seq.No.(Mb)
Cluster
Reads
Cluster
30
2349
14
549
14,475 (7.6)
0
0
3
4
Genome
TGI DNA
N.tabacum
Hicks
broadleaf
EST
TGI
N.tabacum
Hicks
broadleaf
N.tabacum
Flue-cured
(K326), Burley
(Burley 21 and
TN86)
46,546 (30.4)
0
0
2
2
N.tabacum
Bright-Yellow
No.2(BY-2
cells)
18,851 (9.3)
0
0
2
2
ESTobacco
TAB
1,441,358
(807.4)
Reads
烟草基因组中30个NBS类基因的分类
Structure
Number
Average CDS
length (bp)
No. with EST hits
CC-NBS-LRR
11
2,779
8
TIR-NBS-LRR
1
2,604
1
TIR-NBS
2
1,536
1
NBS-LRR
7
2,554
6
NBS
9
1,612
1
Total
30
2,288
16
烟草和其他植物间NBS类基因的系统发育关系
蓝色，绿色，紫色和黄色分别代表烟草，拟南芥，番茄和杨树
实验部分
直接测
序
30对引物
24个材料
遗传多
态性分
析
PCR扩
增产物
克隆测
序
基因家族
系统进化
分析
本研究使用的烟草材料
品种名称
（野生为物种名）
杂交组合
长脖黄
类型
黑胫病
青枯病
烤烟
感病
感病
根结线虫
病
CMV
烟蚜
样品类型
原产地
地方品
种
选育
国外
河南
云南
云南
山东
美国
小黄金1025
Speight G-28
小黄金系选
(Oxford 1181×Coker139)F4
×NC95
烤烟
烤烟
感病
中抗
感病
感病
中感
抗病
高感
抗虫
抗虫
红花大金元
云烟87
大白筋599
Coker176
大金元系选
云烟2号×K326
大白筋系选
(Coker258×(6110×Coker319)×Co
ker258×(Coker139
×5984))×(Coker258×(
6110×Coker319)×Co
ker258×(Coker139
×59-84))DWARF
烤烟
烤烟
烤烟
烤烟
中感
中感
中感
中抗
感病
中抗
中抗
高感
中抗
中抗
中抗
中感
中抗
中感
高感
高感
选育
选育
选育
国外
野生
烤烟
烤烟
烤烟
感病
抗病
中感
中感
感病
抗病
感病
感病
中感
中抗
抗虫
中抗
国外
国外
选育
国外
墨西哥
美国
河南
美国
国外
美国
N.repanda
Coker371-Gold
净叶黄
K326
T.I.245
长脖黄系选
McNair225×(McNai
r30×NC95)
烤烟
抗病
中感
抗病
山东
美国
Ambalema
Beinhart 1000-1
晒烟
雪茄
中感
抗病
感病
感病
中抗
中感
感病
高感
国外
国外
美国
美国
TI
Florida 301
C151
N.plumbaginifolia
晒烟
雪茄
烤烟
野生
中抗
抗病
感病
感病
感病
感病
感病
高感
抗病
感病
中感
国外
国外
选育
国外
国外
美国
广东
阿根廷
烤烟
烤烟
感病
中感
中抗
中感
抗病
感病
感虫
感虫
国外
国外
美国
美国
K346
N.undulata
N.glutinosa
N.sylvestris
Hicks(Broad Leaf)
烤烟
野生
野生
野生
烤烟
抗病
抗病
抗病
感病
感病
感病
中抗
中感
感病
中感
感虫
国外
国外
国外
国外
国外
美国
秘鲁
秘鲁
阿根廷北部
美国
Komotini Basma
香料
香料
国外
国外
土耳其
土耳其
samsun
burley 21
TN86
白肋
白肋
白肋
国外
国外
国外
阿尔巴尼亚
德国
美国
Coker 86
NC82
Ti245×75-81
6129×Coker319
耐病
感病
感病
感病
感病
感病
中感
感病
注：抗性等信息来自中国作物种质信息网（http://icgr.caas.net.cn）
中抗
中感
高感
引物设计位点
植物抗性基因结构和本研究引物设计位点。图中标出了NBS功能域三个主要基序
和C-和N-端通常具有的功能域，箭头为本研究引物设计位点
本研究设计的30对烟草RGA引物
引物名称
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
序列(5'to3')
碱基数
133_nbs_F
TCTTCTTACTTCCCAATACCGTAG
24
133_nbs_R
CCTTCATCACTTCCTCTTCATCC
23
141_nbs_F
GATCGTTGACCAAATTTCCAAG
22
141_nbs_R
CAACTCTTGAGAACTTGCATGATG
24
147_nbs_F
GCAATCCACAACTGAATGACTTG
23
147_nbs_R
TGGAAAAGCAAATTGGTAGGC
21
148_nbs_F
GGCAAATGCTTATAGCTATGCTC
23
148_nbs_R
CAGAGGTACCAAAGATCCAGC
21
155_nbs_F
TGGTAAACAAGAAACTAGAGGACC
24
155_nbs_R
GACCATTAGCAATCCACAACTG
22
162_nbs_F
GACATGTTGAAGATCACCCGG
21
162_nbs_R
GCCTTTGTGACATGGTTTGAC
21
173_nbs_F
ATCAAGCACAGTCCGAACAAC
21
173_nbs_R
CTCCTGAGCATTGTTGATAAGC
22
178_nbs_F
CGATTCAACTATATCCATGCAACC
24
178_nbs_R
CCCATTGCTTATCCTTCTAGTTTC
24
182_nbs_F
AAGGCGCATGCAATATCGAGG
21
182_nbs_R
TCATCCCACTGTGTTATGTCTTGG
24
191_nbs_F
CTGAAACCAATTATAGACATGCCC
24
191_nbs_R
CACTGTGGTACAAAGTTCATTGG
23
209_nbs_F
GGTGATCCGATAAATGGTCATAAC
24
209_nbs_R
TTCTTGTCAGAGATCATGGTCTC
23
224_nbs_F
AGTGGTCGAGGTTGACTTAGTATC
24
224_nbs_R
GGCTTAAGATGACATGGTAAATCC
24
226_nbs_F
GGCAATTCAAAACAAGCTCAAG
22
226_nbs_R
TGCATTGGACATTAACCTCTG
21
228_nbs_F
GGAGAAGTTGGAAGGCACCAC
21
228_nbs_R
CGGGAAGATCATTGTAGCTCAAC
23
265_nbs_F
CATGAAGATTCAACACAAAGGC
22
265_nbs_R
CCCAAGTACATGCAAACATTG
21
267_nbs_F
CAGCAAATTGGTTGTCTTGGC
21
267_nbs_R
AACATCAACGCTGGTAATATGC
22
270_nbs_F
CTCCTAAGCATTTATCTGGATGAC
24
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
271_nbs_F
GTCCTCTCTGGTGCCTTGAG
20
271_nbs_R
CACACGGTCCTCTAAAAATGC
21
329_nbs_F
GCTGAGCTGCTTAACAATTTCTTC
24
329_nbs_R
CATCGACAGGATTTCTGGTTAC
22
334_nbs_F
AAGGAGAAGTTGGAAGGCACC
21
334_nbs_R
GTAGCTCAACATTAACGCCGG
21
345_nbs_F
TCGAGGAACAGATTCTGTACATC
23
345_nbs_R
CAATCCAATTTTCAGGTGTGAGTC
24
358_nbs_F
CTTCTTGTTGTGAACTCTCCCAG
23
358_nbs_R
GGCTTGAGGTGATTAGATAGATGG
24
359_nbs_F
GAATCCAATCACAGACATGGTC
22
359_nbs_R
CACTCTGGTACAAAGTTCTTTGG
23
374_nbs_F
CTCTATCATAGCCTTTGCGTCAC
23
374_nbs_R
GAAGAAAACACCTGCAGTTGAC
22
383_nbs_F
GCAATGCAATGAACACTGACATAG
24
383_nbs_R
TCCACAACCATGTCAACTTTG
21
390_nbs_F
CAGCAACAACTTATTTACCTCCC
23
390_nbs_R
CCACCCAAATTCTAATCAACG
21
391_nbs_F
TCAACAACTGACATGGACGTAG
22
391_nbs_R
TACCTTCATGCTCTGCTCTCC
21
410_nbs_F
CTCTTTTGTATCGATTAGTCCCTC
24
410_nbs_R
GGATCTGCCTATGTGTTAAACTTC
24
414_nbs_F
GCAATCTTCTCTCCCTTTCCC
21
414_nbs_R
TGGGCTCTAATCCATCATAACTG
23
TGAACAAGTTGGGCCATGTA
20
GGTTCTCTTCGTTTCCCCTTA
21
30
30R
PCR产物直接测序鉴定的烟草RGA基因
基因
NBS133
NBS148
NBS270
NBS162
NBS265
NBS390
NBS391
NBS30
NBS155
NBS191
NBS414
NBS209
NBS228
NBS147
NBS358
NBS224
NBS410
NBS383
NBS141
合计
栽培品种数
21
21
9
8
8
6
6
5
4
3
3
4
3
4
1
2
2
2
2
114
野生种数
2
3
1
2
2
2
2
2
1
1
1
19
得到如下遗传多态性分析结论：
1、栽培与野生烟草之间存在明显的遗传多态
性
栽培烟草与其野生祖先种（N.sylvestris）
之间的分子多态性
个数
基因位点
栽培品种数量
密度（个数/Kb）
长度(bp)
SNP
INDEL
SNP
INDEL
NBS133
21
730
36
8（75）
49.3
11.0（102.7）
NBS162
8
879
52
3（6）
59.2
3.4（6.8）
NBS390
6
597
23
0
38.5
0（0）
NBS155
4
824
94
2（7）
114.1
2.4（8.5）
65.3
4.2（29.5）
平均值
9.8
757.5
注：括号中为累计长度（bp）
51.3
3.3（22）
2、栽培烟草RGA基因的遗传多态性表现出极端的同质性
克隆测序鉴定的烟草RGA基因家族
基因家族
基因组
特异克隆
克隆测序总数
NBS226
Coker176
14
15
NBS271
HHDJY
Shamxun
16
11
21
15
NBS173
NBS374
NBS329
NBS345
NBS359
NBS334
NBS267
NBS182
NBS178
HHDJY
HHDJY
HHDJY
HHDJY
HHDJY
HHDJY
HHDJY
HHDJY
HHDJY
HHDJY
18
14
13
15
15
13
13
15
15
测序中
33
25
23
15
15
15
15
15
15
测序中
172
222
合计
HHDJY:红花大金元
烟草RGA基因亚家族的遗传分化与进化
1 遗传分化分析
对11个RGA家族内成员遗传分化程度进行了分
析：对这些 RGA基因家族成员分别进行建系统进
化树，根据树型，有些树分化程度明显较大（如
NBS334），表明这些亚家族内部分化明显。
A
B
C
0.01
0.01
0.01
F
E
D
0.01
0.01
0.01
G
H
0.01
基于RGA核苷酸序列和临接法（NJ）构建的烟草RGA基因4个亚家族的系统进化树。A:
NBS226; B: NBS173; C: NBS271; D: NBS374; E: Nbs359; F: NBS182; G: NBS334; H:
NBS267
2 进化分析
进一步对RGA亚家族选择进化进行分析。RGA
基因进化历程可能是处于一种中性随机突变状况
（M1a和M7模型）或受到正向或负向（又称净化）
的选择（M2a和M8模型）。根据Yang等（2005）方
法(Yang et al., 2005)，我们可以估计烟草RGA
基因亚家族成员的序列构成符合哪个进化模式。
结果表明 在测验的8个RGA基因中，大多受到强烈
的净化选择，同时部分基因在其个别位点上受到
明显的正向选择。
烟草RGA基因亚家族进化选择测验（似然比）结果
考虑到测序等误差，所选用的每个RGA亚家族成员间序列差异度≥1% (Couch et
al., 2006)
烟草基因组RGA基因的系统进化关系
通过PCR产物直接测序和克隆测序，共获得426条特异RGA基因序列
，包括来自栽培烟草11个RGA家族的293条基因序列和19条野生烟草的
基因序列。经注释，除了部分由于移码、终止子等导致的假基因，其
中绝大多数序列可以获得完整的NBS蛋白质序列。为了确定这些基因
序列的系统进化关系和亚家族归属，我们对获得的所有序列和已知烟
草和其他主要类型抗性基因进行了系统进化分析。从系统进化树可以
看出，我们鉴定的烟草RGA几乎覆盖了所以类型的已知抗性类型，包
括TIR-NBS类和大量非TIR-NBS类基因。非TIR-NBS类基因中，烟草中
一个烟草亚家族（I2，红色部分）已进行一定数量的测序调查(Couch
et al., 2006)，我们获得的数据也同样包含了这类RGA基因序列。同
时，与已知抗性基因有较大差异的一批烟草RGA被发现，这部分RGA基
因表现出烟草RGA的特异性，其中部分可能是烟草特有的RGA。
基于RGA蛋白质序列和临接法（NJ）构建的烟草RGA基因系统进化树
图中包括本研究获得的烟草NBS类抗性基因（黑色）、GeneBank数据库
中已有烟草RGA基因序列（红色）和目前已克隆抗性基因（其他颜色）
。
烟草RGA类抗性基因SSR分子标记开发
• 前期对烟草RGA基因进行了基因组分析，发现了一
大批烟草RGA基因，遗传多态性分析结果表明，烟
草RGA基因存在高度的遗传同质化，这给发现与抗
性相关RGA增加了难度。
• 为了探索获得与抗性相关RGA或相应标记的高效途
径，本研究利用烟草基因组序列开发了与RGA紧密
连锁的SSR标记。
分子标记开发流程
在基因组中查
找含有RGA区段
的序列
在其上下游
寻找SSR序列
设计引物
23个烟草材料中进
行PCR扩增
用于开发烟草SSR标记的23个栽培烟草品种及
其野生种基本信息
黑
抗性
CMV
根
青
序号
品种名称
类型
1
2
3
4
5
6
小黄金1025
红花大金元
K326
Hicks Broad Leaf
301
烤烟
烤烟
烤烟
烤烟
雪茄
--+
-
++
++
--
白肋
-
-
-
白肋
-
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
（沙姆逊）
burley 21
（白肋 21）
TN86
土耳其巴斯玛
N.undulata
N.glutinosa
N.sylvestris
N.repanda
N.plumbaginifolia
Ambalema
TI
Beinhart 1000-1
长脖黄
斯佩特 基-28
云烟87
Coker 176
C151
NC82
白肋
香料
野生
野生
野生
野生
野生
晒烟
晒烟
雪茄
烤烟
烤烟
烤烟
烤烟
烤烟
烤烟
++
--
蚜
原产地
--++
-
---
德国
-
-----
-----
+
-O
--
---
美国
土耳其
秘鲁
秘鲁
阿根廷
墨西哥
阿根廷
美国
国外
美国
河南
美国
云南
美国
广东
美国
--
+
-++
+
++
-++
++
++
++
-+
-++
–
---++
++
--
--
-
山东
云南
美国
美国
美国
阿尔
巴尼亚
-
注：黑：黑茎病；青：青枯病；根：根结线虫病；CMV:烟草花叶病毒病；蚜：烟蚜；
-：感病；--：中感；---：高感。+：抗病；++：中抗。O：耐病。
开发烟草中与RGA相关的SSR标记设计的引物
引物名称
TSN1001
TSN1002
TSN1003
TSN1004
TSN1005
TSN1006
TSN1007
TSN1008
TSN1009
TSN1010
TSN1011
TSN1012
TSN1013
TSN1014
TSN1015
TSN1016
TSN1017
TSN1018
TSN1019
TSN1020
TSN1021
TSN1022
TSN1023
TSN1024
TSN1025
TSN1026
TSN1027
TSN1028
TSN1029
TSN1030
TSN1031
TSN1032
TSN1033
正向引物（FWD_PRIMER）
GGCCTGCATGAATAAAAGAAAGAA
CAGAGGTTAAACCAACCCAAAATC
ATTGTTTTCACCCATGGAGGATT
GTCCAATTAGAGGGGAGGGAACTA
CTAGACGGCACGACACTGTGTTA
CTGGCTTACCTCCATGAAGATTGT
TCTTCCAAAAAGAGTACGCAATCA
GTGCGTAAGAAGTTGAGCTTACCC
ATCTCTCCTGTCAAGTGTGGGAAA
CGGGTACATTTTCTTGATTCAACT
TTAAAATGTTGTTTCCTCATGATTTTT
CAGCACAACGAAGATGAAGAAAAT
TTAACTGCTCGTCTCGTCAGTTTG
CATCACTATTTATCAAGTTAAACCGGAA
AGTAGGTTTGTGTACAACTGTCAATAGC
GCATCCTCTCAAGCCCTTTTTAAT
TTTCAAATAGCAGTAGCATTTCATCA
CCCCAAACCCCTAAAACCCT
AACACTGAGTCCATGTCATCATCA
ACTAGTTGTGTGAAGGGGATGTGA
AGGTCTAGCTCAGAATGCACAATG
TAAGAAAGAAGACAACGACGACGA
CTTTTGGGCTCTCTTCTCTCATTG
GTTTTTGGTGAGGTGCTTTCAGAT
CATGGACCAAGTAAATCACTGTCG
CCAATGGACTTCAACATAAAGCAA
TAAGGTCAATGGTTAAAGCGTCGT
AGTGCTGATAGAAGGAATGGCTTG
ATAAATGCTCTTGTCGTTTATTTCTTTT
ATGGCCATTTCTTTGGTTTTGAAC
AAACCTTTTCAGAAACAGTGCCAG
ACTTGTGGGACTACACTGGGTTTG
TGTAGAGGAATTGGTTGATGGACA
反向引物（REV_PRIMER）
CCTCCCATGAAGATTGTATGAACA
ACCCATGGAGGAATGGCTAGT
AGTCTGACGATCACTGAAAACACG
CCTCCAGTGTCAACATCATCTACG
ACAAACTCGATTCAGAACATGCAA
GCCTGCATGAATAAAGCAAGAAAT
CAGATGTTCAAACAAATACAGATGTCG
AGTTTTCTGGCATATGAGGAGGTG
TCTTCGAGACCTGCACTTAGAAGG
GCAACAAAATAGATAACTTACCACGTC
TTTTAAACACAAGACAATTGTACCCA
TTTGGGGAGTTTTATTTTATAAGGGA
TTCCTTATGCCACGTCACCTCTAT
CTTGTGTCCAAGTGGTGTAGTTTAGTT
ATCGAATACCGAAGTACCAAATCA
GGTTTGGTTTTGTCCATGAGTAGG
TGTCCAAACAACATTCATTTTATTCA
GGTTTCGGGTTTCGGGTTAC
TTCCCCTATCATTCAAGACTTCGT
TTCTGAAGGTCAAGGGCTAGATTG
AATCATATACACACATGGCACAGGA
CGGAGTAGGGGCAAGATCTATGTA
CACATAAGCTCATTGGATTTGCAG
CCAATTCCAACATCATCACATAATAAA
TCAACAATGCTTTTCGATTCATTC
GTGAAAGTCCCATTTGGATCTTCTT
TAAACCCAAATCTCTCTGACCCCT
GCCCAGTTCTGATTACCAGAGAGA
TTCCACTCTCTTCTTTACACCACA
TACTCTACCCAAATCGCTCCTCAA
CTGAGGAACTTTGAACCACTCGAT
CTTTTAAATCCAAGGTCAACGGGT
TTCTGCAGAGGCTGAATACATGAG
重复基元
GA
AG
TC
GAA
CTAT
CT
AAT
TA
AG
AT
AG
TA
TC
AT
TA
TC
TCT
AAACCCG
TCT
AGA
AT
ACA
TTC
GT
CT
GA
GA
GTAT
AT
CT
TTC
GTT
CTG
目的片段（bp）
158
160
136
153
148
134
153
136
145
230
147
159
148
158
159
130
143
201
151
122
131
115
137
147
159
109
86
136
155
126
153
147
114
退火温度（℃）
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
55
引物名称
正向引物
（FWD_PRIMER）
反向引物
（REV_PRIMER）
重复
基元
目的片段
（bp）
退火温度
（℃）
309
50
209
55
218
50
127
55
224
50
156
50
232
50
130
50
187
50
200
50
GA
TSN1001
ACATAAACAAAATGCGACT
GGATTGGGAAACCAGACT
TSN1002
GAACAAAGGCTTGAGAAT
CCATGGAGGAATGGCTAG
TSN1003
TAGCCTTGACATAGCAGA
AACACGAATACTCAGACA
TSN1004
AATTAGAGGGGAGGGAACT
CGTCTCCAAGGGTAGGTC
TSN1005
AATCAGTTAGTTAGGACGGT
AATAGGTGAAAGGGGAGT
TSN1006
ATTGGGAAACCAGACTTA
ATTTGAATGTGGGCGAGA
TSN1007
GTATGCCTGAAAACCAAA
TCCGGATTCCTATTCTAC
TSN1008
CACAGCAAATGACAAATC
CATCTACTTTAGTCCCTCA
TSN1009
TACGGGACCAGTAAACAC
TTCGAGACCTGCACTTAG
TSN1012
CAGCACAACGAAGATGAA
TGGAGATTGTTGGGCTTA
AG
TC
GAA
CTAT
CT
AAT
TA
AG
TA
开发的与RGA基因相关的SSR标记列表
引物
名称
正向引物
（FWD_PRIMER）
反向引物
（REV_PRIMER）
TSN1004
条带数
3
GTCCAATTAGAGGGGAGGGAACTA
CCTCCAGTGTCAACATCATCTACG
AATCAGTTAGTTAGGACGGT
AATAGGTGAAAGGGGAGT
CTGGCTTACCTCCATGAAGATTGT
GCCTGCATGAATAAAGCAAGAAAT
TSN1005
1
TSN1006
3
TSN1007
1
GTATGCCTGAAAACCAAA
TCCGGATTCCTATTCTAC
CGGGTACATTTTCTTGATTCAACT
GCAACAAAATAGATAACTTACCACGTC
GCATCCTCTCAAGCCCTTTTTAAT
GGTTTGGTTTTGTCCATGAGTAGG
TSN1010
2
TSN1016
1
TSN1022
3
TAAGAAAGAAGACAACGACGACGA
CGGAGTAGGGGCAAGATCTATGTA
AGTGCTGATAGAAGGAATGGCTTG
GCCCAGTTCTGATTACCAGAGAGA
TSN1028
1
讨论：
1、实验结果表明，在设计的43对引物中，能够用于
分子标记的引物有8对，NBS连锁的SSR标记的开发
效率达到近20%,是一种开发抗性基因分子标记的
有效途径。
2、由于烟草抗性基因极端同质化，作为与抗性基因
连锁的分子标记,对研究烟草抗性基因的多态性提
供新了的途径。
致
谢！