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博士学位论文答辩
论文题目：
水稻小RNA的基因组分布和分
子进化研究
生物化学与分子生物学
答辩人： 王晟
导 师： 樊龙江 教授，李德葆 教授
专
业：
2008-6-9
大纲
• 第1章 文献综述
• 第2章 水稻等禾本科TAS3基因的比较与分子进化分析
• 第3章 水稻MIR156b/c基因的进化与选择分析
• 第4章 水稻小RNA的全基因组分析
2
第1章 文献综述

植物小RNA

植物基因组的倍增事件
3
siRNA
microRNA
tasiRNA
植物中的小RNA途径
(Bonnet et al., 2006)
4
植物基因组的倍增事件
水稻 (A) 和拟南芥 (B) 倍增基因对点状示意图 (Zhang et al., 2005)
5
第2章 水稻等禾本科TAS3基因的比较
与分子进化

禾本科中候选TAS3基因的鉴别

TAS3基因的系统发育和进化分析

TAS3基因的其他特征
6
TAS3基因
Two-tasiARF TAS3
…
…
miRNA
binding
site
miRNA
binding
site
tasiARF tasiARF
One-tasiARF TAS3
…
miRNA
binding
site
…
tasiARF
7
miRNA
binding
site
402
At
53
73
01
527
CO
松：红色
双子叶植物：浅蓝色
禾本科的 TAS3 基因：黑蓝色
禾本科中one-tasiARF TAS3基因的系统发育树
46
BE
51
90
95
11
29
99
DR
CA
150
6
01
48
8
79 084
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5
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AJ D
7983
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45
82
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CD
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26
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3
CX 00
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34
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CN010916
6929 1
CZ59
a
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AA
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5
AA
6
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17 56
18 6
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4
7
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7
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DU5
EI09
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CS5927
74
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AS3
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CA1
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AS
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2
1
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19
67
60
CJ
Os
T
BU
06
TAS3基因的系统发育树
禾本科中two-tasiARF TAS3基因的系统发育树
8
TAS3基因的计算识别
9
TAS3基因的进化
植物中TAS3基因的进化
彩色的格子表示在相应物种中检测到的TAS3基因，不同的颜色代表不同的亚类或组。缩写：Os: 水稻; Hv: 大麦; Ta: 小
麦; Zm: 玉米;Sb: 高粱; Br: 十字花科; Ot: 除了Br以外的双子叶植物；Pi：白云杉和北美云杉；Pt：火炬松；Pp： 小立碗
藓; Gym: 裸子植物。
10
TAS3基因的PCR扩增和测序

基于数据库挖掘找到的TAS3基因上保守的tasiARF和3’miR390互补位点设计三对PCR引物，分别被用来扩增
玉米，大麦，小麦，高粱和甘蔗上的one- 和 two-tasiARF TAS3 基因（EU327115-EU327141）。
部分one-tasiARF TAS3基因的多序列联配
部分two-tasiARF TAS3基因的多序列联配
11
3’末端的相位保守性
在tasiARF 和3’ miR390 互补位点之间的区域上，相位排布结构具有高度的保守性，3’区域序列长
度严格按照以相位长度（21 nt）为单位的变化规则。

OsTAS3b1
SbTAS3b1
ZmTAS3b3
ZmTAS3b1
PgTAS3b1
OsTAS3b2
TaTAS3b2
HvTAS3b2
:
:
:
:
:
:
:
:
*
42
*
84
*
126
ttcttgaccttgcaagacttttcatcgaaaaacactcttcttcacttttctcgtaatatccttgccaacatttctcgtcctctcgcgtctatcactcctcccatcttctttgtccccgtctatccctcttgagctt
ttcttgaccttgcaagacttttcactagaggatgaattcctacttcatgtgtctctcgttcttacgcctgcctctcgccatctcgcgtctatcaatactcttgtatttctcgtccccgtctatccctcttgagctt
ttcttgaccttgcaagactttttgtccggagataatctcctacgagttaccctcttgcatcttgcgactacctcttctcgtctcgcgcctgtcgatccttccatctctctcgtccccgtctatccctcttgagctt
ttcttgaccttgcaagacttttcgctagaggatgaatcccaa---------------------cttcttgtgcctttccatctcgcacctatcaatcctcccatcttcttcgtctccgtctatccctcttgagctt
ttcttgaccttgcaagacttttcgcttgaagatgaattccta---------------------cgtggtagctatcctgatctcacacctatcaatcctcccacctttcgcgtccccgtctatccctcttgagctt
ttcttgaccttgcaagactttcgcttgcaaggcgcttccctg---------------------catattgtccgtgccatgctcatctctaccacccatctcctctctgccatttctgtctatccctcctgagctt
ttcttgaccttgcaagactttccctcgccacgcgctcttctt------------------------------------------cgacacaccaaccctctcttctctactcaccccgtctatccctcttgagctt
ttcttgaccttgcaagactttctctcgccgcacgctcttctt------------------------------------------cgacgcaccaaccttctcttctttattcatcccgtctatccctcttgagctt
C
12
:
:
:
:
:
:
:
:
136
136
136
115
115
115
94
94
结合位点和相位序列的保守性
禾本科中tasiARF和两个miR390互补位点上序列保守性
每个位置上的标识（logo）的高度，对应于位点的保守性。
13
TAS3基因的起源
水稻中的TAS3-like基因座位
位于miR390靶基因LRR-kinase编码区的TAS3-like基因
禾本科和苔藓中TAS3基因的茎环结构
tasiARF 5’端的5个核苷酸（UUCUU）位于顶部的环上
14
第3章 水稻MIR156b/c基因的进化与选
择分析

基因组倍增驱动的MIR156b/c 的进化

禾本科作物之间MIR156b/c 的高度保守性

MIR156b/c的遗传多样性和选择分析
15
水稻miR156家族的基因组分布和系统发育树
16
MIR156b/c在禾本科中的保守性
*
20
*
40
*
60
*
Rice
: actcttcttggtttgtgtttttgtgtgcttgttggagttgttaggaggaagagaggggtgagaggtg-aggc :
Maize
: ttaccgttttgttgctgtttcatggtgtttat-----ttgattgtaggg-----tggaggagaggtgaaagc :
Sorghum : -------------gctgtttcatcatgtttga-----ttat-tgtgggggtagagagaggagaggtggaggc :
71
62
53
80
*
100
*
120
*
140
Rice
: tgacagaagagagtgagcacacatggtgactttcttgcatgctgaat--------ggactcatgcttgaagc : 135
Maize
: tgacagaagagagtgagcacacatggtgcctttcttgcatgatgtatgatcgagagagttcatgctcgaagc : 134
Sorghum : tgacagaagagagtgagcacacatggtgcctttcttgcatgatgaat----gagtggattcatgctcgaagc : 121
*
160
*
180
*
200
*
Rice
: tatgtgtgctcacttctctctctgtcagccatttgatct-ctctttctctctttctccctcatgtgttatac : 206
Maize
: tatgcgtgctcacttctctctttgtcagccattagaactcctctatctctcaatctcgatc----------- : 195
Sorghum : tatgcgtgctcacttctctctctgtcagccattagaactcctctctctctcgatctcactcgatcgatctct : 193
220
*
240
*
260
*
280
Rice
: tgttctctcat-----atctatcttctttgaggtagtaatatacttgagcaaattaagctgcttaattattt : 273
Maize
: ---tccctctttctttgttgatctctcccatggtgat---------------atttatttgcttcctacgtg : 249
Sorghum : ctttcgttctctctcgatctctttctcccatggtgat---------------atttatttgcttc----tct : 246
*
300
*
320
*
340
*
360
Rice
: gtgtatgatgatcagctgctgatccggcctcatttcttgcatatatgaccacaaccacatacatgcttgttc : 345
Maize
: ttgt----------------------gttctctttcttcagcacacac------------------------ : 275
Sorghum : gcgt----------------------gttctctttcctgagcacacacacacacacacacacacacacacac : 296
*
380
*
400
*
420
*
Rice
: attttttttcacaaagaaagagaacagtttaatttaatttcttggg------gtttttggatcagttaattc : 411
Maize
: -------------------acaacctgttca---tgttaccttagggttaaagtttttg-------cacttt : 318
Sorghum : ac-----------------acaacctgttcatcatggtgccttagg------ggttttg-------cacttt : 338
440
*
460
*
480
*
500
Rice
: gtcttgagaggggaaga--------gatctctatgggttttggaggtctgacagaagagagtgagcacacac : 475
Maize
: gcgtgaagatggaaaga---caaacagtagatgagttttttgaaggtttgacagaagagagtgagcacacac : 387
Sorghum : gcctgaagagaggacgatggcaagggggagatggg-tttttgaaggtttgacagaagagagtgagcacacac : 409
MIR156b/c 在水稻，玉米和高粱基因组上的共线性。
*
520
*
540
*
560
*
Rice
: ggtgctttcttagcatgcaagagccatgctgggagctgtgcgtgctcactctctatctgtcagccgttcacc : 547
Maize
: ggtggtttcttaccatg--agtgtcatgctaggagctgtgcgtgctcaccctctatctgtcagtcactcatc : 457
Sorghum : ggtggtttcttagcatg--agtgccatgttgggagctgtgcgtgctcactctctatctgtcagccactcatc : 479
580
*
600
*
620
*
640
Rice
: atgcccaatatgattaatctccttctctcagttgacagtaatttctttgccagatctcctgttaaattt : 616
Maize
: aagccc----------atctgtcttattagcttgtttccgctgctaataaatattctagactcaagttt : 516
Sorghum : aggctc----------atctctctgtccgatttgg----------------------agccttgaaatt : 516
水稻、玉米和高粱MIR156b/c基因的基因组序列联配结果
17
MIR156b/c的遗传多样性和选择
核酸多态性和选择检验
18
第4章 水稻小RNA的全基因组分析




小RNA序列的概况
产生小RNA位点的分布
在种子两个发育时期表达存在差异的基因座位
水稻基因组复制块上小RNA分布的差异
19
数据来源和分析
• 材料为粳稻（日本晴）发育的种子，分别在受精后（days-afterfertilization，DAF）1-5天（G1期）和6-10天（G6期）两个发育时期收集
小RNA样品。通过Illumina高通量测序技术，获得了680多万条非冗余的
小RNA读序。
• 用BLAST将其定位到水稻基因组上（TIGR，版本5）。
• 小RNA的序列，位置和来源等信息存入MySQL数据库，其中位置信息基
于Bio::DB::GFF数据库模式，按照称为’bin’的格式存储，可以将查询速度
提高1~2个数量级。
20
小RNA序列的概况
小RNA数量分布
这些小RNA所覆盖的基因组序列长度为42,826,369 bp，占水稻基因组（372,077,801）的11.5%。这些小RNA
中，89.4%（17,898,912条）的长度为21~24 nt，其中主要是24 nt（65.0%）。
21
小RNA沿染色体的数量分布状况
橙色曲线表示重复归一化后的小RNA的数量
蓝色曲线和红色曲线分别表示逆转录元件和转座子的百分比（%）
黑色部分为非重复序列的百分比（%）
红色的短线对应中心粒及其周围区域的位置
22
小RNA在基因组各种类型区域上的分布情况
小RNA在基因组各种类型区域上的分布情况
23
小RNA在各种重复元件序列中的分布和密度
小RNA在各种重复元件序列中的分布和密度
Raw：小RNA原始数目，RawRepNor：重复归一化后的小RNA数值，RawHitDest：每Mb序列包含的小RNA原始
数目，RawNorHitDest：每Mb序列包含的重复归一化后的小RNA数目
24
在种子两个发育时期表达存在差异的基因座位

种子发育两个时期的小RNA表达谱（基因座位上的表达量）进行了比较，筛选出表达
有差异的基因座位（包括TIGR注释的基因座位和重复序列元件）。

某些ncRNA基因的表达差异极显著，比如，12006.t02006 (28.26 倍)。这表明该基因可
能在不同发育阶段发挥调控作用(Willmann & Poethig, 2007)。

另外，很多重复元件的表达差异也比较显著，表明发育阶段的不同，对小RNA相关的
重复元件调控的影响比较显著。这些结果为进一步进行实验验证提供了重要信息。
25
水稻基因组复制块上小RNA分布的差异


一对倍增块的成员之间，小RNA的表达量差
异比较明显，且差异主要存在于非同源区
域。这提示，水稻基因组倍增块在进化中，
与小RNA相关序列及其表达发生了显著的分
化。
同源区域小RNA的表达量比较低，且分布差
异不显著，可能是由这些区域的保守性所
决定的。
26
致谢
•
感谢导师樊龙江教授和李德葆教授的悉心关怀和指导，没有他们的宽容和帮助，我能够完
成学业是无法想象的。对于他们卓越的专业能力，诲人不倦的高尚师德和洞察世事的人格
魅力，再多溢美之言也难以表达我对恩师的感谢和敬意。
•
感谢郭兴益同学对本论文相关研究工作的大力帮助，感谢本实验室（BIOINPLANT）张扬，
温晓，鲍坚东，王煜，桂毅杰，冷晓东，全丽艳、沈丹，姚坚强等同学的关心和帮助，和
你们在一起度过了美好的时光，谢谢！同时也感谢曾在生物技术研究所共事过的庄晓峰，
张峰，戴承恩，于凤池，郭晓勤，张海燕，梁慎等同学对我的帮助。
•
特别感谢我的父母，朋友及所有亲人对我的理解，鼓励和支持。
•
同时向所有关心和帮助过本研究工作的领导、老师和同学表示最衷心的感谢！向参加本论
文评阅、答辩委员会的各位专家致以最诚挚的谢意！