Transcript ADN tumoral circulant

Suivi moléculaire des patients
L’analyse d’ADN tumoral circulant :
le point de vue du biologiste
Jean-Louis Merlin
Institut de Cancérologie de Lorraine
Service de Biopathologie
CNRS UMR7039 CRAN Université de Lorraine
On en parle dans le journal…
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C’est nouveau, ça vient de sortir…
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On savait déjà que c’était faisable…
 Chen XQ et al, Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell
lung cancer patients. Nat Med. 1996 Sep;2(9):1033-5
 Nawroz H et al, Microsatellite alterations in serum DNA of head and
neck cancer patients. Nat Med. 1996 Sep;2(9):1035-7.
 Mohiuddin M et al, C-Ki-ras mutations in peripheral blood of
pancreatic cancer patients: a marker for early tumor metastasis. Int J
Radiat Oncol Biol Phys. 1996 Jan 1;34(1):161-6.
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ADN tumoral circulant
Schwarzenbach et al, Nat Rev Cancer, 2011
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D’où ça vient ?
Schwarzenbach et al, Nat Rev Cancer, 2011
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De nombreuses études…
Schwarzenbach et al, Nat Rev Cancer, 2011
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Intérêt : diagnostic moléculaire
et suivi thérapeutique
Murtaza et al, Nature 2013
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Le point technique…
 Les seuils de détection des différentes méthodes
utilisées pour analyser les mutations à partir
d’ADN extrait de tissu hétérogène sont variables
 10-20% pour le séquençage direct
 5-10 % pour les techniques de PCR
 <10-6 pour les techniques de PCR digitale
 Ces seuils ont un impact potentiel direct sur le
diagnostic moléculaire exprimé de façon
« binaire »
(cf Tougeron ASCO 2012)
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Avec les gènes, il faut savoir ce que l’on veut…
Multiple tiers of analysis: quantification, identification, exploration
TaqMan
Single-locus
assay
TAm-Seq
Wholeexome seq.
Genomic bases screened
1~10
104
108
Mutation detection
<0.1%
1%
10%
Cost per sample ($)
20~100
25
500
Increasing sensitivity for rare mutations
Increasing genomic coverage (and cost)
PCR haute sensibilité
 De nombreuses techniques de PCR permettent de
détecter et d’analyser des quantités très faibles
d’ADN




Digital PCR
Droplet digital PCR
Beaming PCR
IntPlex
 Ces techniques permettent d’analyser l’ADN
circulant
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Digital PCR
 Répartition d’un échantillon en une multitude de réactions de PCR
 Identification des portions portant la mutation (positif) et des portions ne
portant pas l’anomalie recherchée (négatif)
Une réaction de PCR est effectuée sur chacune des molécules d’ ADN
L’étude du rapport négatif/positif permet ainsi de déterminer un nombre de
copies d’ADN muté, sans avoir recours à des contrôles internes
Digital PCR (Roche Diagnostics, Life Technologies)
« Diluer pour mieux…quantifier »
Light Cycler 1536
Plaque 1536 puits
Vol : 0.5 à 2 ml
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Droplet Digital PCR
1. Échantillon réparti dans 20 000 gouttelettes contenant la cible
d’intérêt et l’ ADN non muté distribués au hasard dans les
gouttelettes
3. Les gouttelettes + et - sont comptées dans l’échantillon
puis calcul par un logiciel de la c° d’ADN en copies/ml
2. Après amplification, chaque gouttelette produit un
signal fluorescent positif ou négatif indiquant si la
mutation cible est présente ou non.
Droplet digital PCR (Biorad)
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Raindrop digital PCR (Raindance)
Pekin et al Lab Chip, 2011
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Beads Emulsification Amplification & Magnetics
1ère Etape
4ème Etape
2ème Etape
3ème Etape
BEAMing (Inostics)
Richardson AL, Iglehart JD, Clin Cancer Res, 2012
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Avantages / Inconvénients
Baker M, Nat Meth, 2012
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Etude A. Thierry et al. ASCO 2012
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ADN tumoral < 200 bp
Mouliere F, Thierry AR. Expert Opin Biol Ther. 2012 Jun;12 Suppl 1:S209-15
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Intplex
300 pb
 Q-PCR spécifique d’allèle

Méthode très spécifique
 Détection
de la mutation et
détermination de la concentration
d’ ADN circulant
 Utilisation d’un bloqueur spécifique
d’allèle
60 pb

60 pb
empêche
l’amplification
séquences non mutées
des
1. la prise en compte de la taille des ADNcir (<135 bp)
2. compare l’amplification de séquences de même taille, et de même région (300 bp)
3. Allele specific avec agent blocker pour grande spécificité
4. Design expérimental apportant une grande sensibilité (~0.005%, mutant to WT ratio)
5. Cout réduit et très rapide « data turnaround time » (2 jours, ~3 fois plus rapide que Beaming ou Fluidigm based
methods)
6. Méthode générale et équipement de routine (vs outsourced analysis telle que Beaming)
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Thierry A.R., confidentiel
Thierry AR et al, 2012, Nature Med, en révision
Sensibilité : ≤0,01% pour chaque mutation
Sensitivity (mutant/WT copy number):
KRAS
G12V (0.005%)
G12R (0.005%)
G12C (0.01%)
G12D (0.009%)
G12S (0.004%)
G12A (0.005%)
G13D (0.005%)
BRAF
V600E (0.004%)
Intplex a été testé sur 29 échantillons de
plasma d’individus sains
 pas de mutations détectées.
Sur les échantillons cliniques de patients
mCRC, le plus faible niveau de charge
mutée KRAS trouvée est de 0.013 %.
23
Thierry AR et al, 2012, Nature Med, en révision
Thierry A.R., confidentiel
Concordance avec ADN extrait du tissu tumoral
Concordance between Tumor-Tissue Analysis and ctDNA Analysis (N=95)
Tumor-Tissue Analysis
KRAS
Mutant
WT
Mutant
36
1
WT
3
55
Total
39
56
BRAF
Mutant
WT
Mutant
5
0
WT
0
90
Total
5
90
All mutation
Mutant
WT
Mutant
41
1
WT
3
50
Total
44
51
ctDNA Analysis
ctDNA Analysis
ctDNA Analysis
•
Sensitivity
Specificity
Accuracy
92%
98%
96%
Sensitivity
Specificity
Accuracy
100%
100%
100%
Sensitivity
Specificity
Accuracy
94%
98%
96%
Abbreviations: KRAS codon 12 and 13 mutations; BRAF V600E mutation; WT, Wild Type for the tested mutations
Thierry A.R., confidentiel
Conclusion : Yes we can !
 L’analyse de l’ADN circulant est en plein essor
 Concept de « Biopsie liquide » à valider
 Suivi thérapeutique
 Emergence de résistance…
 Biomarqueurs et techniques à valider
 LOE
 Spécificité, sensibilité
 Validation de méthodes, assurance qualité
 Délais : techniques avec analyse centralisée vs technique
utilisables sur site
 Implémentation sur les plateformes INCa ?
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Merci…
 Maëva Lion et Alexandre Harlé (ICL, Nancy)
 Pierre Laurent-Puig (HEGP, Paris)
 Alain Thierry (IRCM, Montpellier)
Si vous cherchez la source du fleuve
vous la trouverez dans les gouttes d’eau sur la mousse
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