Transcript wykład 5-online

Podsumowanie – wykład 5
Transformacje komórek roślinnych – rośliny GMO
Metody transformacji
- wektorowe
- bezwektorowe
Typy wektorów:
-plazmidowe
-fagowe
-hybrydowe (kosmidy)
-sztuczne chromosomy (BAC, YAC)
-wektory binarne
Transformacja wektorowa z użyciem Agrobacterium tumefaciens i rhizogenes
• plazmid Ti (T-DNA)
• zanurzanie kwiatów w zawiesinie bakteryjnej (floral dip)
Transformacje bezwektorowe
• Mikrowstrzeliwanie
• Włókna krzemowo-karbidowe
• PTP-pollen tube pathway
Transformacja genetyczna
Transformacja genetyczna polega na wprowadzeniu fragmentu DNA dawcy
(jednego lub kilku genów) do genomu biorcy nadając mu nowe, unikalne cechy.
• GMO – genetically modified organism
• GM
Rośliny poddane transformacjom (rośliny transgeniczne) z
konstruktami genowymi są:
•
•
•
•
•
odporne na herbicycy
odporne na choroby
odporne na owady roślinożerne
odporne na niekorzystne warunki środowiska
z poprawionymi cechami użytkowymi np. lepsze
plonowanie, większa zawartość składników odżywczych,
witamin
Metody transformacji roślin
TRANSFORMACJE
WEKTOROWE
wykorzystują bakterie
(wektory plazmidowe,wektory
fagowe)
BEZWEKTOROWE
transformacja protoplastów,
mikrowstrzeliwanie, włókna
krzemowo-karbidowe, PTP
(polen tube pathway)
Wektory
Wektory
plazmidowe
Plazmid – pozachromosomowa, kolista cząsteczka DNA zawierająca
niezależny początek replikacji; wektory plazmidowe są plazmidami
sztucznie zmodyfikowanymi; pozwalają na klonowanie fragmentów DNA
do 10 kpz;
Typowe modyfikacje:
• Stałe miejsce do klonowania zawierające szereg
unikalnych miejsc restrykcyjnych (polilinker)
• Obecność co najmniej jednego markera selekcyjnego
(np. oporności na antybiotyki AmpR)
• Miejsce ori –(repilikacja) determinuje obecność setek
kopii plazmidu na pojedynczą komórkę
• Sekwencje promotorów polimerazy RNA
Transformacja wektorowa
Metoda z wykorzystaniem
wektora plazmidowego
Agrobacterium
tumefaciens
Mikroorganizmy posiadają w swojej komórce plazmid,
który zawiera zakodowaną informację o białkach
niezbędnych do zaatakowania rośliny. To właśnie on
wnika do komórki roślinnej, a jeden z jego fragmentów,
nazwany odcinkiem T-transfer (T-DNA), integruje się z
materiałem genetycznym komórki gospodarza.
Usuwając geny znajdujące się wewnątrz fragmentu T, można na
ich miejsce wstawić dowolny inny fragment DNA, który może
zawierać geny pochodzące z innego organizmu. Obecnie do
transformacji roślin używa się plazmidów pochodzących z
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium
tumefaciens
naturalnie
infekuje
(najczęściej w miejscu zranienia) ponad 160 gatunków
roślin powodując guzowatość *
* żeby bakteria była onkogenna musi zawierać plazmid Ti
(ang. Tumor inducing).
Plazmid Ti z Agrobacterium tumefaciens
Analiza genetyczna wykazała, że dwa
regiony plazmidu Ti są niezbędne do
powstania guza: T-DNA i region vir
(virulence).
T-DNA zawiera geny związane z produkcją
fitohormonów (auksyn, cytokinin)
Nadprodukcja tych hormonów podwyższa
tempo podziału komórki, zapobiega
różnicowaniu i w rezultacie powoduje
powstanie guza
Inne geny T-DNA odpowiedzialne są za
syntezę aminokwasów i pochodnych
argininy zwanych opinami, (źródło C i N)
oraz za ich wydzielanie z komórki roślinnej;
Rodzaj syntetyzowanych opin jest podstawą
klasyfikacji plazmidów: np..nopalinowe,
oktopinowe, atropinowe.
Fragment T-DNA jest ograniczony krótkimi
(24-25 n) sekwencjami granicznymi LB i RB
(miejsca nacięcia T-DNA)
200kpz
Geny wirulencji (vir)
Fragment
vir
(ang
virulence)
znajdujący się poza T-DNA o wielkości
od
30-40
kpz
zawiera
geny
zaangażowane w proces transformacji
położone w obrębie 6 operonów:
•
•
•
•
•
•
virA (1)
virB (11)
virC (2)
virD (4)
virE(2)
virG (1)
• virF (1)
• virH (2)
A
B
C
DE
G
Nie są związane z przenoszeniem T-DNA; ale istotne dla transformacji
niektórych gatunków np. virF- kukurydza
Operony virA i virG ulegają stałej ekspresji na niskim poziomie; produkt białkowy virA jest
białkiem transmembranowym reagującym na związki fenolowe i monocukry wydzielane przez
zranioną tkankę roślinną. Aktywuje również białko virG, które działa jako czynnik transkrypcyjny
dla pozostałych vir. Vir D- koduje endonuleazy, które wycinają T-DNA w obszarze LB. Vir C
stymuluje proces przenoszenia T-DNA. Vir B- tworzą kanał transferowy przez który wnika T-DNA
Transformacje bezwektorowe
Metody bezwektorowe nie wymagają użycia wektorów w postaci Agrobaterium
tumefaciens czy A. rhizogenes
Stosowane są do transformacji w tych przypadkach kiedy rośliny są
niewrażliwe na agroinfekcje.
Wadą transformacji bezwektorowej jest brak ochronny DNA dawcy przed
uszkodzeniami i wprowadzenie wielu kopii transgenu do genomu biorcy.
Niezbędnym etapem jest poddanie komórek roślinnych
działaniu enzymu usuwającego ścianę komórkową.
Otrzymuje się w ten sposób tzw. protoplast, którego
błona komórkowa stanowi koleją barierę dla transgenu,
wprowadzanego do komórek z wykorzystaniem jednej z
metod, ogólnie podzielonych na fizyczne i chemiczne.
Metody wprowadzania DNA do
protoplastów komórek roślinnych
• Fuzja liposomów-tworzone są liposomy, wewnątrz których są cząsteczki
DNA. Tworzy się je poprzez utworzenie podwójnej błony lipidowej na
roztworze z cząsteczkami DNA i wstrząsanie nie -powstają wtedy "kuleczki"
błonowe z DNA w środku. Liposomy łączą się z protoplastami komórek
wprowadzając do środka DNA
• Z użyciem PEG, chemiczna -polega na wykorzystaniu glikolu
polietylenowego (PEG od ang. polyethylene glycol), który powoduje
zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej, poprzez prowadzenia do
niej chwilowej, odwracalnej dezorganizacji. To pozwala na wniknięcie
transgenu do komórek, wraz z DNA nośnikowym
• Mikroiniekcja-polega na wprowadzeniu DNA za pomocą igły
mikromanipulatora, doświadczenie wykonywanie jest przez ręcznie
człowieka. Metoda praco-i czasochłonna
PTP- polen tube pathawy
• Wykorzystuje naturalny proces wzrostu łagiewki pyłowej przez słupek do
woreczka zalążkowego, w którym dochodzi do podwójnego zapłodnienia:
jedno z jąder plemnikowych migrujących wraz z łagiewką zlewa się z
komórką jajową, co prowadzi do powstania zygoty, a drugie ulega fuzji z
jądrem komórki centralnej dając początek endospermie.
• Tą samą drogę może przebyć obcy DNA do zalążka, który będzie
umieszczony na powierzchni słupka. W tym celu skraca się szyjkę słupka i
usuwa znamię, a plazmidowy DNA umieszcza się bezpośrednio na odciętej
powierzchni.
• W wyniku transformacji metodą PTP przeniesiono do bawełny odporność na
chorobę grzybową; wprowadzono gen gna i cryl do pszenicy, które
warunkują odporność na owady; u cyklamenu wprowadzono gen CHS z
petunii – nowe barwy kwiatów.