Transcript 13주차_SDS-PAGE, protein-protein interaction

13주차
생화학 및 분자생물학실험
SDS-PAGE
Protein-protein interaction
Content
1.
Purpose
2.
Introduction & theory
• SDS-PAGE
• Protein-Protein interaction
3.
Materials & method
Purpose

정제한 단백질 sample을 전기영동(SDS-PAGE)하여 Coomassie염색으로 단백
을 확인해보고, Western Blot으로 단백질이 His tagged B-galactosidase 임을
확인한다.
Introduction & theory
1.
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoration)
단백질의 크기를 분석하는 가장 일반적인 방법
단백질에 SDS를 반응시켜 (-) 전하를 띠게 한 후,
Polyacrylamide gel에 단백질을 분주하여 크기에 따라 분리 하도록함.
Introduction & theory
1.
SDS-PAGE
1)
Sample loading dye
Na+
O-
Hydrophobic interaction
1.4:1의 비율로 결합
O
S
O
Sodium dodecyl sulf ate
O
Introduction & theory
1.
SDS-PAGE
2)
Gel 조성
Separating gel
Stacking gel
5%
7.5 %
10 %
15 %
5%
4X buffer
1.25 ml
1.25 ml
1.25 ml
1.25 ml
1 ml
30 % acrylamide
0.833 ml
1.25 ml
1.667 ml
2.5 ml
0.667 ml
3’DW
2.917 ml
2.5 ml
2.083 ml
1.25 ml
2.333 ml
10 % APS
50 ul
40 ul
TEMED
5 ul
4 ul
Total
5 ml
4 ml
4 x Separating gel buffer (1L) = 1.5 M Tris-Cl (pH8.8) + 0.4 % SDS + 3’DW
4 x Stacking gel buffer (1L) = 0.5 M Tris-Cl (pH6.8) + 0.4 % SDS + 3’DW
Introduction & theory
1.
SDS-PAGE
2)
Gel 조성

Acrylamide/bis-acrylamide : 가교 형성하는 재료
Ammonium persurfate (APS)
: Radical 반응을 시작시키는 개시제

Tetramethylethylenediamine (TEMED)
: Radical 반응과 polymerization을 촉매

Introduction & theory
1.
SDS-PAGE
3)
Stacking gel/ Separating gel
pI of glycine = 6.0
- Zwitterion and anion in pH6.8
- Fully anion in pH8.8
Stacking gel이 하는 역할
단백질이 동일선상에서 출발 할 수 있도록 정렬시킨다.
분자의 크기차이에 의한 분리를 더 정확히 할 수 있다.
Introduction & theory
1.
SDS-PAGE
SDS running buffer
: 25 mM Tris-Cl pH8.3 + 192 mM Glycine + 0.1% SDS
4)
5)
SDS-PAGE Staining
일반적으로 CBB법이 간편하고 저렴하며 감도도 우수한 편이다. (detection limit : 0.1~0.5ug)
보다 높은 감도로 detection이 필요할 때에는 silver staining 많이 사용한다. CBB staining의 100정도의 감도로 수
ng도 볼 수 있다.
Introduction & theory
5)
SDS-PAGE Staining
SDS-PAGE Coomassie blue Staining
1g Coomassie brilliant R250 + 45% Methanol + 10% Glacial acetic acid
+ DW

SDS-PAGE Coomassie blue Destaining
45% Methanol + 10% Glacial acetic acid + DW

Methanol : protein 고정(protein의 확산 방지).
Acetic acid : protein과 Coomassie brilliant R250의 결합력 강화.
Introduction & theory
2.
Protein-Protein Interaction
1)
Western Blot



항원-항체반응을 이용하여 전체 단백질에서 특정 단백질만을 Chemi luminescence으
로 Detection 할 수 있음.
Target 단백질(항원)을 확인하기 위해, 특이적 항체를 붙임으로써 단백질의 발현여부와
발현양의 대략적인 비교를 가능하게 한다.
Target protein에 대한 high-quality antibody와 HRP결합된 secondary antibody가 필
요.
Introduction & theory
①
Western blot의 과정
① 전기영동
② gel에서 membrane으로
단백질 Transfer
④ Chemiluminescence detect
③ 항체 반응
Introduction & theory
2)
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay : ELISA
Direct ELISA
Indirect ELISA
Introduction & theory
2)
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay : ELISA
Sandwich ELISA
Competitive ELISA
Introduction & theory
3)
Surface Plasmon Resonance : SPR
surface plasmon은 금속박막 표면에서 일어나는 전자들의 집단적 진동.
표면 플라즈몬 공명이 일어나는 공명각(즉, 반사광이 최소가 되는 각도)은 금속 박막 표면층 유전체 질량이 증가하
거나 구조가 변형되면 결과적으로 유효 굴절률이 변화하여 공명각이 달라지게 된다.
Materials & Methods
1.
SDS-PAGE
2)
Sample preparation
(1) Sample과 5xSDS-loading dye를 섞어 약 5분간 끓인다.
(2) Centrifugation해서 spin down 시킨다.
3)
Gel preparation
# 안전과 오염방지를 위해서 poly-glove를 착용!!
(1) Gel kit를 조립한다.
(2) acrylamide의 농도를 선택하고 separating gel 용액을 만든 후 pipetting하여 바로 Gel kit에
넣는다.
(3) Isopropanol이나 50% n-butanol를 위에 넣어준다.
(4) Gel이 다 굳으면 물로 깨끗이 씻어준 뒤, Comb을 꼽고 stacking gel 용액을 만들어 넣는다.
(5) 굳으면 분리해서 사용한다.
Materials & Methods
1.
SDS-PAGE
3)
Gel loading
(1) Gel에서 comb를 뽑고, 잘 분리한다.
(2) 전기 영동 장치에 gel을 설치하고 SDS-running buffer를 채워준다.
(3) Pipet을 이용해서 well에다 sample을 잘 채워준다.
4)
Gel running
(1) 30 mA 설정하여 전류를 연결한다. (2개 일 경우 60 mA)
5)
Staining
(1) 전기 영동이 끝난 gel을 separating 부분만 잘 분리한다.
(2) Staining solution이 담긴 통에 넣어주고 20min간 기다린다.
6)
Destaining
(1) 끓는 물에서 10분 가량 끓여주거나, destaining solution에 gel을 담가 1hr 보관한다.
Materials & Methods
2.
Western blot
1)
Transfer
검은색 패드(-)->Sponge->3M paper 2장->Gel->Membrane->3M paper 2장>Sponge->빨간색패드(+) 순서로 Kit를 조립한다.
110V로 2시간 transfer를 진행한다.
Membrane을 꺼낸다.
①
②
③
2)
①
②
③
④
Western blot.
Antibody binding: Membrane을 1% BSA와 antibody(His probe-HRP)가 들어있는
PBST(PBS with 0.1% Tween-20)을 이용해 30분간 반응한다.
Wash : PBST을 이용해 5분마다 buffer를 교체한다.(4번 진행)
Chemiluminescence을 증폭시켜줄 ECL Solution에 1분간 반응시킨다.
LAS-4000장비를 이용해 측정한다.