Transcript 高通量药物筛选与创新药物研究 中国科学院上海药物研究所 国家新药筛选中心 李佳

高通量药物筛选与创新药物研究
中国科学院上海药物研究所
国家新药筛选中心
李佳
内容
• 高通量药物筛选：
模型建立、化合物制备、自动化、数据处理
• 我国高通量药物筛选的现状
• 我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的策略：
组合筛选模型体系、分子家族筛选模型体系、化学生物学方法研究活
性化合物作用机制
• 我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的研究实例
化合物资源
药物发现
DRUG DISCOVERY
1.药物先导化合物的发现
2.药物先导化合物的结构优化
药物候选化合物
药物开发
DRUG DEVELOPMENT
1. 临床前研究
2. 临床研究
新
药
研
究
的
两
个
阶
段
天然产物
化学合成
组合化学
—药物发现的关键环节
高通量筛选
技术
—高新技术集中的焦点
化合物库
筛选
结构优化
先导化合物
筛选模型
分子生物学
细胞生物学
基因组学
蛋白组学
生物信息学
结构生物学
计算机辅助药物设计
药物化学
高通量筛选（HTS）
运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的
筛选模型上完成数以千计，甚至万计化合物样品的
活性测试。一般而言，日筛选能力应在10000次以上
方可以称为高通量筛选。
The Evolution of HTS
高通量筛选
•
快速----每天筛选上万药次
•
微量----筛选样品需要量为微克级
•
灵敏----准确判断筛选样品的活性和选择性
•
经济----筛选费用低
常规筛选和高通量筛选
高通量筛选
常规筛选
高通量筛选的四个要素
HTS
数据处理
样品制备
模型建立
自动化
要素一：高通量筛选模型建立
针对某一特定靶点，设计一种生物活性检测方法并
使之适用于高通量筛选。
选择高通量筛选的靶点
来源于基础科学对于一种疾病进行细致研究后的理
解和发现。根据这些结果，我们可以选择其中关键
的生物效应环节进行干预。这些靶点包括受体、酶、
激素、因子、离子通道和蛋白间的相互作用等。
Current Drug Targets
•
•
•
•
•
•
•
Membrane Receptors
Enzymes
Hormones and Factors
Ion Channels
DNA
Nuclear Receptors
Unknown
N = 483
45%
28%
11%
5%
2%
2%
7%
J. Drews, Science (2000) 287:1962
靶点确证
•
•
•
•
•
•
•
Expression phenotype ?
Mutant ?
Antisense treatment ?
Antibody treatment ?
RNAi ?
Knockout / knockin ?
Inhibitor treatment ?
克隆
PCR、RT-PCR方
法从cDNA文库、
EST克隆、组织和
细胞的总RNA中
得到关键靶基因
亚克隆
大肠杆菌表达系
统
酵母表达系统
昆虫表达系统
大规模表达、
纯化、复性，
得到纯净重组
蛋白
分子水平筛选模型建立流程
H
N
N
O
检测方法的确
定、优化及高
通量筛选模型
的建立
O
O
O
N
H
H
N
S
OEt
N
H
O
O
O
光吸收
H
N
HS
O
O
OEt
N
H
O
COOH
O2N
S
S
NO2
HOOC
时间
COOH
S
NO2
E412nm =13,600 M1cm-1
模型设计
• 体外生化检测
–通常通过体外生化检测方法进行筛选的靶点包括酶、
受体、蛋白与蛋白的相互作用等
• 细胞水平的检测
–主要用于信号传导通路相关的靶点（包括受体、离子
通道）以及为发现抗生素设计的筛选模型
通过显色反应、荧光、化学发光以及同位素检测
技术测量生物反应的终点。
体外生化检测
Ìå Íâ Éú»¯¼ì²â
ÒìÏà ¼ì²â
¾ùÏà ¼ì²â
·ÅÉäÐÔ¼ì²â
SPA ΢ Á£
·Ç·ÅÉäÐÔ¼ì²â
·ÅÉäÐÔ¼ì²â
ÏÔÉ«·´ Ó¦¼ì²â
¹ý ÂË·½·¨ ¼ì²â
Îü Êչ⠼ì²â
Îü ÊÕ·½·¨ ¼ì²â
Ó«¹â ¼ì²â
³Áµí ·½·¨ ¼ì²â
΢ Á£·½·¨ ¼ì²â
·ÅÉäÃâÒß
SPA ΢ ¿×°å
·Ç·ÅÉäÐÔ¼ì²â
ELISA
¼ì²â
显色反应
(Photometry)
No2
O
R
N
H
O
R
S
O
O
E
N
H
HS
R'
N
H
R'
O2N
E
HO2C
SS
NO
2
CO2
H
O
No2
H2N
405nm=1.06¡Á104 M-1cm-1
HS
NO2
CO2H
412nm=1.4¡Á104 M-1cm-1
+
O2N
HO2C
S S
N
H
R'
显色反应方法检测MetAP活性
S
MetAP
N
H2N
O
O
N
H
NO2
HN
O
Met
N
H
NO2
ProAP
N
H
OH
+
H2N
NO2
O
maxnm
显色反应方法检测MetAP活性
O2N
S
R
O
S
H2N
O
N
H
HS
OH
O
Met
R=Ph,CH3
N
H
OH
HO2C
NO2
CO2H
=412nm
+
O2N
HO2C
CO2H
O
R
O
HS
NO2
R
O
MetAP
S S
S S
N
H
OH
O
荧光强度
(Fluorescence Intensity)
7-amino-4-methylcoumarin
rhodamine 110
resorufin
Fluorogenic Peptide Substrate
荧光偏振
(Fluorescence Polarization)
低的 FP信号
偏振光
快速旋转
方向随机
偏振光
生物大分子
旋转减慢，偏振光
方向集中在偏振面上
强的 FP 信号
FP
Theoretical FP Behavior of a Series of Fluorescent Dyes
As a Function of MW
尺寸变化
ÉúÎï
´ó ·Ö
×Ó
ÉúÎï
´ó ·Ö
×Ó
+
+
FP ÐźÅÔöÇ¿
ÉúÎï
´ó ·Ö
×Ó
+
ÉúÎï
´ó ·Ö
×Ó
FP ÐźżõÈõ
¾ºÕùÐÔ½áºÏ
FP ÐźżõÈõ
+
IMAP
Protein-DNA Binding FP HTS
Ser/Th Kinase Competitive FP Assay
荧光共振能转移(FRET)
荧光共振能转移是指供体受激发后不发射出光子而将
激发的能量转移到受体的现象。这种方法可检测生理
状态下相互作用分子间的距离。产生FRET需要满足三
个条件：供体和受体间距离接近（10~100埃）；供体
的发射光谱与受体的激发光谱必须有重叠；供体和受
体之间迁移偶极子的方向必须平行。
Fluorescence Resonance Energy
Transfer (FRET)
Fluorescence
Absorbance
Donor
Fluorescence
Absorbance
Wavelength
Acceptor
Wavelength
D
A
Efficient energy transfer: 10–100 Å
荧光共振能转移
在大多数情况下，供体与受体标记的荧光染料是不同
的，供体的荧光会因为受体的存在而发生淬灭。一般
荧光素和四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine）之
间发生50%有效能量转移所需距离为55 埃，EDANS和
DABCYL之间为33埃，EDANS和荧光素之间为46埃。
FRET主要用于淬灭分析或与淬灭相关的分析。
Fluorogenic (Quenched) Substrate
µ°°×Ë®½âø
Dabcyl
EDANS
Dabcyl
²â ¶¨ EDANSÓ«¹â Ç¿¶È
EDANS
FRET
Example of use of FRET in a protease assay
Matayoshi et al., Science 247 954 (1990)
时间分辨荧光共振能传递
（Time Resolved FRET）
LANCE Assay for Kinase
LANCE Assay for Transferase and
Nuclear receptor
LANCE Assay for Protease
and Helicase
AlphaScreen
AlphaScreen for PIP3
Emission
520-620 nm
Excitation
680 nm
O2
Biotinylated
PI(3,4,5)P3 analog
anti-GST conjugated
Acceptor Beads
GST-tagged
PIP3 Binding Protein
Streptavidin-coated
Donor Beads
ATP
PI(3,4,5)P3
PI(4,5)P2
AlphaScreen for cAMP
Biotin-cAMP
680 nm
Donor-Streptavidin
Acceptor-Anti-cAMP
520-620 nm
BRET
闪烁亲近检测法
(Scintillation Proximity Assay, SPA)
-ÉäÏß ×÷ÓÃÓë΢ Á£ÉϵÄÉÁ˸¼Á·¢ Éä¿É¼ì²â µÄ¹â
SPA ΢ Á£
-ÉäÏß ÔÚ½éÖÊÖÐ
±»Ïû É¢
·ÅÉäÐÔ±ê¼ÇÅäÌå
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µÄÉúÎï ´ó ·Ö×Ó½áºÏ £¬Ç×½üÉÁ˸
²ú Éú¿É¼ì²â µÄ¹â
δ ±ê¼ÇÅäÌå ²» ²ú Éú
Ç×½üÉÁ˸
FlashPlate - SPA without
Beads
Bind Receptor
Or Target to
Plate
Radiolabeled
Tracer and
Sample added
Only bound
Tracer is
Measured
常用的蛋白水解酶检测方法
µ°°×Ë®½âø
1.
R
R
Îü Êչ⠻òÓ«¹â ·½·¨ ¼ì²â ²ú Îï
R
µ°°×Ë®½âø
2.
Biotin
Biotin
I
125
125
I
Óÿ¹ ÉúÎï ËØÁ´¾úËØ°ü ±»µÄSPA΢ Á£»ò
FlashplatesTM²¶ »ñÉúÎï Ëرê¼Ç×é·Ö
µ°°×Ë®½âø
3.
Biotin
Fluores
Biotin
Fluores
¼ÓÈ뿹 ÉúÎï ËØÁ´¾úËز⠶¨ Ó«¹â Æ«Õñ
常用的蛋白水解酶检测方法
µ°°×Ë®½âø
4. Dabcyl
Dabcyl
EDANS
EDANS
²â ¶¨ EDANSÓ«¹â Ç¿¶È
µ°°×Ë®½âø
5.
Biotin
CY5
Biotin
¼ÓÈ뿹 ÉúÎï ËØÁ´¾úËØ-APC²â ¶¨
´ÓCy5µ½APCµÄ¹² ÕñÄÜÁ¿×ª ÒÆ
CY5
常用的激酶检测方法
33
PO43-
¼¤Ã¸
1.
Biotin
Biotin
33
+ AT P
¿¹ ÉúÎï ËØÁ´¾úËØ°ü ±»µÄSPA΢ Á£»ò
FlashplatesTM²¶ »ñÉúÎï Ëرê¼Ç×é·Ö
»òÁ×ËáÏËά ËØ°å ²¶ »ñÁ×Ëữ×é·Ö
PO43-
2.
Biotin
¼¤Ã¸
Biotin
+ ATP
Ó¦ÓÃîð ±ê¼Ç¿¹ Á×Ëữ¿¹ Ìå ¼°¿¹ ÉúÎï
ËØÁ´¾úËØ- APC½øÐоùÏà FRET¼ì²â
常用的磷酸酯酶检测方法
33
PO43-
3.
Á×Ëáõ¥Ã¸
Biotin
Biotin
+ Free 33PO43-
¿¹ ÉúÎï ËØÁ´¾úËØ°ü ±»µÄSPA΢ Á£»òFlash
platesTM²¶ »ñÉúÎï Ëرê¼Ç×é·Ö»òÁ×ËáÏË
ά ËØ°å ²¶ »ñÁ×Ëữ×é·Ö
PO43-
Á×Ëáõ¥Ã¸
4.
Biotin
Biotin
+ Free PO43-
Ó¦Óÿ×ȸÂÌȾÁϼì²â ÓÎÀë PO43-
以酶为靶点
以酶为靶点进行的高通量筛选的优化及标准化涉及
以下几个步骤：
–
–
–
–
–
确定反应条件（如缓冲液、pH、温度）
天然或合成的底物的确定
酶动力学
信号窗口的评价
对已知抑制剂的反应情况
底物转变为产物后，分别使用显色反应、荧光或放
射性化学的方法等。适用的靶点不仅包括蛋白酶、
激酶和磷酸酯酶，也包括其它酶类，如DNA连接酶和
解旋酶。
细胞水平检测
ϸ °û ˮƽ
¼ì²â
ÒìÏà ¼ì²â
¾ùÏà ¼ì²â
΢ ÉúÎï ¼ì²â
²¸ È鶯Îï
ϸ °û ¼ì²â
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ÒÖÖÆ
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±¨¸æ»ùÒò¼ì²â
ϸ °û ¶¾ÐÔºÍ Ï¸
°û ÔöÖ³¼ì²â
»ì ºÏ ¼ì²â
ELISA
¼ì²â
荧光成像检测(FLIPR)
贴壁细胞或悬浮细胞中Fluo-3的荧光强度，间接反
映钙离子的浓度。在FLIPR实验中，可以用96孔或
384孔板对多个样品同时检测，测定荧光强度的过程
仅需1秒。可进行钙离子内流的动力学检测。
FLIPR functional screening assay
L

GTP
PLC
GDP
inositol phosphates
Fluorescent
dye
+
Ca2+
fluorescent signal
报告基因
• 报告基因受一个可诱导转录因子的调控，从而响应
受体的活动，并指导报告蛋白的合成。
• 对应不同的细胞株，可有多种报告基因和载体可供
选择。常用的有萤火虫荧光素酶(luciferase)、分泌
型碱性磷酸酯酶(secreted alakaline phosphatase,
SEAP) 、 氯 霉 素 乙 酰 转 移 酶 (chloramiphenicol
acetyltransferase, CAT) 、  - 半 乳 糖 苷 酶 (galactosidase)、-内酰胺酶和绿色荧光蛋白(GFP)。
The Two-Hybrid System
• Two hybrid proteins are generated with transcription
factor domains
• Both fusions are expressed in a yeast cell that
carries a reporter gene whose expression is under
the control of binding sites for the DNA-binding
domain
Bait
Protein
Activation
Domain
Prey
Protein
Binding
Domain
Reporter Gene
The Two-Hybrid System
• Interaction of bait and prey proteins localizes the activation
domain to the reporter gene, thus activating transcription.
• Since the reporter gene typically codes for a survival factor,
yeast colonies will grow only when an interaction occurs.
Activation
Domain
Prey
Protein
Bait
Protein
Binding
Domain
Reporter Gene
Quantum dots
• Invitrogen 公司的Qdot技术
– Quantum dots 是一种与蛋白质尺寸相当的半导
体材料，具有独特的荧光特性。已成为筛选药物
的有利工具。
• 荧光持续时间时间长，适合时间分辨检测。
Qdot的结构
• 颜色多样，在同一激发波下，不同尺寸的微利可发
出多种激发光，加上其表面可以耦联多种生物分子，
可同时标记多个靶点。
• 安全：细胞毒性低，可用于活细胞或者体内研究。
High Content Screening
High Content Screening
•
Cellomics
– ArrayScan
– KineticScan
•
Molecular Devices
– Discovery-1
Visualize and analyze cell populations
Identify sub-cellular protein localization
Perform multi-parameter analysis
Translocation Assay
• Live cell assays to detect translocation of
signaling proteins:
– primary screening
– lead profiling
• Pathway screening for functional effect, rather
than specific mode of action (e.g.: in vitro binding,
catalytic activity).
• Modulation of protein translocation is an
alternative to inhibition of catalytic activity: protein
translocation modulators.
Protein Translocation is Essential for
Intracellular Signaling
The PKB/Akt Pathway
Greater Selectivity with Translocation
Modulators
‘Active Site’ inhibitors often lack specificity and selectivity 
unwanted side effects.
Many signalling proteins with very different functions share
similar active sites - e.g. Protein Kinase C family.
X
X
X
Other binding sites
X
X
X
cPKC
nPKC
aPKC
ATP and Substrate binding sites
Other
binding sites
could beall
targets
for specific,
selective
inhibitors.
PKC
catalytic
inhibitors
act on
ATP-binding
site
GFP Fusion Proteins for Detecting
Translocations
promoter molecule of interest
GFP
• Make stable, transfected cell lines.
• Quantify intracellular translocations of
target in high throughput.
Membrane to Cytoplasm Translocation
Example
Pathway
Therapeutic
area
PLCd
Phosphoinositide
Many
MARCKS
PKC
Cancer,
Diabetes
Membrane Receptor
Receptors internalization
PLCδ-PH domain
Host cell type: CHO-hIR
Stimulation: ATP
Timescale: 5-20 sec
Target:
Many
Cytoplasm to Nucleus Translocation
Target:
Erk1
HeLa
Stimulation: FCS / hEGF
Timescale: ~10 min
Host cell type:
Example
Pathway
Therapeutic
area
p65 NFkB
TNF etc.
Inflammation
ERK1
MAPK
Cancer
p38
Stress
Inflammation
JNK
cJun
Cancer
-catenin
Wnt
Cancer
Nuclear
receptors
RXR, LXR,
estrogen etc.
Many
TFs
Transcription Many
Vesicle to Plasma Membrane
Translocation
Example
Pathway
Therapeutic
area
GLUT4
Insulin
Diabetes
Receptor
& channel
recycling
Endosomal Many
A human GLUT4 assay in Xcellsyz Ltd.
conditionally immortalized human fat and
muscle cell lines is under development.
GLUT4
Host cell type: CHO-hIR
Stimulation: Insulin
Timescale: ~20 min
Target:
Cytoplasm to Membrane Translocation
Example
Pathway
Therapeutic
area
PKC
Phosphoinositide
Cancer
PKC
Phosphoinositide
Diabetic
complications
PKC
Phosphoinositide
Cardiovascular
Akt/PKB
Growth factor
Cancer,
Diabetes
Arno
PI3-K
Many
-Arrestin GPCRs
Many
Assay read on IN Cell Analyzer with the
Membrane Spot Analysis Module (MSPO).
Akt1 / PKBa
Host cell type: CHO-hIR
Stimulation: IGF-1 / insulin
Timescale: ~5 min
Target:
要素二：化合物样品库制备
• 结构多样性（Chemical diversity）
• 类药性（Drug-like)
Lipinski规则
•
•
•
•
MW < 500
ClogP < 5
H bond donors < 5
H bond acceptors < 10
Properties of an “Average” Drug
Undesirable Compounds
•
•
•
•
•
•
•
•
Unstable
Reactive
Michael acceptor
Toxic
Liquid
General metal chelator
Polyaromatic
metallocompound
筛选样品来源
• 传统化学合成、分离
– 合成化合物
– 分离的天然产物纯化合物和粗提物、有效部位
• 组合化学合成
– 从化合物数量和结构多样性上，充实供筛选的化合物
库
• 与其他机构的合作、交换或购买
传统化学合成和分离
• 单个合成、分步纯化
• 一个化学工作者一年合成化合物的数量从不足一百个
特点：数量相对较少，但各化合物相关数据全，质量较高
对特定的靶点SAR明确，对一个全新靶点，这些知识有助于产
生新的先导化合物
组合化学
通过各反应单体之间的不同组合方式，在短时间内生成大量
的化合物（纯的单一化合物或单一化合物的混合物）供医药
研究或其他用途。如图示：
A
B
C
AB
A + B + C +......
A: A1, A2, A3...
B: B1, B2, B3,...
C: C1, C2, C3,....
.......
........
ABC
ABC.....
ABC...:
A1B1C1, A2B2C2, .......AxByCz
组合化学
特点：
– 化合物数量大，相对结构多样性
– 易于设计、合成---100,000 compounds (and more!) in a year
with a few chemists and automation
– SAR的产生
– Drug-like？
发掘天然产物资源
大自然是另外一个能提供具有结构多样性小分子有
机化合物的主要来源。
– 经典方法---分离纯化、结构鉴定、活性测试---费时、
效率低，远远不能满足现代高通量筛选的需要。这在一
定程度上影响了天然产物来源的样品在近年来的药物研
究中受重视程度。
– 从结构多样性的角度考虑，大自然可能给予我们的结构
多样性大大高于组合化学，因而天然产物或天然来源的
样品的重要性不容忽视。这也是现代天然产物化学研究
的新的切入点。
天然化合物库（Nature Product Pool）
尽管许多天然产物在一些特定生物模型上被筛选过，
但至今没有多少化合物在所有现存的模型上被广谱
筛选过的事实似乎给我们这样一种信息：随着新的
药物筛选模型的不断涌现，一些已知的天然化合物
可能会被发现具有全新的生物活性。
天然产物对新药发现和开发的重要性
•
•
•
天然产物，特别是植物中的天然产物作为药物用途
的历史非常古老，为什么自然界能产生对人体疾病
有效的物质？
为什么20世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了
兴趣？
为什么最近制药企业又对来源于天然物的先导化合
物产生了兴趣？
为什么自然界能产生对人体疾病有效的
物质？
化学家和生物化学家对次级代谢产物（所有非蛋白天然
产物）的产生提出了六种主要的假设，Haslam归纳如下：
1）次级代谢产物是无特定生理功能的单纯排泄物；
2）次级代谢产物曾经起过功能代谢作用，但目前其作用
已失去；
3）次级代谢产物是所有体内变化的产物，在生物体内没
有任何真正的作用；
4）次级代谢产物是进化过程中的一例，在新化合物产生
之前，次级代谢物是为了保存进化所必需的物质而存在；
5）次级代谢产物为初级代谢所不需要的酶提供发挥作用
的场所，重要的是次级代谢过程，而不是次级代谢产物；
6）次级代谢能产生防御物质和其他重要的生理活性物质，
对生物体的生存具有重要作用。
为什么20世纪后半叶对从天然产物寻找
新药失去了兴趣？
• 20世纪70年代末兴起的组合化学的发展使得短期
有效合成上万个化合物成为可能 ；
• 随着具有自动化系统的高通量筛选技术的发展，
每天可以筛选50000个以上的样品，为组合化学合
成的样品提供一种快速筛选方法；
• 天然生理活性物质分离的复杂化和大量生物材料
获得不易。
天然产物研究的复活
• 天然产物研究的成功
• 天然产物研究的独特性
• 新筛选方法的影响
根据新药的研发过程设计有效的天然产物研
究方法
•
•
•
•
•
•
•
天然材料的获得和提取
有效的筛选方法
天然生理活性物质的分离
快速有效的结构解析方法
生物学的评价
天然生理活性物质的大量获得
构效关系研究
天然产物或其类似物作为药品实例
61% of 877 small molecule drugs introduced
worldwide during the period 1981-2002 can be
traced to, or were inspired by, natural products.
洛伐他汀 (Lovastatin)(HMG-CoA抑制剂）
HO
R2
O
Me
O
Me
NaO2C
HO
O
O
H
O
H
H
Me
O
Me
R1
Me
H
HO
OH
O
H
H
CO2H
OH
H
F
Me
N
Me
Me
HO
Pravastatin
Compactin:R1=R2=H
Fluvastatin
Mevinolin: R1=CH3,R2=H
HO
HO
Simvastin:
R1=CH3,R2=CH3
CO2H
OH
H
F
CO2H
OH
F
Me
N
Me
Me
O
N
MeO
Me
Me
HN
Me
Cerivastin
Atorvastin
环孢菌素A（Cyclosporine A）
HO
O
N
N
O
O
N
O
真菌Trichoderma polysporum分离
O
N
O
O
N
H
H
HN
O
O
H
N
N
O
N
H
N
O
抑制器官移植排异反应的免疫抑制剂
紫杉醇
R2
R1O
NH O
3'
2'
OH
O
10
O
紫杉醇(1, Paclitaxel, Taxol)是
从太平洋红豆杉Taxus brevifolia
树皮中提取分离得到的天然二萜化
合物。
OH
13
HO
H
BzO AcO
1. Paclitaxel R1=Ac, R2=Bz
2. Docetaxel R1=H, R2=Boc
O
多 西 紫 杉 醇 (2, Docetaxel,
Taxotere)是在紫杉醇的结构修饰
和改造过程中通过半合成方法得到
的。
2001年全世界紫杉醇年销售额在20
亿美元以上，多西紫杉醇年销售额
达到10亿美元以上。这两种药物已
经成为当前，也是历史上最为畅销
的抗癌药物。
喜树碱及其衍生物
R2
R1
N
O
R3
(A)
N
N
O
N
O
O
H3CHO
O
Camptothecin R1=R2=R3=H
Topotecan R1=H,R2=CH2N(CH3)2,R3=OH
Irinotecan R1=CH2CH3,R2=H,R3=(A)
9-Aminocamptothecin R1=R3=H,R2=NH2
9-Nitrocamptothecin R1=R3=H,R2=NO2
喜树碱及其衍生物是DNA局所异构
酶Ⅱ (DNA toposomeraseⅡ 抑制
剂。
吗啡生物碱
HO
RO
Buprenorphone,活性为Morphine
25－50倍，成瘾性低于吗啡。
O
O
N
H
NCH3
H3CO
HO
HO
H
CH3
Morphine,R=H
Codeine,R=CH3
H
HN
CH3
HO
CH3
CH3
H3C
Pentazocine,活性仅为吗啡的30％，但成瘾性极低
天然产物研究的未来
利用组合化学合成“非天然的天然物”或“类天然产
物库”
多样性导向合成 (diversity-oriented synthesis)
Galanthamine 四环骨架化合物库的建立和分泌途径抑制剂
及高尔基-质膜运输抑制剂Secramine A 的发现
2527 compounds
were synthesized
Shair M D and Kirchhausen T. Nature chemical biology, 2006, 2: 39-46
Compound Storage
• Solid
– Long-term storage
• DMSO solution
– Long-term storage (10 year?)
– Working solutions
Compound plates
88 Compounds
80
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
A
• Mother Plates
– DMSO solutions from
vendors
• Daughter Plates
– DMSO solutions
– 1 mg/ml
• Assay Plates
–
–
–
–
B
C
D
E
F
G
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
Aqueous solutions
25 µg/mL compound
2.5% DMSO
20 µL
K
L
M
N
O
P
352 Compounds
Sample management technology
•
化合物库是医药公司和研究机构最宝贵的资产。其数量和质量的重要性需
要高可靠性的自动化储存和检索系统。
•
专业的样品管理公司可提供整套的样品管理产品，包括：
–
–
自动化的储存系统
•
大型系统可储存60,000,000样品。
•
储存环境温度可达到-80℃ 。
自动化样品处理设备
•
–
软件
•
–
样品称量、溶解，微孔板间复制，封膜，Cherry picking。
储存系统控制软件，样品管理系统软件。
耗材
•
微孔板，微试管，封膜，Barcode.
Sample management technology
• 瑞士Tecan公司的样品自
动化储存系统产品
REMP Large-size store (LSS)
TM
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要素三：自动化
• 自动化技术的应用，提高筛选效率，摆脱人为误
差因素
微孔板（Microplate）
• 微孔板（Microplate）是许多方法和解决方案的最终决定因素。尽管
近年来的芯片技术发展很快，但微孔板在生物医药研究中仍扮演着不
可替代的角色。正是微孔板的应用使人们提出了将多个反应管以平行
方式同时处理的概念，这些概念一定程度上大大促进了自动化筛选系
统和工作站的快速发展。
• 对于所有开发的仪器而言，微孔板是一个共同的标准，同时标准化的
要求也增加了现代自动化系统的可靠性。其中，96孔板和384孔板都
已经制定了相应的标准(Society of Biomolecular Screening task force
"Standards" in Automation and instrumentation)。但是其他的高密度
板，如864、1536、3456，甚至9600孔板目前还没有统一的标准。这
些标准或准标准板的使用已经大大地降低了筛选成本，同时增加了通
量。
Microplates
• 微孔板是筛选的载体，其制造技术也随着筛选技
术的发展而发展，包括：
– 微孔板的颜色和材料
– 微孔板微孔的设计和密度
– 微孔板材料的表面处理
Microplates from Corning
Matrix of Wells
Well
96
384
1536
96
Row
8
16
32
384
864 1536
Column
12
24
48
Volume
300
100
10
Microplates
• 微孔板的颜色和材料
颜色类型
应用
材料类型
应用
透明
光吸收检测
聚苯乙烯（PS）
疏水性，透明度高，多用于筛选
板
不透明
黑色：荧光检测
白色：化学发光检测
聚丙烯 （PP）
化学稳定性高，适合化合物储存
底部透明
细胞实验，底部检测
UV透射材料
光吸收率低，适合UV检测
Microplates
• 微孔板微孔的设计和密度
– 微孔板微孔密度的增加可以显著提高单位时间内筛选的通量。
– 节约成本。
– 提高筛选质量。
微孔密度
96孔
384孔
微孔容积 75-250 mL 20-100 mL
1536孔
3456孔
2-10 mL
1mL
Microplates
• 微孔板材料的表面处理
类型
应用
与生物分子无亲和力
Corning公司NBS 微孔板：均相生化测试
TM
非均相测试，
与生物分子高亲和力
例如：ELISA, DELFIA
Corning公司的CelllBind®微孔板：提高细胞贴壁性
为细胞组织培养特别处理
多聚赖氨酸表面：
超低细胞亲和力表面：降低细胞贴壁能力
共价处理表面
与DNA，碳链，巯基有特异的亲和力
微孔板设备
一般而言，一个自动化筛选系统的大多数组件总是围绕
微孔板而工作的，它们均可称为微孔板设备。
– 独立单元（Stand-alone）：指象洗板器、液体分配器
（Liquid Dispenser）和酶标仪等
– 工作站（Workstation）：能执行多重功能（通常指围绕
微孔板）的部分， 如液体转移装置（Liquid Handling）
可围绕微孔板执行多重功能
History –1980’s, Zymark
世 界 上 第 一 台 工 作 站 是 由 Zymark 公 司 开 发 的
BenchmateTM系统，它集成了精密天平、单通道加液
头、移液装置、振荡器和HPLC进样器等。通过一个
机械臂可以将不同的容器从一个工作台移至另一个
工作台，但这一系统主要是针对管形反应器设计而
设计的，并不适用于今天的微孔板。
第 一 台 基 于 于 微 孔 板 设 计 的 工 作 站 是 由 Beckman
Coulter开发的Biomek1000，它整合了单通道和多通
道的吸液、加液、洗涤和单通道检测（密度测定）
等组件部分。
Biomek2000： 使用可变换工具后变得更加灵活，如
不同的吸收器、分配器等。其特点是可以针对不同
的需要设计不同的操作程序。
BiomekFX：集成了更强大的功能，如多通道可同时、
亦可执行不同的任务，双手臂操作则更是增加了有
效性和操作速度。
Biomek® 2000 Automation
Workstation
自动化液体分配装置
Beckman Biomek FX
96-channel pipetting
head
High-capacity for
simultaneous liquid
transfer
Span-8 pipettor
Flexible with individual
movement and liquid
sensing capability for
hit picking and plate
reformatting
检测系统
• UV-visible Light Absorbance
• Fluorescence
– Fluorescence Intensity
– Time-resolved Fluorescence (TRF)
– Fluorescence Polarization (FP)
• Luminescence
• Radioactivity
Microplate Readers
SpectraMax Plus 384
SpectraMax Gemini XS
•
•
•
• Luminescence, fluorescence
and time-resolved
fluorescence
• Continuous 250-850 nm
• Read 96 wells, 27 sec; 384
wells, 2 min 30 sec
UV absorbance
Continuous 190 - 1000 nm,
Reads 96 wells, 5 sec; 384
wells,16 sec
VICTOR2 V Multi-label Reader
• Filter-based instrument
• Five technologies:
– Absorbance
– Luminescence
– Fluorescence
– Time-resolved
fluorescence
– Fluorescence
polarization
Microplate reader
• 最新的微孔板检测器具备高速，
高灵敏度，通用的特点。
– PerkinElmer公司的EnVision™ 检测
器可以在36s内完成对一块1536孔
板的荧光强度检测。
– 整合了光吸收，荧光强度，荧光偏
EnVision™
(PERKINELMER)
振，时间分辨荧光，化学发光，激
Safire²™ (TECAN)
光等多种检测手段。
SpectraMax M5
(Molecular Devices)
自动化系统(Automated Robotic System)
自动化系统是指集独立单元、工作站于一个特定的
功能环境，由一种总系统软件控制，由一至二个机
械臂完成微孔板在独立单元和工作站之间的转移工
作。可重复编程的机械装置系统，能自动重复完成
包括自动称量、液体转移、分离、仪器硬件的转移
等。
自动化系统的组成
•
•
•
•
•
机器人
控制器
机械手
伺服轨道
外围设备
微孔板设备：液体转移装置，培养箱，洗板器、液体
分配器和酶标仪等
机器人类型
• （关节机器人） Articulated arm robots
• （圆柱坐标机器人 ）Cylindrical coordinate robots
• （ 高架机器人） Overhead gantry robots
关节机器人 （ Articulated arm robots
ORCA Robot ）
圆柱坐标机器人（ Cylindrical
coordinate robots SEICO Robot ）
（ 高架机器人） Overhead gantry
robots
机械手
（Gripper ）
线形伺服轨道（Linear servo track）
机器人通常被安装到线形伺服轨道上，使它可以移
动到桌面的其他位置。如前所述，这一点极大增加
了机器人的有效工作空间，并使它在无人力干预的
情况下为更多的仪器服务。
典型的外围设备
（Typical peripheral devices）
•微孔板存放装置 （Microplate storage unit）
•条形码识别器 （Bar code scanner）
•液体转移（Liquid transfer）
•培养箱（ incubator）
Microplate storage unit
stacker
carousel
ORCA System
Thank You!