Transcript Ērlihiozes un ērču encefalīta izsaucēju molekulārā bioloģija

Ērlihiozes un ērču encefalīta izsaucēju
molekulārā bioloģija
(Projekts LU13 , 2003.g.)
Projekta vadītāji: Prof. V.Baumanis - LU Bioloģijas fakultāte
Prof. A.Žilevica - LU Medicīnas fakultāte
Izpildītāji:
R.Ranka
A.Bormane
A.Zeltiņa
L.Timša
V.Šķipars
K.Salmiņa
I. Zeltiņa
-
PhD stud.biol.
PhD stud.biol.
stud. pharm.
stud. biol.bac.
stud. biol.bac.
mag.biol.
PhD stud.med. RSU
Konsultanti: V.Sondore - Dr.med., Valsts Infektoloģijas centrs
B. Rozentāle - Dr.med., Valsts Infektoloģijas centrs,RSU
A.Dūks
- Dr.med., Sabiedrības Veselības aģentūra
Saslimšanas gadījumu skaits ar ērču
encefalītu Z-Eiropā un Krievijas ZR daļā
Latvijā 2003.g. - 365 saslimšanas gadījumi, t.i., 15,66 gadījumi uz 100 000 iedzīvotāju
Pētījumu aktualitāte
Saslimstība
Latvijā
Kur ir labāk
Kur ir sliktāk
(uz 100.000
iedzīvotājiem)
Ērču encefalīts
Erlichioze
12,8
?
0,01(Norv)
?
Laima borelioze
Babezioze
11,5
?
3,1(Norv)
?
15,8 (Est)
Zināms vienīgi,ka
Zviedrijā ap 5%
ērču inficētas
46,3 (Lt)
Vācijā 1,9% ērču
inficēts
Riketsiozes
?
?
Vācijā ~ 9% ērču
inficēts
Wollbachias
?
?
Vācijā ~ 1% ērču
inficēts
Koksiellozes
(Q drudzis)
?
?
?
Pētījumu mērķi
1. Izstrādāt minēto infekciju molekulārās detektēšanas
metodes uz polimerāzes ķēdes reakcijas pamata,jo:
a) ērču encefalīta vīrusu (TBEV), kā arī ērlihijas ir grūti kultivēt
b) lai noteiktu ērču inficētības pakāpi , nepieciešmi salīdzinoši
dati, kas iegūti ar dažādām metodēm
2. Veikt minēto infekciju molekulāro tipēšanu:
a) epidemioloģiskiem pētījumiem
b) mikroorganismu celmu dažādās patogenitātes analīzei, jo piemēram,
ērču encefalīts (TBE) raksturojas ar ļoti dažādu klīnisko formu
smagumu, kuru cēlons nav zināms
c) mikroorganismu evolūcijas prognozēšanai
d) terapijas un profilakses pasākumu izstrādāšanai - vai ir atbilstība
starp Latvijā lietoto vakcīnu vīrusu genotipiem un ērču vīrusiem
3. Mēģināt raksturot virēmijas intensitāti un ilgumu ,
salīdzinot to ar TBE klīniskās formas smagumu
TBEV subtipu izplatība Eirāzijā
•
•
•
Rietumu subtips- pārnēsā I.ricinus (dzeltens)
letalitāte 0,5 - 2 %
Tālo Austrumu subtips- pārnēsā I.persulcatus (sarkans) - letalitāte 1 - 4 %
sastopami abi subtipi (oranžs)
TBE diagnosticēšanas metodes
Tiešās
(vīrusa noteikšana)
• RT- PCR
• Elektronmikroskopija
• Vīrusu kultivēšana
Netiešās
(antivielu noteikšana)
• ELISA
• Immunoblotēšana
• Hemaglutinācijas
inhibīcijas tests (HIT)
• Vīrusu neitralizācijas
tests (NT)
• Komplementa
fiksācijas reakcija
(CFR)
TBEV struktūra
Sastāv no trīs
strukturālajiem
proteīniem:
• E- apvalka glikoproteīns
(imunogēnais)
• M- membrānas
glikoproteīns
• C- kapsīdas proteīns
Ērču encefalīta vīrusa genoms un tā tipēšana
Vienpavediena RNS , dažādiem celmiem 10.927-11.141 nukleotīdu gara,
kodē 3 struktūras proteīnus:
V1(M) - kopā ar E proteīnu piedalās apvalka veidošanā
V2(C) - core proteīns
V3(E) - apvalka proteīns, glikoproteīns, ar hemaglutinīna īpašībām,
šis antigēns inducē neitralizējošo antivielu biosintēzi
7 nestrukturālie proteīni NS1, NS2A, NS3, NS4A, NS4B, NS5, tie
sintezējas kā poliproteīns, kurš vēlāk sašķeļas, funkcijas nezināmas
Detektēšanai izmanto:
5’- terminālā gala nekodējošā rajona 128 nukleotīdu garu fragmentu
Detektēšanai un tipēšanai izmanto:
NS5 proteīna kodējošā rajona 252 nukleotīdu garu fragmentu
Darba shēma
• Ērču materiāla savākšana
• Klīniskā materiāla izvēle
• TBE vīrusa RNS izolēšana (fenola - hloroforma metode vai
QIAamp® Viral Mini Kit)
• Ērlihiju nukleīnskābes izolēšana - fenola - hloroforma
metode
• Ērlihiju DNS fragmentu PCR amplifikācija
• TBEV cDNS sintēze (reversā transkripcija)
• Rezultātu analīze 2,5% agarozes gēlā vai 8% PAAG
• Atsevišķu amplikonu skvenēšana
Metodes jūtības noteikšana
TBEV 5'NCR rajona RT-PCR amplifikācijas
produktu elektroforētiska analīze 8% PAAG
gēlā
1. celiņš - DNS garuma
marķieris
2., 3., 4., 5., 6., 7., 8., 9.
celiņi - ērču encefalīta
K23
celma
antigēna
(Encepur
vakcīna)
atšķaidījumi, solis - 10x
184bp
124bp
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
Sekvenēšanas rezultāti pierādīja
amplikonu specifiskumu
6. celiņš robežatšķaidījums, 9,8 fg
TBE vīrusa RNS
10. celiņš - negatīvā
kontrole
• TBE vīrusa nekodējošā rajona (5’NCR)
fragmenta RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) metodes jūtība
tika noteikta 9,8 fg TBE vīrusa RNS
• TBE vīrusa NS5 gēna fragmenta RT-PCR
metode uzrādīja zemāku jūtību - apmēram 900
fg TBE vīrusa RNS
TBE vīrusa detektēšana ērcēs I
TBEV 5'NCR rajona RT-PCR amplifikācijas produktu
elektroforētiska analīze 2,5% agarozes gēlā.
3., 4. celiņš- Encepur vakcīna (172
bp)
5.celiņšKrievijā
ražota
TBE
vakcīna
2.celiņš- negatīvā kontrole
1.celiņš- DNS garuma marķieris
267bp
184bp
1
2
3
4
5
267bp
234bp
213
192
184
1
2
3
4
5
6 7
8
9 10 11
1., 5., 7., 8.celiņš- PCR produkti no
neinficētām ērcēm
2., 3., 4., 6.celiņš- PCR produkti
no inficētām ērcēm
11.celiņš - DNS garuma marķieris,
10.celiņš- pozitīvā kontrole
9.celiņš- negatīvā kontrole
TBE vīrusa detektēšana ērcēs II
TBEV NS5 gēna fragmentu RT-PCR amplifikācijas
produktu elektroforētiska analīze 8% PAAG gēlā.
267bp
234bp
1
2
3
4
5
6
7
1.celiņš- pozitīvā kontrole (252 bp)
2.celiņš- DNS garuma marķieris
3.celiņš- negatīvā kontrole
5.celiņš- PCR produkts no inficētām
ērcēm
6.,
7.celiņšPCR
produkti
no
neinficētām ērcēm.
TBEV detektēšana ērcēs III
• Tika analizēti 12 ērču grupu (60 ērces, pa 5 vienā grupā)
un 22 individuālu ērču paraugi, RNS izolēšanai izmantoja
fenola-hloroforma metodi
• no 22 individuālajām ērcēm, kas bija piesūkušās cilvēkiem,
17 iepriekš bija noteiktas TBEV pozitīvas ar ELISA metodi,
ar 5’NCR fragmenta RT-PCR metodi pozitīvu rezultātu deva
1 paraugs (glabāti paraugu lizāti)
• ar 5’NCR fragmenta RT-PCR metodi TBEV pozitīvas bija 7
no 12 dabā savākto ērču grupām (11%)
• ar NS5 gēna fragmenta RT-PCR metodi TBEV pozitīvas bija
3 no 12 dabā savākto ērču grupām (5%)
Sabiedrības veselības aģentūras dati
(2003.g. - 6,7%)
(2003.g. ~ 18%)
TBEV detektēšana asins plazmas
paraugos
• Ar TBEV 5’NCR fragmenta RT-PCR metodi tika
analizēti 13 TBE slimnieku asins plazmas paraugi,
vīrusa RNS izolēšanai tika izmantots QiAamp Viral
Mini-kits
• Paraugi bija ņemti no dažādiem slimniekiem, un
visos paraugos iepriekš ar ELISA metodi bija
apstiprināta specifisko antivielu pret TBEV
klātbūtne, antivielu titrs paraugiem bija dažāds
• Ar TBEV 5’NCR fragmenta RT-PCR metodi visi 13
asins plazmas paraugi uzrādīja negatīvu rezultātu
Erlihiju taksonomisko raksturojumu
mēģina precizēt pēc 16S rRNS secības
Ērlihiju detektēšanai izmantotais 16S rRNS
gēna fragments
Polimerāzes
ķēdes
reakcijas
dati rāda,
ka ērlihijas
Latvijas
ērcēs ir
546.bp
+kontrole
Secinājumi
• RT-PCR metode ir perspektīva TBE vīrusa detektēšanai
ērču materiālā, nākotnē šī metode varētu sniegt
iespēju diferencēt dažādos TBE vīrusa subtipus
• Izvēlētās RT-PCR metodes jūtība ir pietiekoši liela, taču
tās pielietošanu ierobežo neskaidrā virēmijas aina TBE
slimniekiem un RNS nestabilitāte
• Pirmoreiz Latvijā ar molekulāram metodēm pierādīta
ērču inficētība ar ērlihijām
Neatrisinātie jautājumi
• Vai virēmija TBE gadījumos ir vai nav novērojama un ja ir, tad:
a) kurā slimības stadijā to novēro
b) vai virēmijai ir kāda saistība ar antivielu titru
c) vai vīruss nesorbējas uz eritrocītiem
• Kādu sugu ērcēs , to attīstības stadijās biežāk novērojama to
inficētība ar TBEV un ērliijām
• Kāda genotipu TBEV un ērlihiju variabilitāte sastopama Latvijā
• Vai ir kāda sakarība starp TBEV genotipu un TBE klīniskās formas
smagumu
• Vai cilvēki Latvijā ar ērlihiozēm neslimo, vai tās vienkārši netiek
atklātas
• Kuri gēnu produkti ir mikroorganismu patogenitātes faktori un
kuri gēnu produkti izraisa neitralizējošo antivielu vai šūnu
imunitātes atbildi
• Makroorganisma nozīme minēto infekciju gaitā
• Kā evolucionē mikroorganismu ģenētiskie tipi
Publikācijas, disertāciju darbi un uzstāšanās par
projekta rezultātiem
1. R.Ranka, A.Zeltiņa , A.Bormane, I.Zeltiņa.Ērču encefalīta vīrusa detektēšana
ar molekulārās bioloģijas metodēm - Latvijas Universitātes 62. Zinātniskā
konference , 2004.g.
2. Bormane A., Lucenko I., Duks A., Mavchoutko V., Ranka R., Salmina K.,
Baumanis V. Vectors of tick-borne diseases and epidemiological situation in
Latvia in 1993-2002. International Journal of Medical Microbiology. 2003, v.293,
36-47.
3. R.Ranka. Ērču izraisīto infekciju - laima slimības un encefalīta molekulārā
diagnostika. Disertācija aizstāvēta 2004.g.2.jūnijā
4. A.Bormane. Ixodes ērču un to pārnēsāto patogēnu pētījumi.
Pašreiz norit eksperimentālā materiāla vākšana disertācijai (aizstāvēšana
tiek plānota uz 2005-6.g.)
5. Bormane A., Ranka R., Salmina K., Lucenko I . Natural foci of tick-borne
diseases and epidemiological situation in Latvia during the last decade. VII
International Simposium on Tick-borne diseases, Berlin, 2003
6. R.Ranka, A.Bormane, V.Baumanis. Molecular studies on tick-born disease
causing agents in Latvia. Abstracts of 29th FEBS Congress. Warsaw, Poland,
June 26-30,2004 (accepted).
Saskarsme ar citiem pētniecības projektiem
LZP projekts 02.0924 - Latvijā sastopamo Borrellia sugu un Borrelia
burgdorferi tipu molekulāri ģenētiska izpēte
Iesniegts projekts EC 6. Satvaram : EDEN - Tick-born diseases.
Koordinators S.E.Randolf , Oxford University, UK.
Kā līdzdalībnieki ir 13 valstis
Iesniegts projekts EC 6. Satvaram: PatoGenoMics.
Koordinators W.Diekmann (Vācija)
Kā līdzdalībnieki 8 valstis