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MICROBIOLOGIA E
LABORATORIO
CORSO IFTS
“TECNICO SUPERIORE DEI
PRODOTTI AGROALIMENTARI”
PROF. G. D’ANGELO
LA MICROBIOLOGIA
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La Microbiologia studia i batteri, le alghe, i funghi, i protozoi, i virus e, di
conseguenza, le sue branche hanno assunto la loro denominazione da
questi microrganismi (Batteriologia, Immunologia, Algologia, Micologia,
Protozoologia, Virologia)
La Microbiologia ha molte aree di applicazione tanto nel campo alimentare
e farmaceutico, quanto in quello delle malattie dell’uomo, degli animali e dei
vegetali. Esiste poi una microbiologia del suolo e delle acque.
La Microbiologia degli alimenti si interessa anche della prevenzione del
degrado del prodotto alimentare, del miglioramento dei prodotti in termini di
valore nutritivo, di aroma, di sapore e della qualità generale dell’alimento.
La Microbiologia dei prodotti lattiero-caseari si interessa della manifattura
dei formaggi, degli yogurt e di altri prodotti similari. Un’altra importante
prerogativa di questo settore è quella della produzione di alimenti privi di
microrganismi patogeni..
CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEL
LABORATORIO
•
DISINFEZIONE E PRINCIPALI DISINFETTANTI
CHIMICI
1.
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9.
ALCOOLI
ALDEIDI
FENOLI
ALOGENI
OSSIDANTI
ACIDI E ALCALI
DETERGENTI SINTETICI
AMMONIO QUATERNARIO
METALLI PESANTI
1.
2.
3.
ALCOOL ETILICO, ISOPROPILICO, GLICOLE BUTILENICO (DENATURAZIONE DELLE PROTEINE)
ALDEIDE FORMICA, ALDEIDE GLUTARICA (FORMALINA = 40% VOL, LISOFORMIO = FORMALDEIDE IN
SOLUZIONE SAPONOSA, PARAFORMIO = FORMALDEIDE IN COMPRESSE O TAVOLETTE)
ACIDO FENICO o FENOLO, CRESOLO (2-metilidrossibenzene [o-cresolo]. il cresolo si presenta come un
liquido scuro oleoso all’apparenza. E’ composto dal 50% di oli aromatici e cresoli; questi ultimi sono la
sostanza attiva e sono presenti in concentrazione compresa tra il 17 e il 18%. Il resto è costituito da acqua e
tensioattivi (detergenti) che hanno il compito di disperdere la parte attiva nell’acqua di diluizione; ), LISOLO
(soluzione saponosa di cresolo grezzo, dotata di potere disinfettante ), CREOLINA (La composizione era formata da
olio di catrame, saponi, soda caustica e pochissima acqua. I suoi usi divennero molteplici, a partire dal campo umano, zootecnico,
civile e veterinario. Inoltre, l'uso della creolina, in campo di opere di restauro motoristico, viene usata per riportare allo splendore
), ECC.
CLORO, IPOCLORITI (moscan 15% cloro attivo, caporite: ipoclorito di calcio ) , CLORAMINE (Derivati
dell’ammoniaca (uno o più atomi di idrogeno vengono sostituiti con il cloro) Ha la stessa attività degli ipocloriti,
ma più lenta e dura più a lungo Se ingerita può provocare insufficienza respiratoria, AMUCHINA
(OSSICLORURO DI CALCIO)
ACQUA OSSIGENATA, AC. PERACETICO
Ac. CLORIDRICO, SOLFORICO, IDROSSIDI, CARBONATI
DETERGENTI ANIONICI, CATIONICI(COMPOSTI QUATERNARI DELL’AMMONIO), ANFOLITI
MERCURIO, ARGENTO
FUNGICIDI, ANTISETTICI SPRAY A BASE DI FENOLO E AMMONIO QUATERNARIO, SAPONI NEUTRI A
BASE DI O-FENILFENOLO
originale di fonderia, le parti in alluminio macchiate da olio e dai vapori dello stesso
•
1.
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5.
Il cloro uccide gli agenti patogeni come batteri e virus rompendo i legami chimici delle loro molecole. I disinfettanti usati a tale fine consistono in composti di cloro che possono
scambiare atomi con altri composti, quali enzimi batteri ed altre cellule. Quando gli enzimi entrano in contatto con il cloro, uno o più atomi della molecole di idrogeno sono
sostituiti dal cloro. Ciò la deformazione o il deterioramento dell'intera molecola. Quando gli enzimi non funzionano correttamente, la cellula o il batterio muoiono.
Quando si aggiunge all'acqua cloro, si formano gli acidi ipocloritici:
Cl2 + H2O -> HOCl + H+ + ClA seconda del valore del pH una parte degli acidi ipocloridrici si trasforma in ioni ipoclorito:
Cl2 + 2H2O -> HOCl + H3O + ClHOCl + H2O -> H3O+ + OClEssi si scindono in ioni di cloro e ossigeno:
OCl- -> Cl- + O2L'acido ipocloroso (HOCl, che è elettricamente neutro) e gli ioni ipoclorito (OCl-, elettricamente negativi) formano cloro libero quando legati insieme, realizzando la disinfezione.
Le due sostanze hanno un comportamento diverso. L'acido ipocloridrico è più reattivo ed è un disinfettante più forte rispetto all'ipoclorito. Esso inoltre e' scisso in acido cloridrico
(HCl) ed ossigeno atomico (O). L'atomo di ossigeno è un potente disinfettante. Le proprietà di disinfezione del cloro in acqua si basano sul potere ossidante degli atomi di
ossigeno liberi e sulle reazioni di sostituzione del cloro.
L'acido peracetico (C2H4O3) e' una miscela di acido acetico (CH3COOH) e perossido di idrogeno (H2O2) in una
soluzione acquosa. E' un liquido luminoso, incolore che ha un odore pungente a pH basso (2,8). L'acido
paracetico e' prodotto tramite reazione tra perossido di idrogeno ed acido acetico:
O
O
||
||
CH3-C-OH + H2O2 -> CH3C-O-OH + H2O
acido acetico + perossido di idrogeno -> acido peracetico
L'acido peracetico può anche essere prodotto tramite ossidazione dell'acetaldeide. L'acido peracetico è prodotto
solitamente in concentrazioni di 5-15%.
Quando l'acido peracetico si dissolve in acqua, si scinde in perossido di idrogeno ed acido acetico, degenerano in
acqua, ossigeno e anidride carbonica. I prodotti di degradazione dell'acido paracetico non sono tossici e possono
dissolversi facilmente in acqua.
L'acido peracetico è un ossidante molto potente; il potenziale di ossidazione supera quello di cloro e diossido del
cloro.
Il cloruro di benzalconio (o benzalconio cloruro) è una miscela di sali di ammonio quaternari, più
esattamente è una miscela di cloruri di alchil-benzil-dimetilammonio, in cui il gruppo alchile varia dall'ottile
(C8H17-) all'ottadecile (C18H37-).
A temperatura ambiente è un solido giallo chiaro deliquescente (fonde a bassa temperatura), molto solubile in
acqua, in acetone e in etanolo, dall'odore aromatico intenso.
Trova impiego principalmente cone battericida e spermicida in numerosi preparati destinati all'uso quotidiano:
disinfettanti, colliri, collutori, creme spermicide.
Tego® 51 è un disinfettante anfotero ad alta tensioattività, di sicura e rapida azione contro lieviti, funghi, batteri
grampositivi e gramnegativi, inodoro.
Tego® 51 è utilizzato nella disinfezione di pareti, pavimenti, piani di lavoro, apparecchiature, nastri trasportatori
precedentemente detersi.
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DISINFETTANTI
Etanolo (alcool etilico), isopropanolo (alcool isopropilico) : Ampio spettro d'azione, rapida attività senza
residui nell'ambiente; non è attivo sulle spore e sulle oocisti dei coccidi, per l'azione battericida il tempo
richiesto è di 5-10 min., troppo lungo rispetto all'alta percentuale di evaporazione. Agiscono distruggendo
le membrane cellulari in seguito a estrazione dei lipidi, nonché denaturando le proteine microbiche e
disidratando la cellula microbica; quando l’alcool si trova in forma idrata viene rapidamente assorbito e
penetra all’interno della cellula; viceversa l’alcool puro tende a richiamare acqua sulla superficie cellulare
e a produrre fenomeni coagulativi nella membrana citoplasmatica, che proteggono parzialmente le
cellule batteriche dal disinfettante;
Iodoformi (Lo iodoformio (nome IUPAC: triiodometano) è un alogenuro alchilico. A temperatura
ambiente si presenta come un solido giallo.
Trova impiego come antisettico e disinfettante; si ottiene dalla reazione dello iodio e dell'idrossido di
potassio con l'alcol metilico.): Ampio spettro d'azione, bassa tossicità acuta, tempo d'attività antimicrobica
elevato, associabile ad altri disinfettanti, possibilità di colorazioni delle superfici trattate, potere corrosivo
sui metalli, molto tossico per gli anfibi, inefficace contro Cryptosporidium spp., possono risultare caustici
se non vengono diluiti.
Fenoli: Ampio spettro d'azione, irritazioni cutanee da frequente uso, alcune formulazioni sono inefficaci
contro i virus, oocisti di coccidi, spore batteriche, trattenute da materiale poroso, difficoltà di eliminazione
da esso, possono essere molto tossici per i rettili. L’azione germicida del fenolo sembra associata alla
sua capacità di denaturare le proteine. Il fenolo in soluzione si adsorbe sulle cellule batteriche e riesce ad
oltrepassare la membrana per le sue proprietà lipofile. Si lega quindi (attraverso legami idrogeno) alle
proteine batteriche, alterandone la struttura e compromettendo la loro attività naturale.
Sali quaternari d'ammonio (es. benzalconio cloruro benzalconio cloruro): Elevato spettro d'azione,
basso costo, medio-bassa tossicità,agente di scelta contro Cryptosporidia spp., l'attività disinfettante può
essere ridotta dal contatto di sapone ed acqua "dura", materiale organico, fibre (cotone, lana), inefficace
contro oocisti e spore, spesso inefficace contro Pseudomonas.
Ipoclorito di sodio (varechina, amuchina): Poco costoso, ampio spettro di attività anche contro alcuni
virus, rapida azione disinfettante, non facilmente miscelabile ad altri disinfettanti/detergenti.
Glutaraldeide: Elevata azione disinfettante, sterilizzante per la strumentazione in ca. 10 ore, irritante,
corrosivo, elevata attività residua nell'ambiente, elevata tossicità.
Perossido di idrogeno (acqua ossigenata), acido acetico: Bassa tossicità acuta, corrosivi per alcuni
metalli.
Ossido di etilene: Per la sterilizzazione degli strumenti, molto tossico per l'uomo e gli animali, esplosivo
e infiammabile ad elevate concentrazioni, cancerogeno, costoso. L'ossido di etilene uccide batteri, muffe
e funghi; trova uso come agente sterilizzante come alternativa alla pastorizzazione per quei prodotti che
verrebbero danneggiati dal calore. Viene inoltre usato per la sterilizzazione dei materiali e degli strumenti
usati in chirurgia.
La maggior parte dell'ossido di etilene trova impiego come intermedio nella produzione di numerosi altri
composti chimici. Il principale di essi è il glicol etilenico, usato nell'industria automobilistica come antigelo
e come liquido di raffreddamento. Viene usato anche nella preparazione dei poliesteri.
FILTRAZIONE
QUANDO IL MATERIALE NON PUO’ ESSERE STERILIZZATO SI FILTRA CON FILTRI
DI CAOLINO, FARINA FOSSILE, ACETATO DI CELLULOSA AVENTI PORI DI
DIAMETRO OPPORTUNO(micron)
L’apertura in micron dei pori delle membrane è la seguente:
• Lieviti 0,8
• Flora batterica del vino 0,65
• Sterilizzazione dell’acqua 0,2
• Flora microbica dell’acqua 0,45
ULTRASUONI
•
CON FREQUENZE SUPERIORI AI 20 K HERTZ NELLE CELLULE SI VERIFICANO
PRECIPITAZIONI DI PROTEINE, ROTTURA DI MOLECOLE COMPLESSE,
COAGULAZIONE, ECC. Efficaci sono i trattamenti, da 2 a 20 minuti, con frequenze
da 175 a 1500 K Hertz
RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE
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Raggi gamma: < di 1 nm (ottenuti per bombardamento del Co-60. Uso permesso solo
per la inibizione della germogliazione di patate, cipolle e aglio e per la sterilizzazione
di materiali monouso)
Raggi X: da < di 1 nm a 100 nm
Raggi ultravioletti: da 100 a 380 nm (prodotti da lampade a vapori di mercurio, non
hanno azione sulle spore batteriche)
Luce bianca: da 380 nm a 750 nm
Raggi infrarossi:da 750 nm a < di 1mm
Microonde: da < di 1 mm a 12 cm
Onde radio: > 12 cm
STERILIZZAZIONE
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LA STERILIZZAZIONE SI PREFIGGE LA DISTRUZIONE DI OGNI
ORGANISMO VIVENTE, SPORE BATTERICHE COMPRESE
LA STERILIZZAZIONE PUO’ AVVENIRE MEDIANTE CALORE UMIDO IN
AUTOCLAVE A 121°C PER 15 min. O MEDIANTE CALORE SECCO IN
STUFE TERMOSTATICHE A 180°C PER 1 ORA (VETRERIA E
MATERIALE DI LABORATORIO)
STERILIZZAZIONE PER FLAMBATURA
PASTORIZZAZIONE
•
E’ UN PROCESSO DI RISANAMENTO INDUSTRIALE IN CAMPO
ALIMENTARE. AD ESEMPIO IL LATTE VIENE PASTORIZZATO A 72°C
PER ALMENO 15 SECONDI
TECNICHE DI CONSERVAZIONE DEGLI
ALIMENTI
Microrgani
smi
T.C° minima
T.C° massima T.C° optimum Generi/Specie
Psicrofili
-5/+5
15/20
12/15
Psicrotrofi
-5/+5
30/35
25/30
Mesofili
-5/+15
35/47
30/40
Termofili
30/45
60/90
55/75
Pseudomonas,
Aeromonas,Yer
sinia, Listeria,
Clostridium,stafi
lococchi,
salmonelle,lievit
i, muffe
Tranne Listeria monocytogenes e yersinia enterocolitica, i principali batteri patogeni
responsabili di intossicazioni alimentari (Clostridium botulinum, C. perfrigens,
stafilococchi salmonelle) sono inibiti sotto i 3°C
CONGELAMENTO E SURGELAMENTO
•
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La differenza tra tale tecnica di conservazione e il congelamento è che nel primo
caso le basse temperature vengono raggiunte più rapidamente fino al cuore
dell’alimento, in questo modo l’acqua e i liquidi cellulari solidificando formano dei
piccolissimi cristalli; nel congelamento, invece, i tempi più lunghi determinano la
formazione di cristalli più grandi i quali nel processo di dilatazione provocano delle
lesioni nei tessuti cellulari e, nella successiva fase di scongelamento, una maggiore
perdita di liquidi
Il surgelamento è regolato da una precisa legislazione secondo la quale i cibi devono
essere portati ad una temperatura di -18 °C in un tempo massimo di 4 ore, una volta
surgelati devono essere venduti in confezioni chiuse che riportino precise indicazioni
relative alla conservazione e alla procedura ottimale di scongelamento e, inoltre,
deve essere rispettata la catena del freddo senza interruzioni dall’iniziale
surgelamento fino al momento dell’acquisto.Infatti la sopravvivenza di un batterio in
sospensione acquosa portata a -18°C è molto più alta che non a -2°C. Infatti le basse
temperature mantengono una maggiore integrità enzimatica. Non a caso i ceppi
microbici vengono conservati a bassissima temperatura(neve carbonica o azoto
liquido)
Le categorie alimentari che possono essere sottoposte a surgelazione sono la carne
e i derivati, il pesce, le verdure e gli ortaggi, i prodotti lattiero-caseari, gli alimenti
precotti.
ESSICCAMENTO
•
•
L’acqua funziona da solvente dei nutrienti e come agente chimico nelle
reazioni di idrolisi, dalle quali si ottengono composti (amminoacidi,
carboidrati, grassi) fondamentali per la formazione di nuove molecole e per
la produzione di energia
Attività dell’acqua: indica l’acqua libera di un mezzo disponibile per reazioni
chimiche. Aw = n2/(n1+n2) n1 = numero di molecole di soluto; n2 = numero
di molecole di solvente. Aw diminuisce con l’aumentare della
concentrazione.
LIOFILIZZAZIONE
•
Consiste nell’allontanamento dell’acqua per sublimazione. Il prodotto finito
ha un contenuto in acqua del 2-5% facilmente reidratabile. La liofilizzazione
non distrugge la flora microbica
ADDITIVI CONSERVANTI
•
I conservanti hanno lo scopo di distruggere la microflora presente negli
alimenti per ritardarne i processi alterativi o per conservare nel tempo le
caratteristiche chimico-fisiche e/o esaltarne favorevolmente particolari
caratteristiche di aspetto, forma sapore, odore Un additivo alimentare
diventa, esso stesso o un suo derivato, un componente dell’alimento
medesimo
•
•
•
•
•
La maggior parte dei conservanti agisce in ambiente acido. L’intervallo di
pH per la moltiplicazione batterica varia da 4,5 a 9 con un optimum a pH 7. I
batteri lattici sopportano ambienti acidi sotto 3,5
Nelle carni l’assenza dell’ossigeno determina la diminuzione del pH per via
della fermentazazione lattica
L’azione antimicrobica del cloruro di sodio è legata al suo effetto di
depressione dell’attività dell’acqua (Aw = n2/n1+n2 dove n1 = numero di
molecole di soluto e n2 = numero di molecole di solvente) e per gli ioni cloro
liberati.
In salumeria si impiegano i nitrati di sodio e potassio che vengono
trasformati dai batteri alotolleranti in nitriti.
Per gli alimenti si usano additivi conservanti organici quali il difenile e gli
acidi sorbico, formico, propionico che agiscono in particolare contro funghi e
lieviti
ANTIMICROBICI
Nota: La lettera E indica che il singolo additivo è stato approvato dalla CEE. Tutti gli additivi, approvati e non, riportano attualmente la E.
Cod.
Denominazione chimica
Eventuale tossicità
E 200
Acido sorbico
--
E 201
Sodio sorbato
--
E 202
Potassio sorbato
--
E 203
Calcio sorbato
--
E 210
Acido benzoico
Sostanza particolarmente tossica, con dose
massima
giornaliera
accettabile,
secondo le tabelle del comitato
FAO/OMS molto bassa ( 5 mg per Kg
di peso al giorno).
E 211
Sodio benzoato
Come sopra
E 212
Potassio benzoato
Come sopra
E 213
Calcio benzoato
Come sopra
E 214
Etile p-ossibenzoato
Come sopra
E 216
Propile p-ossibenzoato
Come sopra
E 217
Sale sodico dell'estere propilico dell'acido possibenzoico
Come sopra
E 218
Metil-p-ossibenzoato
Come sopra
E 219
Derivato sodico dell'est. met. delI'acido possibenzoico
Come sopra
E 220
Anidride solforosa
Sostanza abbastanza tossica, interferisce col
metabolismo di alcuni aminoacidi ed
inattiva la Vit.B1.
E 221
Sodio solfito
Poduttore di E220, ha gli stessi effetti tossici
E 222
Sodio bisolfito
Come sopra
E 223
Sodio metabisolfito
Come sopra
E 224
Potassio metabisolfito
Come sopra
E 226
Calcio solfito
Come sopra
E 227
Calcio bisolfito
Come sopra
E 228
Potassio solfitoacido
Come sopra
230
Difenile
Sostanza molto tossica ( dose giornaliera
accettabile pari a 0,005 mg per kg di
peso al giorno). Attenzione, è usato
come antimuffa sugli agrumi.
E 231
Ortofenilfenolo
Della stessa categoria del difenile, composto
molto tossico.
E 232
Orfofeilfenato di sodio
Come sopra
E 233
Tiobendazolo
Tossico
E 235
Pimaricina
Tossico
E 236
Acido formico
Tossico
E 237
Formiato di sodio
Tossico
E 238
Formiato di calcio
Tossico
E 239
Esametilentetramina
Tossico
E 240
Aldeide formica
Tossica e canceroren
SOSTANZE DESTINATE PRINCIPALMENTE AD ALTRI USI,
MA AVENTI UN EFFETTO CONSERVATIVO SECONDARIO
Cod.
Denominazione chimica
Eventuale tossicità
E 249
Potassio nitrito
Si
possono
formare
composti
chiamati
"nitrosamine", alcune delle
quali
sono
ritenute
cancerogene. Se questi
composti sono associati
all'acido ascorbico (Vit.C),
denominato E300, E301,
E302,
questo
rischio
diminuisce.
E 250
Sodio nitrito
Come sopra
E 251
Sodio nitrato
Come sopra
E 252
Potassio nitrato
Come sopra
E 260
Acido acetico
--
E 261
Potassio acetato
--
E 262
Sodio diacetato
--
E 263
Calcio acetato
--
E 270
Acido lattico
--
E 280
Acido propionico
--
E 281
Sodio propionato
--
E 282
Calcio propionato
--
E 283
Potassio propionato
--
E 290
Anidride carbonica
--
E 325
Sodio lattato
--
E 326
Potassio lattato
--
E 327
Calcio lattato
--
E234
Nisina
Antibiotico
ANTIOSSIDANTI
E 300
Acido L-ascorbico
--
E 301
Sodio L acorbato
--
E 302
Calcio L ascorbato
--
E 304
L ascorbile palmitato
--
E 306
Estratti di origine naturale
ricchi di tocoferoli
--
E 307
Alfa tocoferolo di sintesi
--
E 308
Gamma
sintesi
E 309
Delta tocoferolo di sintesi
--
E 310
Gallato di propile
Sostanza sospetta
E 311
Gallato di ottile
Come sopra
E 312
gallato di dodecile
Come sopra
E 320
Butilidrossianisolo
Sostanza sospetta, perchè
non presente in natura
E 321
Butilidrossitoluolo
Come sopra
E330
Acido citrico
--
E 331
Citrati di sodio
--
E 332
Citrati di potassio
--
E 333
Citrati di calcio
--
E 335
Tartrati di sodio
--
E 336
Tartrati di potassio
--
E 337
Tartrato doppio di sodio e
potassio
--
tocoferolo
di
--
STABILIZZANTI, ADDENSANTI E GELIFICANTI
STABILIZZANTI, ADDENSANTI E GELIFICANTI
E 339
Ortofosfati di sodio
--
E 340
Ortofosfati di potassio
--
E 341
Ortofosfati di calcio
--
E 400
Acido alginico
--
E 401
Alginato di sodio
--
E 402
Alginato di potassio
--
E 403
Alginato di ammonio
--
E 404
Alginato di calcio
--
E 405
Alginato di propilenglicol
--
E 406
Agar-agar
--
E 407
Carragenani
--
E 410
Farina di semi di carrube
--
E 412
Farina di semi di guar
--
E 413
Gomma adragante
--
E 414
Gomma arabica
--
E 415
Gomma xantano
--
E 420
Sorbitolo
--
E 420
Sciroppo di sorbitolo
--
E 421
Mannitolo
--
E 422
Glicerolo
--
E 440
a) pectina
--
E 440
b) pectina amidata
--
E 450
a-i) pirofosfato disodico
Sono conosciuti più comunemente
col
nome
generico
di
polifosfati.Alcuni Autori hanno
osservato
fenomeni
di
ipocalcemia e lesioni renali, dovuti
ad
assunzioni
continue
e
massicce , mentre altri hanno
costatato accumulo di fosfati di
calcio nelle reni.
E 450
a-ii) pirofosfato trisodico
come sopra
E 450
a-iii) pirofosfato tetrasodico
c.s.
E 450
a-iv) pirofosfato tetrapotassico
c.s.
E 450
b-i) trifosfato pentasodico
c.s.
E 450
b-ii) trifosfato pentapotassico
c.s.
E 450
c-i) polifosfati di sodio
c.s.
E 450
c-ii) polifosfati di potassio
c.s.
E 460
i) cellulosa microcristallina
--
E 460
ii) cellulosa in polvere
--
E 461
metilcellulosa
--
E 463
Idrossipropilcellulosa
--
E 464
Idrossipropilmetilcellulosa
--
E 465
Metiletilcellulosa
--
E 466
Carbossimetilcellulosa
--
--
Gelatine animali
EMULSIONANTI
E 322
lecitina
--
E 470
sali di sodio, di potassio o
di calcio degli acidi grassi
--
E 471
mono e digliceridi degli
acidi grassi
--
E 472
a) esteri acetici del mono e
digliceridi degli ac. grassi
--
E 472
b) esteri lattici del mono e
digliceridi degli ac. grassi
--
E 472
c) esteri citrici dei mono e
digliceridi degli ac. grassi
--
E 472
d) esteri tartarici del mono
e digliceridi degli ac. grassi
--
E 472
e)
esteri
mono
e
diacetiltartarici dei mono e
digl.. degli ac. grassi.
--
E 473
f) esteri misti acetico
tartarici del mono e digl..
degli ac. grassi
--
E 473
sucresteri
--
E 474
sucrogliceridi
--
E 475
esteri poligliceridi
acidi grassi
degli
--
E 477
esteri del propilenglicol con
gli acidi grassi
--
E 481
stearoil 2 lattilato di sodio
--
E 482
stearoil 2 lattilato di calcio
--
E 483
tartatro di stearoile
--
ESALTATORI DI SAPIDITÀ
E 621
glutammato monosodico
Sostanza eccitante del
sistema nervoso.Se usata
in quantità eccessiva, può
provocare sintomi definiti
come
"sindrome
del
ristorante
cinese"(questo
tipo di cucina ne fà
abbondante
uso),
che
consistono in irritabilità,
cefalea, insonnia.
E 260
acido acetico
--
E 270
acido lattico
--
E 300
acido L ascorbico
--
E 330
acido citrico
--
E 334
acido tartarico
--
SOSTANZE AROMATIZZANTI ARTIFICIALI
aldeide paratoluica
allilcicloesanpropionato
allile capronato
dimetilresorcina
etilacetilacetato
etilbetanaftolo
etilvanillina
metilamilchetone
metilciclopentenolone
metile eptilcarbonato
metilionone
naftilmetilchetone
ossicitronellale
propenilguaetolo
undecalattone
•
Conservanti nocivi
Acido benzoico e suoi sali (E210, E211, E212, E213): sono usati da soli o insieme
all'acido sorbico e ai PHB. Non sono ammessi in alcuni paesi per la loro potenziale
tossicità, inoltre gli alimenti ai quali vengono aggiunti sono soprattutto le confetture, le
gelatine, le marmellate, le gomme da masticare e le bevande analcoliche, tutti prodotti che
non necessitano di conservanti.,
Anche gli esteri dell'acido p-Idrossibenzoico (E214, E215, E216, E217, E218, E219),
indicati con la siglia PHB, sono vietati in alcuni paesi. Vengono addizionati ai patè, ai
rivestimenti di gelatina dei prodotti a base di carne, alla frutta in guscio ricoperta.
I derivati dell'anidride solforosa (E220, E221, E222, E223, E224, E226, E227, E228)
sono irritanti e hanno una tossicità acuta e cronica, per esempio interagiscono con gli
enzimi cellulari e distruggono alcune vitamine (per esempio la tiamina). Vengono usati nel
vino, nella birra (anche per questo bisogna moderarne il consumo, non solo per l'alcol) e in
altre bevande come i succhi di frutta, nella senape e in altri condimenti.
I derivati fenolici e il tiabendazolo (E230, E231, E232 , E233) sono dotati di una certa
tossicità, infatti sono proibiti in Australia. Vengono utilizzati per il trattamento superficiale
degli agrumi e delle banane (per questo bisognerebbe usare solo la scorza delle arance
non trattate).
La netamicina (E235), un antibiotico utilizzato sulla superficie dei formaggi, (soprattutto
dei provoloni) provoca problemi intestinali.
•
I nitriti (E249 ed E250) e i nitrati (E251 ed E252) sono utilizzati nei salumi e nelle carni
conservate.
Conservanti innocui
Sono i sorbati (E 200, E202, E203), l'acido acetico e i suoi sali di potassio E260, E261,
E262, E263, l'acido lattico e i suoi sali di sodio (E270, E325, E326, E327), l'acido
propionico e i suoi sali (E280, E281, E282, E283), l'anidride carbonica (E 290).
Gli additivi 'naturali'
•Aceto
L'aceto è frutto della fermentazione del vino. Noto fin dal tempo dei Romani, veniva usato anche come dissetante.
L'aceto è impiegato come conservante per le verdure (sottaceti) e nella fase di preparazione delle verdure (scottatura o
bollitura) per la successiva conservazione sotto'olio.
•Alcool
L'alcool ha la proprietà di creare un ambiente poco favorevole allo sviluppo di microrganismi già da concentrazioni
superiori al 15%. Puro o come liquore, es. grappa, viene impiegato per la conservazione di frutta come albicocche,
amarene, ciliege, prugne, uva.
•Limone
Il succo del limone è un buon antiossidante. Viene usato per evitare che verdure e frutta diventino nere dopo il taglio
(es. carciofi, melanzane, macedonia di frutta ecc.)
•Olio
Ottenuto dalla spremitura delle olive (o per estrazione dalle arachidi, girasole, mais, soia ecc.) permette la
conservazione degli alimenti isolandoli dall'aria e quindi dai germi.
Acciughe, funghi, ortaggi, sgombro e tonno sono i principali alimenti conservati sott'olio.
•Sale
Uno dei metodi più antichi di conservazione degli alimenti. Usando il sale è possibile conservare gli alimenti in due
modi:
Salatura: consiste nello stipare il prodotto alternando strati di sale all'alimento. La conservazione, in un periodo
iniziale, deve avvenire pressando il prodotto.
La salatura è usata soprattutto per acciughe e baccalà, ma anche per i capperi, la bresaola ed altri insaccati.
Salamoia: consiste nel conservare il prodotto in una soluzione di acqua e sale (circa 10%).
La salamoia è usata soprattutto per olive ed ortaggi.
•Zucchero
Lo zucchero in elevate concentrazioni impedisce la fermentazione. Con il 60-70% di zucchero le marmellate si riescono
a conservare per lunghi periodi senza difficoltà.
Soluzioni zuccherine con concentrazioni più basse, circa 20-25%, consentono, previa sterilizzazione, la conservazione
della frutta.
Vari sono i tipi di zucchero:
fruttosio - nella frutta e nel miele,
glucosio - nella frutta e nel miele,
lattosio - nel latte,
maltosio - dai cereali,
saccarosio - deriva dalla canna da zucchero o dalla barbabietola da zucchero, è il più usato nelle nostre case.
ALTRE TECNICHE DI CONSERVAZIONE
•
AFFUMICATURA (La conservazione deriva in parte dal calore e in misura minore dalla
penetrazione di sostanze gassose come aldeide formica, fenoli, ecc)
SALAGIONE
ZUCCHERAGGIO
ATMOSFERA MODIFICATA (Sottovuoto o aggiunta di anidride carbonica). Per alcuni ortaggi
la miscela gassosa contiene l’1% di ossigeno e percentuali di anidride carbonica variabili dallo
0,5 al 5%. La conservazione dei formaggi freschi può essere garantita da un’atmosfera
modificata contenente 61% di CO2, 26% di N2 e 7% di O2
•
•
•
IL MICROSCOPIO
•
•
La costruzione del primo microscopio si deve ad un mercante olandese di tessuti Antonj Van
Leeuwenhoek (1632-1723). Per primo vide e descrisse gli animalcula (protozoi, batteri, alghe e
lieviti)
Indice di rifrazione dell’olio di legno di cedro: 1,515(molto vicino a quello del vetro 1,555). L’olio
di cedro(Juniperus virginiana) aumenta il potere risolutivo dell’obiettivo fornendo una immagine
più chiara ed un ingrandimento maggiore.
Microscopio ottico
1.
2.
3.
4.
5.
6.
.
Microscopio semplice
Microscopia in campo oscuro
Microscopia in contrasto di fase
Microscopia in contrasto interferenziale
Microscopia a fluorescenza
Stereomicroscopia
Microscopio elettronico
1.
2.
M.E. a trasmissione
M.E. a scansione
Microscopio a fluorescenza
Questo tipo di microscopio serve per apprezzare la disposizione delle molecole. La sorgente luminosa, che trasmette radiazioni
ultraviolette, eccita il preparato dall'alto, infatti si parla di epifluorescenza. Le componenti del preparato emettono luce di
lunghezza d'onda maggiore di quella emessa dalla sorgente luminosa, questo fenomeno è conosciuto come fluorescenza. Gli
obiettivi usati per questo tipo di osservazione sono quelli a fluorite.
Microscopio a contrasto di fase
La maggior parte di componenti cellulari è trasparente alla luce visibile, anche a causa dell'elevata presenza di acqua, tuttavia
vediamo che le radiazioni luminose una volta oltrepassata una componente o un organello cellulare, subiscono dei cambiamenti di
fase che dipendono sia dallo spessore, sia dal diverso indice di rifrazione della struttura oltrepassata. Mediante il microscopio a
contrasto di fase è possibile andare a determinare tali cambiamenti e convertirli in differenze di densità così da ottenere dei dati,
cioè delle informazioni utili circa la composizione di cellule e tessuti analizzati. Questa tecnica di microscopia è molto utilizzata per
andare ad osservare le cellule mantenute in vita in apposite colture in vitro; infatti tramite la microscopia a contrasto di fase si
evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di
quella che è l'organizzazione cellulare.
Microscopio ad interferenza
Si attua con due onde: una attraversa il preparato che, se non è omogeneo, deforma l'onda, che si incontra con la seconda onda
non deformata, dando luogo a fenomeni di interferenza. Queste forniscono notizie utili sulle sostanze presenti nel provino.
Analogamente al contrasto di fase è utilizzato per osservare strutture trasparenti non altrimenti visibili in campo chiaro ma fornisce
immagini più contrastate e con un effetto "tridimensionale". Questo metodo di contrasto è conosciuto con il nome di "DIC"
(differential interference contrast)oppure "Normaski", dal nome dell'inventore della configurazione ottica che si ritrova negli odierni
microscopi a contrasto interferenziale.
Ultramicroscopio
(M. a campo oscuro) è un microscopio ottico con un condensatore paraboloide, con pareti a specchio, o comunque munito di uno
schermo che ferma i raggi che illuminerebbero direttamante il preparato. Vengono raccolti dall'obiettivo solo i raggi che vengono
opportunamente deviati, "diffratti". La diffrazione (deviazione dei fotoni a onde decrescenti rispetto alla traiettoria principale) viene
operata da particelle del preparato che abbiano dimensioni comprese fra 0,1 micrometro e 1 nanometro, particelle che
appariranno come punti luminosi su sfondo buio, senza dettagli morfologici: effetto Tyndall.
Microscopio stereoscopico
Mentre il microscopio composto osserva il campione attraverso un'unica direzione, quello stereoscopico lo osserva da due angoli
leggermente diversi e ne ottiene le due immagini necessarie per la visione stereoscopica. In questo modo, lo stereomicroscopio
fornisce una visione tridimensionale degli oggetti, mentre attraverso quello composto gli oggetti appaiono piatti, senza volume. Il
microscopio composto osserva gli oggetti per trasparenza e produce 50-1200 ingrandimenti. Il microscopio stereoscopico, invece,
osserva gli oggetti principalmente per mezzo della luce riflessa e il suo ingrandimento, tipicamente compreso fra 8-50 volte, è
molto inferiore a quello del microscopio composto. Con il microscopio stereoscopico, non è dunque possibile osservare microbi,
ma esiste ugualmente una grande varietà di oggetti naturali che si possono osservare con questo tipo di strumenti
Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
Il microscopio elettronico a trasmissione fa attraversare un campione molto sottile (da 5 a 500nm) da un fascio di
elettroni, quindi con un insieme di magneti (che funzionano come le lenti del microscopio ottico) ingrandisce l'immagine
ottenuta che viene infine proiettata su uno schermo fluorescente rendendola visibile. Dà immagini della struttura interna
dell'oggetto esaminato, al contrario del SEM che ne dà solo la superficie, ma permette si ottenere solo immagini 2D.
Raggiunge i nanometri, permettendo di vedere anche le molecole più piccole.
Ulteriori miglioramenti hanno prodotto il HRTEM (high resolution trasmition electron microscope), con cui è stato
possibile distinguere i singoli atomi di litio in un composto.
Microscopio elettronico a scansione (SEM)
Il microscopio elettronico a scansione, al contrario di quello a trasmissione, ricava l'immagine illuminando con un
fascio di elettroni un oggetto anche relativamente grande (un insetto per esempio) e rilevando gli elettroni secondari
riflessi, e può quindi fornire immagini 3D. Può analizzare solo oggetti conduttori o semi-conduttori. Gli oggetti organici
devono quindi essere prima rivestiti con una sottile lamina metallica. Questo strumento ha la necessità di operare in
condizioni di vuoto elevato: per questo è stato sviluppato il microscopio elettronico ambientale a scansione che, libero
da questo vincolo, è in grado di analizzare campioni di materiale organico conservandone le condizioni di temperatura,
pressione ed umidità.
Microscopio a scansione per effetto tunnel (STM)
Questo particolare tipo di microscopio consente di analizzare la superficie di un campione conduttore o semiconduttore
drogato utilizzando, come sensore, una punta cresciuta su di un cristallo singolo di tungsteno e rastremata alla
sommità fino allo spessore di un singolo atomo: a questa punta, posta ad una distanza molto ravvicinata dal campione,
viene applicata una piccola tensione (circa 0.02 V) rispetto al campione. Data la particolare conformazione del sensore,
si ha la certezza che gli elettroni fluiranno tutti dalla punta verso il campione per effetto tunnel. Poiché la corrente varia
con la distanza della punta del sensore dalla superficie del campione, è possibile tramite un processo di retroazione
mantenere costante tale distanza, muovendo la punta sull'asse ortogonale alla superficie del campione con la
precisione garantita da un attuatore piezoelettrico. Effettuando quindi una scansione su tutta la superficie del campione
e registrando punto per punto i valori della corrente, è possibile ricostruirne un modello tridimensionale. Mediante tale
tecnica, si riesce a raggiungere precisioni molto elevate, fino a 4 Å.
Microscopio a forza atomica (AFM)
Il microscopio a forza atomica permette di effettuare analisi non distruttive di superfici, con una risoluzione inferiore al
nanometro (un miliardesimo di metro). Una sonda di dimensioni dell'ordine del micrometro (un milionesimo di metro)
esplora la superficie da analizzare, a contatto o a brevissima distanza da essa (circa 10 angstrom). Interagendo con gli
atomi del campione, per effetto delle forze di Van der Waals, subisce microscopiche deflessioni che, attraverso un
sensibilissimo dispositivo (leva ottica), vengono tradotte nei dettagli di un'immagine topografica della superficie del
campione. Rispetto allo Scanning Electron Microscope (SEM) e allo Scanning Tunnelling Microscope (STM), il
microscopio a forza atomica ha il vantaggio di consentire analisi non distruttive e di adattarsi anche a campioni di
materiale non conduttore. Tipicamente viene impiegato per esaminare wafer semiconduttori, compact disc e altri
supporti magnetici
I BATTERI
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•
Con Pasteur (1822-1895) si chiude la controversia sulla generazione spontanea,
radicata fin dall’antichità con Aristotele e confutata in un primo tempo nel 1665 da
Francesco Redi e in seguito da Lazzaro Spallanzani (1729-1799)
Le dimensioni dei batteri sono dell’ordine di 0,5-2 micron e l’aspetto morfologico può
essere: bastoncellare (bacilli), sferico (cocchi), corto e tozzo (cocco-bacillo),
filamentoso (vibrioni e spirilli)
I cocchi possono assumere diverse posizioni: diplococchi (a coppia), streptococchi (a
catenella), stafilococchi (a grappoli), sarcine(a tetradi o cubi)
I batteri vengono classificati con un tipo di classificazione artificiale o fenetica che
considera le caratteristiche attuali sia fenotipiche che genotipiche dei batteri espresse
in base al livello di somiglianza e di differenza.
Un criterio utilizzato in tal senso è la tassonomia numerica o adansoniana per la
quale l’affinità tra le diverse specie viene valutata matematicamente in base ai
rispettivi coefficienti di similitudine, considerando di un congruo numero di
microrganismi 100-300 caratteri, codificati ed analizzati al computer
Un altro criterio è quello di determinare la percentuale di G + C del DNA che fornisce
il livello di parentela cellulare. La % di G+C si può calcolare conoscendo la
temperatura di fusione in cui si ha la separazione dei due filamenti di DNA,
caratteristica per ogni specie di acido nucleico.
Altre tecniche di indagine si basano sulla struttura antigenica, la composizione
biochimica, l’omologia del DNA e le correlazioni filogenetiche
L’identificazione batterica non può prescindere dagli aspetti epidemiologici inerenti la
conoscenza della sua distribuzione, dalla frequenza della malattia in seno alla
popolazione e dalle condizioni ambientali, demografiche e sociali che possono
favorire od ostacolare il suo sviluppo nel territorio.
PARETE CELLULARE
•
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•
•
Capsula polisaccaridica (glicocalice) con funzione di protezione
dall’ambiente esterno a bassa presssione osmotica
Peptidoglicano (detto mureina) costituito da una parte peptidica (costituita
da 4 aminoacidi) e da una glicidica caratterizzata da due carboidrati azotati:
N-acetilglucosamina e l’acido N-acetilmuramico uniti da legame beta
glicosidico
Nei Gram positivi si trova una maggiore quantità di peptidoglicano rispetto
ai Gram negativi. Nello strato di peptidoglicano vi sono inoltre lipidi,
proteine, polisaccaridi
Nei Gram negativi lo strato di peptidoglicano è ricoperto da una membrana
parietale esterna formata da fosfolipidi, lipoproteine, lipopolisaccaridi,
proteine
Il lipopolisaccaride della membrana parietale, impermeabile per alcuni
antibiotici e resistente all’azione detergente degli acidi biliari, degli acidi
grassi e degli enzimi intestinali, favorisce l’adattamento intestinale di alcuni
enterobatteri.
GENETICA BATTERICA
Trasformazione, coniugazione, trasduzione
Fotoautotrofi
Fonte di energia: Luce
Fonte di Carbonio: CO2 atmosferica
Fonte elettroni: H2O, H2S
Ossigenici, anossigenici (S2, SO4--)
Tipo clorofilla: clorofilla a, batterioclorofilla
Esempi: Cianobatteri, batteri verdi e purpurei
Fotoeterotrofi
Fonte di energia: Luce
Fonte di Carbonio: Composti organici
Fonte elettroni: H2S, S, ecc.
Pigmento fotosintetico: batteriorodopsina
Esempi: Solforodobatteri,batteri verdi e purpurei non sulfurei (batteri alofili)
Chemioautotrofi
Fonte di energia: Ossidazione di sostanze inorganiche
Fonte di Carbonio: CO2 atmosferica
Esempi: Batteri Nitrificanti nitratatori: Ca(NO2)2+O2 >Ca(NO3)2 (=nitriti >nitrati), idrogenobatteri (l’idrogeno gassoso viene
utilizzato come fonte per la riduzione della CO2 per ottenere CH2O), Solfobatteri: 2H2S+O2 >2H2O + S2 (Thiobacillus nei fondi
d’acqua stagnante) (= acido solfidrico >acqua e zolfo inorganico)Nitrificanti nitrosatori: (NH4)2CO3+3O2 >2HNO2+CO2+3H2O (=
sali d’ammonio >acido nitroso ovvero nitriti di Ca o Mg), Ferrobatteri: ossidano ioni ferrosi in ioni ferrici (pellicole superficiali
argentate o iridate) 2FeCO3 + 3H2O + ½ O2 >2Fe (OH)3 + 2CO2 (Fe bivalente >Fe trivalente; lo stesso tipo di reazione può
avvenire col Mn), Solfato-riduttori (da ione solfato ad H2S e da acetato ed altri composti a CO2), Denitrificatori (trasformazione
delle sostanze azotate nel terreno.Da anione nitrico ad ammoniaca o N2 )
Chemioeterotrofi
Fonte di energia: Ossidazione di sostanze organiche
Fonte di Carbonio: Composti organici
Esempi: Quasi tutti i batteri patogeni
I Procarioti Chemioeterotrofi possono essere:
Saprofiti
Si nutrono di organismi in decomposizione o di sostanza organica nel suolo
Parassiti
Si nutrono a carico di Eucarioti (Protisti, Animali, Funghi o Piante)
Simbionti
Instaurano una simbiosi con Eucarioti (per lo più Piante o Protisti)
Azotofissatori (Cianobatteri – es. licheni, Attinomiceti – es. Ontano, Rhizobium – es. leguminose)
CARATTERISTICHE METABOLICHE E NUTRIZIONALI
Tipo
Fonte di energia
Fonte di carbonio
Microrganismi
Fotoautotrofi
Luce
CO2
Alghe verdi-blu, batteri fotosintetici
Fotoeterotrofi
Luce
Composti organici
Batteri rossi, fotosintetici
Chemioautotrofi
Composti organici
CO2
Solfo-, Ferro-, Ammonio-batteri, Batteri metanoproduttori
Chemioeterotrofi
Composti organici
Composti organici
Protozoi, funghi, la maggior parte dei batteri (tutti quelli
patogeni)
physiological group
energy source
oxidized end product
hydrogen bacteria
H2
H2O
Alcaligenes, Pseudomonas
methanogens
H2
H2O
Methanobacterium
carboxydobacteria
CO
CO2
Rhodospirillum, Azotobacter
nitrifying bacteria*
NH3
NO2
Nitrosomonas
nitrifying bacteria*
NO2
NO3
Nitrobacter
sulfur oxidizers
H2S or S
SO4
Thiobacillus, Sulfolobus
iron bacteria
Fe ++
Fe+++
Gallionella, Thiobacillus
Elettroni accettori
O2
organism
Prodotto ridotto finale
Tipo di processo
H2O
respirazione aerobica
Escherichia, Streptomyces
Microrganismo
NO3
NO2, NH3 or N2
denitrificazione
Bacillus, Pseudomonas
SO4
S or H2S
riduzione solfati
Desulfovibrio
fumarato
succinato
respirazione anaerobica
Escherichia
CO2
CH4
metanogenesi
Methanococcus
•
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
BATTERI GRAM – POSITIVI
Bacillus anthracis
B. thurigiensis
Clostridium denitrificans
C. botulinum
C. tetani
C. perfrigens (avvelenamento di cibi e gangrena
gassosa)
Lactobacillus
Listeria
Staphylococcus aurei (infezioni dell’apparato
respiratorio)
Streptococcus mutans (cavo orale, carie)
Streptococcus pneumoniae
Mycobacterium tubercolosis
Streptomices
Micoplasmi
•
BATTERI GRAM – NEGATIVI
1.
Beggiatoa (batteri striscianti)
2.
Treponema pallidum
3.
Campylobacter fetus (infiammazioni intestinali)
4.
Rhizobium
5.
Nitrobacter
6.
Thiobacterium
7.
Escherichia coli
8.
Yersinia pestis
9.
Shigella dysenteriae
10. Vibrio cholerae
11. Salmonella typhimurium
12. Agrobacterium tumefaciens
13. Neisseria gonorrhoeae
14. N. meningitidis
15. Rickettsie
16. Clamidie
17. Cianobatteri
COLORAZIONI BATTERICHE
Fasi principali delle colorazioni:
• Distensione
• Essiccamento
• Fissazione (anche con liquidi fissatori quali la miscela alcool – etere per 10
ninuti, alcool etilico assoluto per 20 minuti, alcool metilico per 2-3 minuti)
• Colorazione semplice o monocromatica
• Colorazione differenziale (con due coloranti)
• Si usano coloranti basici di anilina per la grande affinità nei confronti degli
acidi nucleici (blu di metilene, fucsina basica, violetto di genziana,
cristalvioletto, tionina, safranina)
• Si usano coloranti acidi per l’affinità che hanno per il citoplasma (eosina,
fucsina acida, nigrosina)
• Per favorire la penetrazione dei coloranti si usano dei mordenzanti quali il
fenolo e la soluzione iodo-iodurata
• Le soluzioni madri si preparano sciogliendo 10 grammi di colorante in
polvere in 100 g di alcool etilico al 95% o assoluto
• Le soluzioni idroalcoliche per la colorazione si preparano aggiungendo a 10
ml di soluzione madre 90 ml di acqua distillata. Per le soluzioni mordenzate
si procede sciogliendo prima l’acido fenico nell’acqua distillata e
aggiungendo poi 10 ml della soluzione madre. La quantità di acido fenico
varia da 1 g a 5 g a seconda del tipo di colorazione.
•
REGOLA DELLE MISCELE
•
COLORAZIONE DI GRAM
Si basa sulla facoltà di alcuni coloranti, quali il violetto di genziana, il cristalvioletto, ecc.
di reagire con lo iodio di una soluzione iodo-iodurata, per dare composti resistenti
alla colorazione con alcool. Mentre i batteri Gram positivi non si scolorano con
alcool e appaiono colorati in viola-blu al microscopio, i Gram negativi acquisiscono
una colorazione rosa-rosso del secondo colorante (fucsina, safranina, ecc.). Ciò è
dovuto al fatto che i Gram negativi hanno un contenuto in lipidi più alto, lipidi che
vengono rimossi con il lavaggio con alcool con conseguente aumento della
permeabilità della parete.
TECNICA:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Stemperare una goccia di brodocoltura, o una colonia cresciuta in piastra,in una goccia di
acqua sterile depositata su un vetrino portaoggetti
Distendere per strisciamento con l’ansa
Lasciare asciugare e fissare
Colorare per 1 minuto il preparato con violetto di genziana fenicato di Nicolle al 2% (o di
cristalvioletto)
Allontanare l’eccessso di colore e, senza lavare, coprire con liquido di Lugol facendo agire per
1 minuto
Lavare con acqua e versare gocce di alcool sul vetrino finchè il preparato non cede più
colorante
Colorare per 10 secondi con soluzione di safranina allo 0,25%, o con fucsina diluita 1:10 per
30 secondi
Lavare e asciugare
•
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Viene effettuata per la ricerca del bacillo tubercolare e di altri micobatteri.
I microrganismi acido resistenti si colorano con difficoltà per la presenza
di un involucro ricco di cere e di grassi che riveste la cellula batterica. A
differenza degli altri batteri gli acido-resistenti una volta colorati
“resistono” alla decolorazione di una soluzione alcool-acido.
TECNICA
1.
Far agire sullo striscio fissato alla fiamma la fucsina basica fenicata a
caldo (sciogliere 3 g di fucsina basica in 10 ml di etanolo al 95% ed
aggiungere 90 ml di una soluzione acquosa di fenolo al 5%), in modo da
far svolgere i vapori senza far bollire
2.
Lavare con acqua e decolorare per 2 minuti con soluzione di acido
solforico al 20% o ac. Cloridrico al 3% o ac. Nitrico al 33% fino a che il
preparato non diventa giallo
3.
Lavare e far agire ripetutamente con etanolo al 95% per 5 minuti finchè il
preparato non cede più colore
4.
Lavare con acqua e colorare per 1 minuto con soluzione idroalcolica di
blu di metilene: 0,5 g di blu di metilene, + 100 ml di acqua distillata
5.
Lavare con acqua e asciugare
•
COLORAZIONE DELLA CAPSULA
La capsula è una formazione non essenziale, composta in genere di polimeri di
carboidrati, la quale conferisce ai batteri proprietà peculiari quali la virulenza,
l’attività antifagocitaria, la protezione fisico-chimica dall’ambiente esterno, la
resistenza all’essiccamento, ecc.
La capsula dei batteri non ha per i coloranti la stessa affinità degli altri componenti
cellulari e quindi rende necessario l’uso di particolari procedimenti di colorazione.
L’inchiostro di china e la nigrosina mettono in evidenza la capsula per mezzo di una
colorazione ‘negativa’.
Colorazione con eosina:
1.
fissare lo striscio alla fiamma
2.
Colorare per 2-3 minuti con violetto di genziana fenicato
3.
Decolorare per qualche secondo con una soluzione alcool-acetone
4.
Lavare e colorare per pochi secondi con una soluzione alcolica di eosina allo 0,5%
I batteri appaiono colorati in violetto, le capsule in rosa-rosso
Colorazione con nigrosina:
1.
Stemperare su un vetrino portaoggetti una goccia di campione in una goccia di
nigrosina
2.
Stendere uniformemente con un altro vetrino, fino a formare una sottile pellicola
3.
Asciugare all’aria e osservare con l’obiettivo ad immersione
Le cellule appaiono incolori su sfondo scuro
COLORAZIONE DELLE SPORE
Gli involucri di rivestimento rendono le spore pressochè impermeabili ai comuni coloranti;
una volta colorate si decolorano con difficoltà. Sono sporigeni i batteri del genere
Bacillus e Clostridium
Colorazione di Schaeffer-Fulton
1.
2.
3.
4.
Ricoprire lo striscio con soluzione verde malachite e mantenerlo sopra la fiamma
per 30 secondi fino allo sviluppo dei primi vapori
Lavare con acqua
Colorare con safranina per 30 secondi
Lavare, asciugare ed esaminare
Colorazione di Moller
1.
Immergere lo striscio in una soluzione acquosa di acido cromico al 5% per 2
minuti
2.
Lavare in acqua corrente
3.
Colorare per un minuto con fucsina fenicata
4.
Passare velocemente in acido solforico al 5% fino a scomparsa del colore rosso
5.
Lavare con acqua corrente
6.
Colorare con soluzione acquosa di blu di metilene
7.
Lavare con acqua e asciugare
8.
Montaggio in balsamo
Le spore appaiono colorate in rosso su sfondo azzuro
TERRENI DI COLTURA
La semina in un terreno di coltura persegue due obiettivi
1.
Determinare la carica microbica in una unità di campione (1 g o un ml)
2.
Identificare la presenza/assenza di microrganismi patogeni
3.
Coltivare microrganismi per produzione industriale
4.
Verificare l’efficienza di prodotti farmaceutici
5.
Verificare la sensibilità ad agenti antimicrobici mediante l’antibiogramma
6.
Controllare la sterilità di materiali e attrezzature
All’isolamento dei microrganismi in terreni selettivi e differenziali, segue
l’identificazione mediante:
1.
Colorazioni, per individuare l’aspetto morfologico
2.
Microscopio ottico
3.
Prove di identificazione biochimica
4.
Tipizzazione sierologica
•
I terreni possono essere liquidi, semisolidi (0,3-0,5% di agar), solidi con
aggiunta di agar (1-2%) o con la coagulazione al calore (se a base di
siero e di uova)
•
L’agar è un composto mucopolisaccaridico (galattosio + ac.
galatturonico) estratto da alghe marine. Solidifica a 38 °C e fonde a 84 °C
Un terreno può contenere:
•
Sostanze nutrienti (proteine, peptidi, aminoacidi, infuso di carne, triptoni, caseina) ed energetiche (zuccheri)
•
Metalli e minerali essenziali (sodio, potassio, calcio, ferro, magnesio, cloro, fosforo,zolfo)
•
Sostanze tamponanti a valori specifici di pH (fosfati mono e di-sodico e di K, acetati…)
•
Indicatori per evidenziare la fermentazione dei carboidrati o dei composti azotati, i quali cambiano colore ad un
determinato pH (rosso fenolo, porpora di bromo-cresolo, fucsina, rosso neutro)
•
Indicatori di ossido-riduzione quali il blu di metilene e la resazurina, che virano in presenza di ossigeno
•
Fattori di crescita quali sangue, siero, estratti di lievito
•
Agenti selettivi antimicrobici (antibiotici quali neomicina, cloramfenicolo, vancomicina) e prodotti chimici quali
Sali biliari, i coloranti di anilina (eosina, verde brillante…), il selenio, il tetrationato, il tellurito, l’azide sodica ,
per inibire la crescita dei microrganismi indesiderati a vantaggio di quelli che si vogliono isolare
•
Gelificanti quali l’agar
•
La bile, gli acidi e i Sali biliari, non inibiscono gli enterobatteri patogeni (Salmonelle e
Shigelle) e, in genere, i Gram negativi, mentre hanno attività batteriostatica o battericida
su alcuni enterobatteri saprofiti e sui Gram positivi
•
Il cloruro di sodio a concentrazioni 10 volte superiori non inibisce lo sviluppo degli stafilococchi e di
altri batteri alofili
•
Certi coloranti ottenuti dal trifenilmetano quali il cristalvioletto, la fucsina basica, il verde brillante, il
verde malachite, inibiscono i Gram positivi (in particolare gli streptococchi fecali) a concentrazioni
minori rispetto a quelle necessarie per i Gram negativi
•
L’azide sodica allo 0,2 g/l permette lo sviluppo degli enterococchi (streptococchi fecali) mentre inibisce
quello dei microrganismi Gram negativi associati
PREPARAZIONE DI UN TERRENO
•
Molte ditte hanno in catalogo terreni in polvere disidratati, da ricostituire secondo le
istruzioni, o terreni pronti all’uso in capsule Petri, in provetta, in flaconi.
• Pratici e facili da usare sono i cartoni nutrienti impregnati con mezzi di coltura liquidi
• essiccati e sterilizzati. Sono pronti all’uso previa reidratazione con pochi ml di acqua
distillata
• Pesati i prodotti, seguendo le indicazioni riportate sulla confezione, le polveri vanno
sciolte in beuta o altro recipiente di volume adeguato mediante ebollizione, avendo
cura di agitare continuamente per evitare che il terreno posto sul fondo si bruci.
• Raffreddare a circa 50 °C, mescolare e distribuire nei contenitori finali: tubi, provette
inclinate a becco di clarino (slant), capsule petri, beute.
• Verificare sulla confezione se il terreno va autoclavato e a quale temperatura. Quando
il contenitore è provvisto di tappi a vite questi vanno allentati per favorire la fuoriuscita
dell’aria durante il riscaldamento in autoclave. Finita la sterilizzazione, prima di estrare
i contenitori, attendere che la temperatura sia scesa sotto gli 80 °C. Controllare il pH
finale ed aggiungere, se necessario, HCl o NaOH
• Per accertare l’avvenuta sterilizzazione vi sono indicatori biologici sotto forma di
strisce contenenti spore di Bacillus stearothermophilus e B. subtilis. Le strisce in
substrato liquido, dopo la sterilizzazione, vanno incubate per 48 ore a 55 °C. Se la
sterilizzazione è avvenuta non si verificano cambiamenti di torbidità
Conservazione dei terreni
• I terreni andrebbero utilizzati freschi, entro 2-3 ore.I terreni liquidi o agarizzati
contenuti in bottiglie con tappo a vite, si conservano fino a 6 mesi al riparo della luce a
12-16 °C
• Al bisogno, i terreni solidi vengono ridisciolti in bagnomaria bollente o in un forno a
microonde per pochi minuti
IDENTIFICAZIONE DEI BATTERI
• RACCOLTA DEL CAMPIONE
Il campione non deve subire modifiche durante il trasporto e la conservazione,
e dovrebbe ospitare al momento dell’analisiuna flora microbica
qualitativamente e quantitativamente uguale a quella presente durante il
prelievo
Per il trasporto si utilizzano bauletti termostatati, con piastre termiche
congelanti in grado di mantenere una temperatura di 2-4 °C
In genere si prelevano non meno di 5 unità campionarie
• PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
L’unità di volume (ml) o di peso (g) del campione viene seminata per inclusione in un
terreno idoneo. Le cellule si dividono ogni 20 minuti. Dopo 18-24 ore si formano colonie
visibili ad occhio nudo costituite da un minimo di 106 cellule
Il conteggio viene esspresso in U.F.C. (unità formanti colonie) per ml o grammo.
L’aspetto delle colonie può essere liscio S (smooth) di consistenza cremosa, rugosa a
margini frastagliati o mucoso, tipico dei batteri capsulati
• OMOGENEIZZAZIONE
Se il campione si trova allo stato solido (es. buro, formaggio, ecc.) si portano 30 grammi
dello stesso in una quantità nove volte di diluente in modo da ottenere una diluizione di
1:10. Campione e diluente vengono omogeneizzati in un miscelatore-omogeneizzatore
• DILUIZIONE
Requisito indispensabile del diluente è l’isotonicità con le cellule microbiche.
Dall’omogenato diluito si pipetta 1 ml(pari a 0,1 ml o gr di campione) che
viene inoculato in 10 ml di terreno liquido (brodo) posto in provetta oppure
in piastra Petri. Per ogni diluizione si seminano due piastre.Se il numero di
UFC supera le 300 unità è necessario effettuare ulteriori diluizioni sempre
1:10.
Il conteggio delle UFC deve essere riferito a ml o a gr.Tenendo conto che 1 ml
della prima diluizione corrisponde a 0,1 gr o ml se la diluizione utilizzata
fosse ad es. 1000 ed il numero di UFC pari a 200 allora il numero di UFC /
ml (o gr) sarà 200 X 1000 = 200.000
Es. diluente:
Cloruro di sodio 2,5 g/l
Cloruro di potassio 0,105 g/l
Cloruro di calcio 6H2O 0,12 g/l
Bicarbonato di sodio 0,05 g/l
Acqua 1000 ml
•
SEMINA
La coltivazione dei microrganismi in substrati artificiali ha lo scopo di quantificare il
numero di germi nell’unità di peso (gr) o di volume (ml), oppure di verificare
l’assenza in quantità definite di campione dei microrganismi patogeni. Nel primo
caso deve essere seminato un volume notodel materiale in esame. L’entità del
campione dipende dal microrganismo cercato e dall’alimento
Semina in provetta
1.
Per infissione centrale con l’ago
2.
In superficie e in profondità mantenendo inclinata la provetta di circa 30°
Semina in piastra per inclusione
1.
Deporre 1 ml di campione opportunamente diluito
2.
Versare ca. 15 ml di terreno liquido a ca. 46 °C
3.
Lasciare raffreddare le piastre con il coperchio semiaperto per 10 minuti, vicino
alla fiamma di un bunsen per ridurre la formazione di condensa
4.
Incubare le piastre capovolte in termostato a temperatura, in genere, di 37 °C per
24 ore
Semina in piastra per strisciamento
Lo scopo è quello di distribuire l’inoculo in modo da assicurare lo sviluppo di
colonie isolate. La tecnica consiste nell’inoculare un’ansata di campione sulla
superficie di un terreno solidificato, vicino ai bordi della piastra Petri, e
distribuirlo con l’anse su tutta la superficie.
•
INCUBAZIONE
Si utilizzano termostati ad aria o bagnimaria termostatati. Le piastre vanno
capovolte per evitare il rapido essiccamento e la formazione sul coperchi
di gocce di condensa che potrebbero compromettere la crescita
microbica
Per l’incubazione in anaerobiosi si possono usare terreni contenenti sostanze
riducenti
ATTIVITA’ METABOLICHE DEI BATTERI
Lo studio delle caratteristiche biochimiche sono alla base del riconoscimento di molti
microrganismi. Esse rappresentano una sorta di impronta digitale, la prova del nove per
la determinazione della specie
1.
Produzione di catalasi: è possibile differenziare gli stafilococchi (catalasi positivi)
dagli streptococchi (catalasi negativi).La catalasi si può dimostrare stemperando
un’ansata della colonia batterica in una goccia di acqua ossigenata al 3%
2.
Produzione di coagulasi: è un enzima liberato da alcuni batteri (stafilococchi
patogeni, ecc.) in grado di coagulare il plasmadi coniglio
3.
Le Enterobacteriaceae si caratterizzano per le seguenti attività metaboliche: 1utilizzazione del glucosio per via fermentativa,2 - assenza di attività citocromo
ossidasica, 3- riduzione dei nitriti a nitrati, 4-idrolisi della gelatina, 5-produzione di
acido solfidrico, 6-produzione di indolo, 7-produzione di ureasi, 8-prova
dell’ONPG, 9-prova della decarbossilasi, 10-prova dell’utilizzazione del citrato
REQUISITI DI QUALITA’ DELLE ACQUE DESTINATE AL
CONSUMO UMANO
•
•
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
•
La legge 236/88 tra i requisiti di qualità da prendere in considerazione per
le analisi delle acque destinate al consumo umano impone parametri
organolettici (colore, torbidità, odore, sapore), fisico-chimici e
microbiologici
Oltre a tali parametri, a giudizio dell’autorità sanitaria competente potrà
essere effettuata la ricerca concernente i seguenti parametri accessori:
Alghe
Batteriofagi anti Escherichia coli
Elminti
Enterobatteri patogeni
Enterovirus
Funghi
Protozoi
Pseudomonas aeruginosa
Stafilococchi patogeni
Il DPR 236/88 prevede tra i parametri microbiologici tre controlli di routine
(C1, C2, C3) ed un controllo occasionale C4
TECNICHE PER QUANTIFICARE I PARAMETRI
MICROBIOLOGICI
Colimetria: principali tecniche per quantificare i coliformi
1.
Conta diretta su piastre Petri
2.
Metodo statistico o MPN (Most Probable Number)
3.
Filtrazione su membrana (MF)
•
La conta diretta fa riferimento a volumi piastrabili non superiori a 1ml, quantità
insufficiente per accertare l’assenza di coliformi quali indicatori di inquinamento
fecale
•
Tecnica MPN:
si basa sull’elaborazione statistica dei risultati positivi o negativi di diverse serie (3
o 5) di tubi contenenti un brodo in cui i coliformi (in diluizioni successive 1:10)
fermantano il lattosio con produzione di acidi e di gas. La densità batterica
(MPN/100 ml) è funzione esponenziale del numero di provette positive
•
Tcnica MF:
Si basa sulla filtrazione sottovuoto di 100 ml o più di acqua su membrane di
acetato di cellulosa con porosità 0,45 micron. La filtrazione avviene con pompa ad
acqua unita ad un comune rubinetto. La membrana viene quindi trasferita su un
terreno selettivo in capsula Petri
Di fatto non sono disponibili metodi di sicura affidabilità che permettano la
determinazione del numero totale di microrganismi vitali contenuti in acqua. Le
metodiche di uso comune presentano sempre sostanziali differenze tra i conteggi nei
terreni di coltura in piastra e i conteggi totali diretti al microscopio. Inoltre il numero di
batteri capaci di formare colonie su terreno agarizzato è palesemente inferiore rispetto
alla concentrazione reale nelle acque e nel suolo
RICERCA DEI COLIFORMI TOTALI E DEI COLIFORMI
FECALI
I coliformi sono batteri Gram negativi, a morfologia bastoncellare, aerobi-anaerobi
facoltativi, non sporigeni, in grado di fermentare il lattosio con produzione di acido e di
gas entro 48 ore dall’incubazione a 32-37 °C (coli totali), a 44,5 °C (coli fecali).
Comprendono i generi Escherichia, Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter.
Coliformi totali
Sono batteri diffusi nel suolo, nelle materie prime di origine animale e vegetale, nelle
acque e negli ambienti in generale. Con la loro presenza nelle acque i coliformi si
comportano come indicatori di inquinamento fecale, segnalando il rischio potenziale della
contemporanea presenza di enterobatteri patogeni a localizzazione intestinale
(salmonelle e Shigelle)
•
La ricerca può effettuarsi con il metodo MF o col metodo MPN
•
Metodo MF:
Composizione terreno per il conteggio dei coliformi in g/l:
Estratto di lievito
1,2
Triptone
3,7
Peptone P
3,7
Triptosio
7,5
Lattosio
9,4
Potassio fosfato monoacido 3,3
Potassio fosfato biacido
1,0
Sodio cloruro
3,7
Sodio laurilsolfato
0,05
Sodio solfito
1,6
Agar
10
pH finale 7,2
Tutti i microrganismi che producono colonie rosso scuro con riflessi metallici verdi dorati sono da considerarsi
possibili coliformi
•
Metodo MPN:
•
Prova presuntiva
Composizione in g/l del brodo lattosato:
Estratto di carne
3
Peptone
5
Lattosio
5
Acqua distillata
1000
pH finale dopo sterilizzazione
6,9
Mescolare e distribuire 50 ml di brodo doppio concentrato in matracci e 10 ml in provette munite
campanella di Durham. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Conservare il terreno a
temperatura ambiente. Per la semina aggiungere in ciascuno dei due matracci 50 ml di campione
(acqua). Aggiungere in due serie di 5 provette contenenti 10 ml di LB 10 ml di campione. Incubare a
36°C per 48 ore
Sono positivi i contenitori in cui si è avuta entro 48 ore la fermentazione del lattosio con produzione di
gas
La prova con LB è da considerarsi presuntiva.
•
Prova di conferma
I tubi positivi (presenza di gas) devono essere
sottoposti a conferma in brodo-lattosio-bile-verde brillante a 36°C per 48 ore. La bile e il verde brillante
inibiscono la crescita dei batteri Gram-positivi, mentre i coliformi si manifestano fermentando il lattosio
con liberazione di gas. Sulla base della positività su tale terreno riportare il valore come MPN/100 ml
di campione.
Composizione del BGBB in g/l:
Peptone
10
Lattosio
10
Bile di bue
20
Verde brillante
0,0133
Acqua distillata
1000
pH finale 7,4
Tabella per il calcolo del numero più probabile MPN
Quantità di acqua
seminata per ogni beuta
e per tubo
Numero
di tubi
positivi
ml 50
ml 10
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
Numero più
Quantità di acqua
probabile/100 seminata per ogni
ml di
beuta e per tubo
campione
0
1
2
4
5
7
Numero ml 50 ml 10
di tubi
1
0
positivi
1
1
1
2
1
3
1
4
1
5
Numero più
probabile/1
00 ml di
campione
2
3
5
9
16
oltre 16
Coliformi fecali
Comprendono i batteri termoresistenti (44°C) il cui habitat naturale è l’intestino umano o
Animale. La specie più rappresentativa è Escherichia coli. Poiché E.coli è un ospite
normale predominante della popolazione batterica aerobia-anaerobia facoltativa
residente nell’intestino crasso, la sua presenza in un dato materiale (acqua, alimenti,
ecc.) viene considerata un indizio sicuro di contaminazione fecale.
• Metodo MF
Terreno per il conteggio dei coliformi fecali mediante MF:
Triptosio
10
Peptone proteasi 5
Estratto di lievito 3
Sodio cloruro
5
Lattosio
12,5
Sali biliari
1,5
Blu di anilina
0,1
Agar
15
Acqua distillata 1000
pH finale 7,4
Aggiungere 10 ml di una soluzione di acido rosolico (1% di NaOH 0,2N)
Non autoclavare
L’acido rosolico ((C 6 H 4 OH)2 CC 6 H 4 O) sopprime la flora microbica non coliforme
•
Metodo MPN
Composizione in g/l del terreno liquido di conferma indicato per la ricerca dei coliformi fecali (EC Medium)
Triptone
20
Lattosio
5
Sali biliari n° 3
1,5
Potassio fosfato monoacido 4
Potassio fosfato biacido
1,5
Cloruro di sodio
5
pH finale 6,9
Procedura
Prova presuntiva
Prima di procedere all’inoculo di aliquote scalari del campione nei tubi del brodo per la prova presuntiva, agitare
vigorosamente il campione per assicurare una distribuzione omogenea dei microrganismi sospesi nell’acqua.
Dopo l’inoculo agitare leggermente i tubi e procedere all’incubazione in termostato entro 30 minuti. Incubare a
36±1°C. Dopo 24±2 ore agitare ciascun tubo per verificare la formazione di gas nella campanella ed
eventualmente reincubare per altre 24 ore. Alla fine del periodo di incubazione registrare i risultati in base alla
disposizione dei tubi che presentano produzione di gas ed intorbidimento
del brodo. La produzione di gas entro le 48±3 ore costituisce una reazione positiva presuntiva, sottoporre alla
prova di conferma i tubi risultati positivi.
Prova di conferma
Prelevare, sterilmente, 1 mL di brodocoltura dai tubi positivi del brodo per la prova presuntiva (formazione di gas
entro le 48 ore) ed inoculare nei corrispondenti tubi contenenti il brodo per la prova di conferma. Incubare i tubi a
44±1°C per 24±2ore. Alla fine del periodo di incubazione, la formazione di gas nelle campanelle costituisce una
reazione positiva per i coliformi fecali. Annotare i risultati ottenuti indicando il numero di tubi positivi e negativi e,
sulla base delle combinazioni ottenute, consultando la Tab. 1, calcolare, considerando l’eventuale diluizione, il
valore dell’indice MPN.
La formazione di gas nella campanella di Durham indica la presenza di E. coli senza escludere la presenza di
coliformi. La presenza di gas solo a 37 °C segnala la presenza di coliformi ed esclude quella di E. coli.
Escherichia coli si distingue dagli altri coliformi lattoso-fermentanti per la capacità di produrre indolo in acqua
triptonata in 24 ore a 44 °C. Un terreno idoneo per la conferma di E. coli da tubi presuntivi è il Brodo Triptone
Mannitolo Ricinoleato (BTMR)
IL LATTE
Se non altrimenti specificato, il latte destinato al consumo umano è quello ottenuto dalla mungitura
regolare, ininterotta e completa della mammella di mucche in buono stato di salute e di nutrizione
La direttiva CEE n° 46/92 stabilisce la seguente nomenclatura:
MICROFLORA DEL LATTE
•
•
•
•
•
Prelevato in condizioni igieniche ottimali in una vaccina sana, il latte contiene in
media alla mungitura circa 5000 microrganismi e meno di 1 coliforme/ml. Si tratta in
genere di micrococchi, streptococchi lattici e lattobacilli saprofiti presenti nei canali
galattofori della mammella.
Le sorgenti di origine endogena sono influenzate dalle condizioni sanitarie della
lattifera che può essere affetta da mastiti, e altre malattie infettive quali la brucellosi,
l’afta epizootica, il carbonchio ematico, il vaiolo, la tubercolosi, la febbre Q (causata
da Coxiella burnetii), ecc.
La contaminazione esogena dipende dall’igiene della mungitura, dalle condizioni
igieniche della stalla e dell’animale, dal trasporto e dalla conservazione del latte.
Il latte crudo, prima dei trattamenti termici, può subire la contaminazione di una
variegata microflora batterica. Molti germi psicrotrofi sono in grado di moltiplicarsi
anche a temperature di refrigerazione sotto i 7°C. I principali sono: Acinetobacter,
Alcaligenes, Flavobacterium, Pseudomonas, ed alcuni sporigeni dei generi Bacillus e
Clostridium. Il latte può essere inquinato anche da lieviti (Saccharomyces cerevisiae,
Candida Kefyr, Debaryomyces hansenii, ecc.).
La bovina malata può trasmettere all’uomo con il latte patogeni quali: Mycobacterium
bovis, M. tubercolosis, Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, Salmonella,
Leptospira, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Pasteurella multocida,
Clostridium perfrigens, Coxiella burnettii, Campylobacter, Yersinia enterocolica, ecc.
BATTERI LATTICI
• I batteri lattici sono bacilli Gram positivi, immobili, asporigeni, anaerobi microaerofili
(crescono anche in presenza di esigue quantità di ossigeno). Metabolizzano gli
zuccheri con produzione di acido lattico.
• La percentuale di acido lattico prodotto è variabile con la specie di bacillo. La
produzione di acido lattico può determinare la coagulazione del latte per la
precipitazione della caseina.
• La dimunuzione di pH favorisce lo sviluppo di batteri acidofili e dei miceti che
preparano l’ambiente per altri microrganismi in grado di decomporre ciò che resta
delle sostanze organiche, accelerando i processi putrefattivi.
• Le capacità fermentative variano da specie a specie e sono più elevate nei batteri
lattici termofili. I generi principali di batteri lattici sono: Lactobacillus, Streptococcus,
Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus
TRATTAMENTI TERMICI PER IL LATTE ALIMENTARE
•
1.
PASTORIZZAZIONE
In flusso continuo: si realizza a temperature comprese fra 61 e 65°C per almeno 30 minuti in modo da assicurare la
completa distruzione di tutti i microrganismi patogeni (in particolare il bacillo di Koch)
2.
Rapida: (H.T.S.T) si esegue a 72-85 °C per 15-30 secondi e rapido raffreddamento a 2-4 °C Diversi sono i batteri che
possono sopravvivere a queste temperature: (Streptococcus termophilus, micrococchi, Clostridium, ecc.)
Si distinguono i seguenti tipi di latte pastorizzato:
1.
Latte pastorizzato ottenuto da latte già pastorizzato: deve presentare al consumo a) la prova della fosfatasi alcalina
negativa; b) un contenuto in sieroproteine solubili non denaturate non inferiore all’11% delle proteine totali
2.
Latte fresco pastorizzato ottenuto da latte crudo trattato entro 48 ore dalla mungitura: a) fosfatasi alcalina negativa; b)
sieroproteine > 14%; c) positivo alla prova della perossidasi. In relazione al contenuto dei grassi il latte pastorizzato può
essere: - intero, con valori non inferiori al 3,5%; - parzialmente scremato, con valori inferiori all’1,8%; - scremato, con
valori inferiori all’1%
3.
Latte fresco pastorizzato di alta qualità ottenuto da latte crudo di elevate caratteristiche qualitative: è un latte con
particolari caratteristiche igieniche e di composizione stabilite con riferimento al contenuto di proteine, di grasso, di
carica batterica totale. Tale latte proviene da bestiame selezionato, allevato in fattorie modello, con tutte le
caratteristiche di igiene e di genuinità imposte dalla legge 169/1989 e dal decreto 185 del 975/1991
•
STERILIZZAZIONE
La sterilizzazione deve assicurare la distruzione di tutti i microrganismi o impedirne definitivamente la proliferazione. Di
fatto un pur minimo rischio microbiologico rimane
Le modificazioni sul valore biologico del latte sterilizzato riguardano in particolare la riduzione della componente
proteica e vitaminica (vitamine C, B1, B12, E)
L’interazione del lattosio con le proteine può creare imbrunimento ed accentuare il sapore di cotto o di caramello.
Il latte sterilizzato viene definito:
a)
Latte sterilizzato a lunga conservazione: quando ha subito un trattamento termico finale di sterilizzazione in contenitore
sigillato a temperatura di 118 – 120 °C per 15-20 minuti. La data di scadenza non deve superare i 180 giorni dal
confezionamento.
b)
Latte UHT (Ultra High Temperature): quando il trattamento termico viene applicato in un’unica volta a 140-150°C per 2
secondi ed è seguito dal confezionamento asettico in un recipiente opaco. La scadenza non deve superare i 90 giorni
dal confezionamento. Può avvenire per scambio di calore o per uperizzazione.
•
LATTE A RIDOTTO CONTENUTO DI UMIDITA’
a)
Latte evaporato: sterilizzato a 114-118°C per 15 minuticon un contenuto in acqua dal 66 al 68,5%. Grasso dal 10% allo
0,5%
b)
Latte condensato: con aggiunta di zucchero sotto forma di sciroppo, con il 26% di acqua e il 9% di grasso
c)
Latte in polvere: essiccato a 130-150°C contiene il 4-5% di acqua e grasso dal 26% all’1,5%
RICERCA DEI PARAMETRI MICROBIOLOGICI
Il percorso che in genere si segue è caratterizzato da 4 fasi:
1.
Campionamento
2.
Preparazione del campione
3.
Semina in terreni colturali
4.
Identificazione biochimica
Le prove principali riguardano:
•
Reduttasi
•
Carica microbica totale
•
Enterobatteri totali
•
Coliformi
•
Salmonelle
•
Staphylococcus aureus
•
Listeria monocytogenes
•
Mastite
•
•
PROVA DELLA REDUTTASI
Introdurre in una provetta 10 ml di latte crudo e 1 ml di blu di metilene. Tappare, agitare ed
incubare a 40°C
CARICA MICROBICA TOTALE
Il D.M. del 26/3/92 impone la numerazione dei germi in piastra a 30°C, a 21°C e la numerazione
dei coliformi a 30°C. Il metodo si applica al latte crudo, al latte pastorizzato, nonché a quello
uperizzato e sterilizzato dopo preincubazione a 30°C per 15 gg. La tecnica consiste nel seminare
il campione in un terreno di coltura, incubare in termostato a 30 °C per 72 ore per la carica
mesofila e a 21°C per 25 ore per quella psicrotrofa e contare le colonie. Si calcola il numero dei
germi per 1 ml nel caso del latte crudo o pastorizzato e per 0,1 ml nel caso del latte uperizzato o
sterilizzato.Diluizioni: a) latte crudo: diluire da 1:1000 a 1:100000; b) latte pastorizzato: diluire
da 1:10 a 1:1000. Conteggio: Contare con il contacolonie le coppie di piastre nelle quali sono
visibili colonie in numero né troppo basso (ca.30), né troppo alto(non superiore a 300). Calcolare
la media dei due conteggi e moltiplicare per il reciproco della diluizione. Il risultato corrisponde al
numero delle U.F.C per unità di peso o di volume. Terreno di coltura: ()
Agar Conta
Latte agarizzato
Estratto di carne
3 g/l
Estratto di lievito
2,5 g/l
Triptone
5 g/l
Triptone
5,0 g/
Destrosio
1 g/l
Destrosio
1 g/l
Agar
15 g/l
Latte scremato in polv.
1 g/l
Diluente:
Agar
15 g/l
Peptone
1g
Acqua
1000 ml
Cloruro di sodio
8,5 g
Acqua
1000 g
SAGGIO ALLA RESAZURINA
Permette di valutare lo stato microbico del latte. Più sono i germi e più veloce è l’effetto riducente della
resazurina e quindi la decolorazione del latte da azzurrato al colore originario.
In una provetta a 10 ml di campione si aggiunge 1 ml di resazurina. Si chiude con tappo sterile, si
agita e si pone a bagnomaria a 37-40°C per 10 minuti. Tanto più la carica microbica del latte è alta
tanto più rapidamente si avrà la decolorazione.
•
ENTEROBACTERIACEAE
La famiglia delle Enterobacteriacae raggruppa batteri bacillari e coccobacillari a prevalente habitat
intestinale, Gram negativi, aerobi-anaerobi facoltativi con metabolismo sia respiratorio sia fermentativo
degli zuccheri con produzione di acidi e di gas. . Sono catalasi positivi e privi dell’enzima ossidasi. Gli
enterobatteri sono accomunati da caratteri biochimici e sierologici che rappresentano uno dei criteri di
classificazione. A livello colturale , gli enterobatteri mostrano rispetto ai Gram positivi, una minore
sensibilità nei confronti di acidi, Sali biliari e coloranti (cristalvioletto…). Crescono bene in terreno
contenente rosso neutro dove producono colonie rosse.
I generi più comuni sono:
Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Proteus,
Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia
Enterobacteriaceae totali: metodo di inclusione in piastra
Incubare a 37°C per 24 ore su Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA)
Peptone
7 g/l
Estratto di lievito
3 g/l
Glucosio
10 g/l
NaCl
5 g/l
Sali biliari
1,5 g/l
Rosso neutro
0,03 g/l
Cristalvioletto
0,002 g/l
Aga
10-15 g/l
Acqua
1000 ml
Prova dell’ossidasi
Si porta un’ansata stemperata di patina batterica su un dischetto o all’estremità di uno stick impregnata con
una soluzione di N,N-dimetil-p-fenilendiammina ossalato (Oxoid, ecc.), acido ascorbico e alfa naftolo. Lo
sviluppo dopo 30 secondi di un colore blu-porpora è indicativo di reazione positiva. Le enterobacteriaceae
sono ossidasi negative.
Metodo dell’impedenza
Anche basse densità di batteri alterano l’impedenza propria del latte
Numerazione dei coliformi
I coliformi sono batteri ad habitat intestinale, generalmente non patogeni, che a 30 °C
fermentano il lattosio con produzione di gas. La loro presenza negli alimenti è indice di
inquinamento fecale. I più comuni sono Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter, Serratia
ed Hafnia.
Principio:
Mescolare un volume definito di campione di latte con il terreno di coltura in piastre Petri
del diametro di circa 100 mm.
Incubare a 30 °C per 24 ore.
Contare le colonie caratteristiche confermando, se necessario, l’identità di quelle dubbie
con la fermentazione del lattosio.
Calcolare il numero di coliformi per 1 ml di latte pastorizzato considerando i fattori di
diluizione.
Diluizioni suggerite: 1:10, 1:100, 1:1000
Terreni di coltura.
1.
Violet Red Bile Lactose Agar (VRBLA) (come il VRBGA con il lattosio al posto del
glucosio)
2.
Brodo Bile Verde Brillante (BGB) (terreno colturale di conferma)
Peptone
10 g/l
Lattosio
10 g/l
Bile di bue
20 g/l
Verde brillante
0,0133 g/l
Acqua
1000 ml
Determinazione dei coliformi totali col metodo MPN
Il metodo MPN è applicabile quando si desideri campionare quantità elevate ed
escludere, ad esempio, la presenza di coliformi in 1 g di prodotto. Per il calcolo dell’indice MPN si
utilizzano le tavole probabilistiche.
Si sfrutta la capacità dei coliformi di metabolizzare il lattosio per via fermentativa con produzione di
gas che si accumula nella campanella di Durham posta in brodo bile verde brillante
Procedimento:
Preparare tre diluizioni del campione di latte omogenato 0,1; 0,01; 0,001. Si dispongono tre serie di tre
tubi contenenti 10 ml di BGB 2%.
Nei tre tubi della prima fila, contenenti brodo doppiamente concentrato, si inoculano 10 ml di
omogenato, equivalenti a 1 g di campione
Nei tre tubi della seconda fila si inocula 1 ml di omogenato, equivalente a 0,1 g di campione per
tubo
Nei tre tubi della terza fila si inocula 1 ml di omogenato diluito 1:10, equivalente all’inoculo di 0,01
g di campione per tubo
Incubare a 32°C per 24 ore. La presenza di coliformi resistenti ai Sali biliari e al verde brillante è
testimoniata dalla produzione di gas che si accumula nella campanella di Durham.
Prova di conferma
Da ciascuna provetta positiva si semina un’ansata in VRBA. I microrganismi fermentanti il lattosio
formano colonie rotonde del diametro < 0,5-2 mm di colore rosso porpora.
Interpretazione dei risultati:
Risultato positivo se si ha sviluppo di gas in due tubi su tre della prima fila
Risultato positivo se si ha sviluppo di gas in un tubo su tre della seconda fila
Nessun risultato positivo se non si ha sviluppo di gas nei tre tubi della terza fila.
A ciascun risultato si attribuisce un valore pari al numero delle provette positive. Tramite le apposite
tabelle di conversione MPN specifiche per varie serie di inoculi di diluizioni, il risultato codificato
viene espresso in numero più probabile.
Confrma di Escherichia coli
La presenza di Escherichia coli insieme a Enterobacter aerogenes in un campione è indice di contaminazione
fecale e fa sospettare, per comunanza di nicchia ecologica, la presenza di microrganismi patogeni intestinali
quali salmonelle, virus gastroenterici, ecc.
E. coli, abituale commensale intestinale, può causare in situazioni particolari serie affezioni diarroiche a carico di
ceppi enteropatogeni, enterotossigenici, enteroinvasivi e enteroemorragici
L’attività tossica si manifesta quando la carica batterica è compresa tra 100 milioni e 10 miliardi di cellule.
E. coli è anche l’agente più comune di infezioni urinarie.
Gli stipidi enterotossigenici producono due tipi di tossine, una termolabile e una termoresistente, responsabili dei
sintomi diarroici.
PROCEDIMENTO
•
Inoculare un’ansata di brodocoltura BGB 2% positiva ai coliformi, in una provetta contenente brodo BGB2% e in
una provetta di acqua peptonata (Peptone 10 g/l, Sodio cloruro 5 g/l).
•
Incubare a 44°C per 48 ore.
•
In caso di risultato positivo si ha lo sviluppo di gas nella campanella del tubo con BGB2%
•
Aggiungere, nella provetta contenente acqua peptonata, 1 ml di reattivo di Kovacs
(Paradimetilaminobenzaldeide 5 g, Alcool isoamilico 75 ml, Acido cloridrico conc. 25 ml). La prova è positiva
quando in presenza di indolo, formato da E. coli per la deaminazione del triptofano, in pochi minuti il reattivo si
colora di riosa-rosso.
•
Partendo dagli inoculi positivi a E. coli si può calcolare il MPN come visto per i coliformi totali.
•
Con il materiale della provetta con BGB 2% si può procedere ad altre reazioni ed accertamenti
•
Si inocula in VRBA un’ansata da BGB2% positiva dopo 48 ore di incubazione a 44°C
•
Da ogni piastra si trapiantano 4-5 colonie in Agar Conta.
Dopo incubazione le nuove colonie si seminano:
1.
Sulla superficie a becco di clarino del terreno di Simmons (Ammonio fosfato biacido 1 g/l; Fosfato bipotassico 1
g/l; Cloruro di sodio 5 g/l; Citrato di sodio 2 g/l; Magnesio solfato 0,2 g/l; Blu di bromotimolo 0,08 g/l; Agar 15 g/l;
Acqua 1000 g/l). Dopo 48 ore di incubazione, in caso di positività si ha crescita e viraggio dal verde al blu
scuro.(E. coli non si sviluppa su questo substrato a differenza di Aerobacter aerogenes).
2.
In una provetta contenente Brodo Rosso Metile e Voges Proskauer.Si incuba a 37°C per 48 ore. Quindi si
trapianta 1 ml di brodocoltura in una provetta e si aggiungono i reattivi di Barritt: 0,6 ml di una soluzione al 5%
di alfa-naftolo in alcool etilico assoluto e 0,2 ml di soluzione acquosa al 40% di KOH; agitare in presenza di
ossigeno e attendere 15 minuti. Dopo un minuto in caso di positività si ha colore rosso per la presenza di
acetoina prodotta dal gruppo Enterobacter-Serratia-Hafnia-Klebsiella ma non da E. coli.
CONTROLLO DI QUALITA’ DEGLI ALIMENTI
Gli alimenti o le materie prime utilizzate possono essere vettori di microrganismi patogeni
e di tossine preformate. Durante la preparazione, il prodotto può subire ulteriori
inquinamenti causati dall’ambiente di trasformazione, dagli operatori e dalle attrezzature
adottate. Determinante il periodo stagionale, con prevedibile peggioramento delle
risposte favorevoli nel periodo estivo.
PROCEDURE ANALITICHE
A 25 g di campione si aggiungono in sacchetto sterile 225 ml di acqua peptonata tamponata (pH 7,0).
Si tratta per 1’ in Stomacher e si lascia a riposo l’omogenato per circa 10’. La soluzione, diluita 1:10,
viene utilizzata per le successive diluizioni di lavoro e per il pre arricchimento nella ricerca di
salmonella.
Carica batterica mesofila: 37°C per 48 ore seminando in superficie su Agar Gelisato il campione
opportunamente diluito
Coliformi totali: 37°C per 48 ore col metodo MPN in Brodo lattosato con Bile, Verde Brillante e
campanella di Durham
Coliformi fecali: come sopra a 44°C per 48 ore
Escherichia coli: conferma dai tubi positivi per coliformi fecali con trapianto in provette di Acqua
Triptonata ed incubazione a 44°C per 24 ore per accertare la produzione di indolo e calcolo
dell’MPN/g
Staphylococcus aureus: semina in superficie di 0,1 ml ed 1 ml dell’omogenato su agar di Baird-Parker;
incubazione a 37°C per 48 ore, conteggio delle colonie sospette e loro identificazione
Salmonella spp.: pre-arricchimento a 37°C per 24 ore dell’omogenato in acqua peptonata tamponata,
arricchimento di 1 ml in 100 ml di Rapport-Vassiliandis a 43°C per 18 ore, isolamento in XLD e prove
di conferma