Transcript Document 7308413

ชนิดของกล้องจุลทรรศน์
• กล้องจุลทรรศน์ชนิดที่ใช้แสง
–
–
–
–
Bright-field microscope
Dark-field microscope
Phase-contrast microscope
Fluorescence microscopes
กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง
• กำลังขยำยโดยทัว่ ไป 1000 – 2000 เท่ำ
• ภำพที่ได้จะเป็ นภำพที่ทึบ พื้นหลังสว่ำง
• ประกอบด้วยเลนส์ใกล้วตั ถุหลำยอัน
– parfocal microscopes remain in focus when objectives are changed
• กำลังขยำยของภำพ
= กำลังขยำยของเลนส์ใกล้ตำ x กำลังขยำยของเลนส์ใกล้วตั ถุ
รำยละเอียดของภำพ (Resolution power)
• ควำมสำมำรถในกำรแยกจุด 2 จุดออกจำกกัน
• ควำมยำวคลื่นแสง
shorter wavelength  greater resolution
Eyepiece
กล้องจุลทรรศน์
Binocular tube
Revolving nosepiece
Objective
Stage
Arm
Mechanical stage
Fine adjustment
Course adjustment
Condenser
Base
Illuminator
ควำมสำมำรถในกำรขยำยภำพของกล้องจุลทรรศน์
• Resolution power
– ควำมสำมำรถของเลนส์ใกล้วตั ถุในกำรแยกจุดสองจุดที่อยูใ่ กล้กนั
R = 0.6 x /NA
• Numerical aperture
– ควำมสำมำรถของเลนส์ใกล้วตั ถุในกำรเก็บรวบรวมแสงที่หกั เหภำยใน
วัตถุ
NA = n sin 
Working distance
Low power
High power
Working distance
Oil Immersion
• คุณสมบัติของเลนส์ ใกล้ วตั ถุ
Property
Objective lens
Scanning
Low power
High power
Oil Immersion
magnification
4x
10x
40-45x
90-100x
Numerical aperture
0.1
0.25
0.55-0.65
1.25-1.4
40 mm
16 mm
4 mm
1.8-2.0 mm
Working distance
17-20 mm
4-8 mm
0.5-0.7 mm
0.1 mm
Resolution power
2.3 m
0.9 m
0.35 m
0.18 m
Focal length
(WL= 450 nm; blue light)
•working distance
- ระยะระหว่ างเลนส์ ใกล้ วตั ถุ กับผิวของแผ่ น กระจกปิ ดตัวอย่ าง หรื อ ตัวอย่ าง
Mechanical Lengths
Objective Specifications
The 3 Classes of Objectives
Chromatic and Mono-Chromatic Corrections
Plan Objectives
กล้องพื้นหลังมืด (Dark-Field Microscope)
• ภำพที่เกิดจะสว่ำงกว่ำพื้นหลัง
• ใช้ในกำรศึกษำตัวอย่ำงที่มีชีวิต และไม่ตอ้ งกำรย้อมสี ns
Dark field microscope
Phase-contrast microscope
• ภำพที่เกิดจะแสดงให้เห็นควำมแตกต่ำง โครงสร้ำงภำยในที่เกิดจำก
กำรหักเหของแสงที่แตกต่ำง
• ใช้ในกำรศึกษำเซลล์ที่มีชีวิต
• โปร่ งใสและไม่ตอ้ งย้อมสี
• เพิ่ม annual diaphragm ใต้ condenser และ phase plate ใน objective
lens
• wave length ~ 1/4 ของปกติ
Phase contrast microscope
Figure 2.10
Fluorescence Microscope
• ใช้แสง ultraviolet, violet หรื อ blue light
• ตัวอย่ำงถูกย้อมด้วย สี fluorochromes
• ภำพที่เกิด ตัวอย่ำงหรื อ ส่ วนที่ถูกย้อมด้วยสี จะเรื องแสง และพื้น
หลังจะมืด
Fluorescence Microscope
ภำพที่เกิดจำกกล้อง Fluorescence Microscope
กำรเตรี ยมตัวอย่ำงและกำรย้อมสี
• เพิ่มควำมสำมำรถในกำรมองเห็นตัวอย่ำงให้ชดั เจนขึ้น
• ช่วยให้เห็นรู ปร่ ำงลักษณะของตัวอย่ำงได้ชดั เจนขึ้น
• เก็บรักษำตัวอย่ำง
Fixation
• หยุดกิจกรรมต่ำงๆ ภำยในเซลล์
• เป็ นขั้นตอนที่รักษำโครงสร้ำงทั้งภำยนอกและภำยในตัวอย่ำงให้อยูใ่ นสภำพคงที่
• เป็ นกำรทำให้ตวั อย่ำงติดแน่นอยูบนแผ่นกระจกสไลด์
– โดยกำรใช้ควำมร้อน
• เป็ นกำรรักษำรู ปร่ ำงให้คงที่แต่ไม่รักษำโครงสร้ำงภำยใน
– โดยกำรใช้สำรเคมี
• เป็ นกำรรักษำโครงสร้ำงภำยใน รู ปร่ ำง เช่น Formaldehyde, Odmium tetroxide
(Os4) , potassium permanganate, Glutaraldehyde
กำรทำให้แห้ง และย้อมสี แบบง่ำย
(dehydration and simple staining)
• สี (stain)
– ทำให้สำมำรถมองเห็นโครงสร้ำงภำยในและภำยนอกได้ชดั เจนยิง่ ขึ้น
และแตกต่ำงจำกพื้นหลัง
• กำรย้อมสี แบบง่ำย
– ใช้สีเพียงสี เดียว
– เช่น สี เบสิ ค (basic dyes)
Electron Microscopy
• ใช้ลำแสงอิเล็คตรอนในกำรสร้ำง
ภำพ
• ควำมยำวคลื่นแสงสั้นกว่ำแสงทำให้
ภำพที่เกิดขึ้นมีรำยละเอียดสู งขึ้น
Transmission Electron Microscope
• electrons scatter when they pass through thin sections of a
specimen
• transmitted electrons (those that do not scatter) are used to produce
image
• denser regions in specimen, scatter more electrons and appear
darker
EM
Ebola
The Scanning Electron Microscope
• uses electrons reflected from the surface of a specimen to create
image
• produces a 3-dimensional image of specimen’s surface features
Fly head
Confocal microscopy
• have extremely high resolution
• can be used to observe individual
atoms
Confocal Microscopy
• confocal scanning laser microscope
• laser beam used to illuminate spots on specimen
• computer compiles images created from each point to generate a 3dimensional image
Figure 2.30
Biochemical Techniques
วัตถุประสงค์
เพื่อศึกษาคุณสมบัติและหน้ าทีข่ องส่ วนประกอบ
ต่ างๆ ของเซลล์
Molecule
Small
Large
Assembly of
macromolecule
หลักการ
คือ การทาให้ เซลล์ แตกเป็ นชิ้นส่ วน (Cell fractination) และ
เก็บชิ้นส่ วนของเซลล์ มาศึกษา โดย
1. การทาให้ เป็ นเนื้อเดียวกัน (Homogenization) สามารถทาได้ หลายวิธีคือ
1. โดยการบด (Pestle /Moltar)
2. การใช้ คลื่นเสี ยง (Ultrasonic vibration)
3. การสั บเป็ นชิ้นๆ (Wareing bleden/ Potter homogenizers)
4. การทาให้ แข็งตัวและละลาย (Freeze and Thaw)
5. การอัดด้ วยความดันสู ง (Deactivation)
6. การใช้ สารเคมี (Chemical)
7. การใช้ เอนไซม์ (Enzyme)
Homogenizer
http://www.freewebs.com/ltaing/chpt7.3Cellfractionation.gif
Ultrasonic vibration
Deep freezer
Gel Filtration
http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/protein/proteinsb.htm
2. การแยกส่ วนประกอบต่ างๆ ออกจากกัน
(Separation of the homogenate)
1. การปั่นตกตะกอน (Centrifugation)
- Gravity (g)
- Relative centrifugal force (RFC)
- Rate of sedimentation of components
(size, shape, density of particle and solvent, speed)
- Differential centrifugation
- Rate-zonal or density-gradient centrifugation
Differential Centrifigation
http://www.freewebs.com/ltaing/chpt7.3Cellfractionation.gif
Differential Centrifigation
http://www.freewebs.com/ltaing/chpt7.3Cellfractionation.gif
3. การแยกชิ้นส่ วนของเซลล์ (Separation of biomolecules)
1. ความสามารถในการละลาย (Solubility)
2. ขนาด (size)
- Centrifugation
- Dialysis
- Ultrafiltration
- Gel filtration
- SDS -PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate
Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
Ultrafiltration
3. ประจุไฟฟ้ า (Charge)
Ion exchange chromatography
Isoelectric focusing
Electrophoresis
4. Biological properties
Affinity of chromatography
Immunoelectrophoresis
Blotting - Southern blot (DNA)
- Northern blot (RNA)
- Western blot (Protein)
Chromatography อื่นๆ (paper. Gas , Thin-layer)
PCR (Polymerase chain reaction)
Ion Exchange
http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/protein/ion_exchange.jpg
Immunoelectrophoresis
http://www.haps.nsw.gov.au/edrsrch/edimages/myeloma2.jpg
Southern blot
เป็ นเทคนิคที่ศึกษา DNA ที่ได้ ทาการแยกด้ วย agarose gel
electrophoresis
Northern blot
เป็ นเทคนิคที่ศึกษา RNA
Western blot
PCR (Polymerase Chain Reaction)
เป็ นการเพิม่ ปริมาณ DNA ที่ต้องการศึกษา โดยการใช้ เครื่ อง
เพิม่ ปริมาณ DNA ประกอบด้ วยขั้นตอน
1. Denaturation เป็ นการแยกสาย DNA จากสายคู่ให้ เป็ นสาย
เดี่ยว โดยใช้ ความร้ อน ประมาณ 90-95oC
2. Annealing เป็ นการลดอุณหภูมิลงเพื่อให้ Primer มาจับกับ
สาย DNA ต้ นแบบ โดยใช้ ความร้ อน ประมาณ 50-55oC
3. Extension (primer extension, synthesis) โดยใช้ ความร้ อน
ประมาณ 70-75oC
Buffer Optimalization
•
•
•
•
•
•
10 mM Tris HCl, pH 8.3
50 mM KCl
1.5 - 2.5 mM MgCl2
50 - 200 mM dNTP
DNA template concentration
Optional compounds
Primer Considerations
• Primer lengths
• GC contents
• Melting temperature
– Tm = 2(T+A)+4(G+C)
• Tm difference
• 3’ and 5’ end considerations
PCR Principle