Transcript Lo studio delle correnti ioniche di singolo canale

Lo studio delle correnti ioniche di singolo canale
mediante la tecnica del patch-clamp
Era noto da lungo tempo che attraverso la membrana
plasmatica è possibile un rapido scambio di ioni. Tuttavia,
Neher e Sakmann furono i primi a mostrare l’esistenza di
canali ionici specifici
La tecnica del patch clamp
Erwin Neher & Bert Sakmann Premi Nobel
per la medicina nel 1991 per lo sviluppo della
tecnica del patch-clamp rendendo possibile la
caratterizzazione di singoli canali ionici
Per chiarire come funziona un canale ionico,
cioè come esso si apre e si chiude, è necessario
poter registrare la corrente che lo attraversa.
Antecedentemente all’era del patch-clamp ciò
appariva elusivo in quanto la corrente ionica
attraverso un singolo canale è molto piccola.
Con la tecnica del patch-clamp si poterono
superare tali difficoltà.
Il setup per il patch-clamp
microscopio
microelettrodo
micromanipolatore
computer
preparato
oscilloscopio
amplificatore
gabbia di Faraday
La configurazione di cell-attached
Registrazione di una corrente elettrica che
fluisce attraverso un singolo canale ionico
Amplificatore
Elettrodo di registrazione:
micropipetta di vetro  10-6 m
Resistenza della saldatura: >1 GW
Con un opportuno equipaggiamento
elettronico e opportune condizioni
sperimentali è possibile misurare
questa corrente “microscopica”
Quando un singolo canale si apre,
gli ioni si muoveranno attraverso il
canale come una corrente elettrica
Quale tipo di informazioni è
possibile ottenere dalla registrazione
di correnti di singolo canale?
Ampiezza media
di singolo canale
Ampiezza media della corrente attraverso un singolo canale
Chiuso
Aperto
1 pA
20 ms
Traccia di corrente attraverso un singolo canale
Causa la presenza di un rumore di fondo che è riducibile ma non
eliminabile, l’ampiezza della corrente che fluisce attraverso un singolo
canale è soggetta a fluttuazioni.
Di essa è pertanto possibile conoscere solo il suo valore medio
Il calcolo di tale valore richiede la costruzione di un istogramma di
ampiezza derivato dalla registrazione di singolo canale
Costruzione di un istogramma di ampiezza
Chiuso
Aperto
1 pA
20 ms
1000
Numero degli eventi
 Occorre una lunga registrazione di singolo
canale
 Si misurano le ampiezze di tutte le aperture
 Tali ampiezze vengono riportate in un grafico
(istogramma di ampiezza)
 ll dominio dell’ampiezza (ascissa del grafico)
viene suddiviso in intervalli costanti a ciascuno
dei quali si associa il numero di aperture
aventi ampiezza corrispondente
800
600
m=1.7 pA
400
200
0
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
Ampiezza (pA)
1.9
La larghezza dell’istogramma dipende dal rumore di fondo della registrazione
L’andamento dell’istogramma può essere descritto da una funzione gaussiana del tipo:
N
dove:
m = ampiezza media di corrente
s = deviazione standard
A = area della distribuzione
( x  m )2
exp
2s 2
2 s 2
A
2.0
Misurando le correnti di singolo canale è possibile
costruire la relazione I-V a canale aperto
-30 mV
-100 mV
0 mV
-100 mV
+40 mV
-100 mV
La relazione corrente-voltaggio a canale aperto è generalmente lineare
iopen single = γ (V-EK)
La “conduttanza di singolo canale (g)” è un parametro biofisico
caratteristico di un certo tipo di canale
Probabilità
di apertura
Cos’è la probabilità di apertura?
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7 C8
C9
Chiuso
Aperto
A1
A2
Popen 
POPEN 
A3
A4
A5
A6
A7
A8 A9
A10
A1  A2  A3  .....  An
A1  A2  A3  .....  An  C1  C2  C3  .....  Cn
tempo totale trascorso nello stato aperto
tempo tot. nello stato aperto  tempo tot. nello stato chiuso
vale a dire,
POPEN  frazione del tempo trascorso nello stato aperto
Tracciati di singolo canale che mostrano Po diverse
0.1
chiuso
aperto
0.25
chiuso
aperto
0.5
chiuso
aperto
0.75
chiuso
aperto
chiuso
0.9
aperto
Po nel caso di un canale voltaggio-dipendente:
Essa varia al variare del potenziale
-30 mV
-100 mV
0 mV
-100 mV
+40 mV
-100 mV
Currente, conduttanza, e voltaggio
I = N·P·i
i = g (V – VR)
I = corrente “macroscopica”
N = numero di canali funzionali
P = probabilità che un canale sia aperto
i = corrente attraverso un singolo canale aperto
g = conduttanza del singolo canale aperto
V = potenziale di membrana
VR = potenziale di inversione
I = N·P·g (V – VR)
I = g (V – VR)
Corrente = Conduttanza  Driving force
g = Conduttanza “macroscopica”
g=Npg
se g è costante, g è proporzionale a P
I = g (V – VK)
Quale altro tipo di informazione può
dare l’analisi delle correnti di singolo
canale?
1. Il numero degli stati in cui il canale può esistere
2. Il tempo medio di permanenza in ciascun stato
3. Le velocità di transizione tra gli stati
I tre tracciati mostrano la stessa probabilità di apertura ma cinetiche diverse
chiuso
aperto
chiuso
aperto
chiuso
aperto
Durata delle aperture e delle chiusure
Chiuso
1 pA
Aperto
100 ms
Traccia di corrente attraverso un singolo canale ottenuta ad un potenziale fisso senza alcun tipo
di sollecitazione (stato stazionario).
La corrente passa frequentemente dall’uno all’altro di due distinti livelli
il canale pur in condizioni stazionarie può trovarsi in almeno due stati
conformazionali : chiuso e aperto
La traccia mostra una notevole variabilità nella durata delle aperture e delle
chiusure
Non è possibile prevedere quanto tempo il canale rimarrà in ciascun stato
funzionale (chiuso o aperto), né quando avverrà la successiva transizione:
Siamo di fronte a variabili casuali (stocastiche)
Le leggi che le governano possono essere dedotte dalla distrubuzione di
probabilità di un elevato numero di eventi (aperture e chiusure)
Come ricavare la distribuzione di probabilità
delle aperture e delle chiusure
• Occorre una lunga registrazione di singolo canale
• Si misurano le durate di tutte le aperture (e chiusure)
• Tali durate vengono riportate in un grafico (istogramma di durata)
• ll dominio temporale (ascissa del grafico) viene suddiviso in intervalli costanti a
ciascuno dei quali si associa il numero di aperture aventi durata corrispondente
Chiuso
Aperto
100 ms
500
350
400
250
∑aperture=950
200
150
100
Numero degli eventi
Numero degli eventi
Tempi di chiusura
Tempi di apertura
300
∑chiusure=950
300
200
100
50
0
0
5
10
15
20
25
Durata aperture (ms)
30
20
40
60
80
100
Durata chiusure (ms)
120
140
500
350
300
400
Numero degli eventi
Numero degli eventi
Tempi di chiusura
Tempi di apertura
250
=8 ms
200
150
100
=26 ms
300
200
100
50
0
0
5
10
15
20
25
30
20
40
60
80
100
120
140
Durata chiusure (ms)
Durata aperture (ms)
Notare l’andamento decrescente delle due distribuzioni:
• gli eventi di breve durata sono i più frequenti
• gli eventi più lunghi sono via via sempre meno numerosi
Le due distribuzioni delle durate sono ben descritte da funzioni del tipo:
t 
N ( t )  a  exp




dove:
• N(t) = numero di aperture comprese tra (t-0.5dt) e (t+0.5dt)
• dt =intervallo in cui è suddivisa l’ascissa
• a e  sono costanti tipiche del canale
In particolare,  =costante di tempo è un indice di quanto rapidamente la distribuzione declina
verso zero:
 è il tempo a cui la distribuzione è il 37% del suo valore iniziale
Nel caso di uno schema cinetico a due stati (C↔O) a=1/
Come sono correlati i tempi di permanenza e le
costanti di velocità nel caso di un modello a due stati?
a
C
1
N( to )   o  exp( t /  o )
b
O
1
N( tc )   c  exp( t /  c )
Si può dimostrare che:
N ( to )  b  exp(  b t )
N ( tc )  a  exp( at )
Cioè: Il tempo medio che il canale trascorre in un particolare stato (il
soggiorno in quello stato) e’ il reciproco della costante di velocità di
transizione che porta fuori da quello stato.
Tempo Medio di Apertura (MOT o o) = 1/b
Tempo medio di chiusura (MCT o c) = 1/a
Per esempio, se a = 250 s-1 e b = 1000 s-1, allora
la durata media dei soggiorni nello stato aperto sarà 1/b = 1 ms
e la durata media di soggiorni nello stato chiuso sarà 1/a = 4 ms
Quindi, in uno schema cinetico a 2 stati: MOT=1/b e MCT=1/a
La frazione di tempo che il canale trascorre in uno dei due stati
dipende da entrambe le costanti di velocità a e b. Pertanto:
Fraz. di t nello stato aperto =
MOT
a

MOT  MCT a  b
Se misuriamo un gran numero di tempi di apertura successivi,
che tipo di distribuzione osserviamo?
Supponiamo che un canale aperto abbia una probabilità P= 0.3 di
chiudersi nei successivi 0.1 ms. Allora, misurando 1000 aperture,
circa 700 volte si avrebbero aperture con un to>0.1ms, ecc.
800
N. eventi con ..
70% di 1000
700
70% di 700
490
70% di 490
343
70% di 343
240
….
….
t o > di..
0.1
0.2
0.3
0.4
….
700
600
500
400
300
200
100
0
0
0.2 0.4 0.6 0.8
1
1.2 1.4 1.6
Quando il canale è aperto vi è una probabilità costante che esso
cambi il suo stato da O a C in un breve e definito intervallo di
tempo dt, indipendentemente da quanto a lungo già si trovava nello
stato O, o da come ci era arrivato. Supponiamo per esempio che
esista una probabilità P=0.3 che la transizione avvenga nei
successivi 0.1 ms. Ciò significa che possiamo fare predizioni
statistiche circa il cambiamento da O a C. Avendo osservato un
gran numero di canali aperti, circa nel 30% di essi il cambiamento a
C sarà avvenuto nei primi 0.1 ms. Quindi, dopo 0.1 ms il 70% di
essi è ancora nello stato O. Nei successivi 0.1 ms, un ulteriore 30%
del rimanente 70% cambierà a C, e così via.
Processi con tali caratteristiche, che la probabilità di un particolare
cambiamento rimane costante in piccoli intervalli di tempo
successivi, sono esempi di processi Markoviani.
Canali con più stati chiusi distinguibili
Chiuso
Aperto
350
Tempi di apertura
300
300
250
250
Numero chiusure
Numero aperture
350
=8 ms
200
150
100
50
Tempi di chiusura
1=2.3 ms
2=25 ms
200
150
a1=0.4
a2=0.6
100
50
0
5
10
15
20
25
30
0
10
Durata aperture (ms)
20
30
40
50
60
Durata chiusure (ms)
Schemi cinetici possibili:

 C2 

 O
C1 



 O 

 C2
C1 


In questo caso le relazioni tra i tempi medi di apertura e di chiusura e le
costanti di velocità dipendono dallo schema cinetico scelto
Importanza di:
Frequenza di campionamento
Filtraggio dei segnali
nella registrazione di correnti di singolo canale
Seguiranno esempi di tracciati mostranti la
perdita di informazione con una frequenza di
campionamento bassa o con un filtraggio
eccessivo
Effetto del filtraggio su un tracciato di
corrente di singolo canale
Traccia filtrata a 10000 Hz
Traccia filtrata a 1000 Hz
0.5 pA
4 ms
In pratica per correnti di singolo canale il filtraggio analogico del
segnale è normalmente compreso tra 5 e 3 KHz
Effetto della frequenza di campionamento su un
tracciato di corrente di singolo canale
Freq. camp. = 0.1 ms/punto
Freq. camp. = 0.4 ms/punto
0.5 pA
4 ms
Teorema del campionamento: i dati dovrebbero essere campionati
ad una frequenza almeno doppia di quella della banda passante
Molte informazioni sul meccanismo di funzionamento dei canali
ionici sono il risultato di una collaborazione tra elettrofisiologi e
biologi molecolari
Supponiamo per esempio di voler testare l’ipotesi che una
particolare catena laterale della proteina-canale sia implicata nel
processo di apertura/chiusura.
Mutagenesi Sito-Diretta sul Canale Ionico
Gene (DNA)
Ipotesi circa una
importante catena laterale
RNA
Viene fatta
“esprimere” la
proteina con una
catena laterale
alterata
Vengono mutati i codons desiderati
o cDNA
misura