Transcript Document 7232142

1
Developmental Genetics
Topics :
I. Genetic Basis of Differentiation
II. Control of Gene Expression in
Differentiation
III. Nature of Determination
2
Development ของ organism
การเจริญพัฒนา Single fertilized egg cell เป็ น embryo
และไปเป็ น adult
12
 Adult ประกอบด้ วย cells จานวนหลาย trillions (10 )
ซึ่งถูกจัดเป็ นองค์ กรได้ organs ต่ าง ๆ
 Organ ประกอบด้ วย tissues กลุ่มต่ าง ๆ ทีม
่ หี น้ าทีแ่ ละความ
ชานาญต่ างกัน
 Tissue คือ กลุ่มเซลล์ ทม
ี่ รี ู ปร่ างและ หน้ าทีค่ ล้ ายกัน

3
Cell
Differentiation
4
Embryonic
development
ของ
Amphioxus
5
Differentiation
การแสดงออกของ คุณลักษณะพิเศษ (specialized
characteristics) ของเซลล์ type ต่ าง ๆ
 Specialized cellular functions ขึน
้ กับ
1) Proteins : structural proteins for cell shapes
2) Enzymes : specific chemical reactions
3) Hormones : signals from cell to cell

6
Genetics ของ Developmental Pathway



วิเคราะห์ ด้ วย Mutation
Developmental pathway ประกอบด้ วยเหตุการณ์ ใน
differentiation
ทาให้ เกิดโครงสร้ างของ tissues และ organs หรื อก็
คือ Phenotypes ของ differentiated cells
7

ส่ วนประกอบของ Developmental pathway
Different gene products
 Signal molecules : signal receptors
 Cytoplasmic proteins : signal transducers
 Transcription factors
 Regulator proteins

8
I. Genetic Basis
of
Differentiation
9
I. Genetic Basis of Differentiation
1. Theory of development
1.1 Theory of Mosaic Development
1.2 Theory of Regulative Development
2. Substances of development
2.1 Determinants
2.2 Inducers
2.3 Morphogens
10
Genetic Basis ของ Cell Differentiation
Early embryonic cells: จานวนมากเหมือนกันทั้ง
รู ปร่ างและหน้ าที่
 Differentiated cells : ผลิต specialized products
2 กลุ่มใหญ่
1) Fundamental proteins ทีจ่ าเป็ น (vital) ต่ อชีวติ โดย
Housekeeping genes : RNA polymerases &
ribosomal proteins
2) Specialized cell products สาหรับบาง organs โดย
Luxury genes : hemoglobin, insulin

11
12
1. Theory of Development
มี 2 ทฤษฏี อธิบายให้ ร้ ู ว่า Expression ของ genes ระหว่ าง
development ในเซลล์ แต่ ละชนิดไม่ เหมือนกัน
 gene หนึ่ง express ในเซลล์ ชนิดหนึ่ง
 gene อื่น express ในเซลล์ อก
ี ชนิดอื่น
1.1 Theory of Mosaic Development
1.2 Theory of Regulative Development
13
1.1 Theory of Mosaic Development
Differentiation ของ embryonic cells เกิดจากการ
สู ญเสี ย genetic potential ตั้งแต่ เริ่มต้ นไปเรื่ อย ๆ
ระหว่ างการเปลีย่ นแปลง
 ในแต่ ละ cell cycle ระหว่ าง development เซลล์ ลูกจะ
ไม่ ได้ genetic material เท่ ากัน --> เซลล์ ไม่ เหมือนกัน
 เมื่อรวมเซลล์ ท้ ง
ั หมดใน organism จึงมีเซลล์ หลายแบบ
คละกันเป็ นกระ (mosaic)
 Embryo เรี ยกว่ า Mosaic embryo

14
นั่นคือ ระหว่ างแบ่ งเซลล์ Genes ถูกแบ่ งเป็ นส่ วน
 genes ส่ วนมากสู ญเสี ย potential ระหว่ าง differentiation คง
เหลือแต่
1. Housekeeping genes และ
2. Luxury genes
 ใน invertebrate พบความแตกต่ างของเซลล์ ใน embryo
ตั้งแต่ ระยะ 2 เซลล์ ขึน้ ไป และ
 พบว่ าถูก programmed มาแล้ ว เช่ นส่ วนที่ differentiate ไป
เป็ น ระบบประสาท หรื อ กล้ ามเนื้อ

15
1.2 Theory of Regulative Development
เซลล์ embryo ของ eukaryote ชั้นสู งติดอยู่รวมกันจนถึง
ระยะ 8 cells จึงแยกกันเป็ นแต่ ละเซลล์
 ทั้ง 8 เซลล์ สามารถ develop เป็ น 8 organisms
 แสดงว่ าแต่ ละเซลล์ ของทั้ง 8 ถูกควบคุม (regulated)
ให้ มคี ุณสมบัติ Totipotent คือ ยังคงมี genetic materials
ครบทั้งหมด สามารถแยกให้ เจริญเป็ น 8 ตัวปกติได้
 Embryo เรี ยกว่ า Regulative embryo

16


นั่นคือ เซลล์ embryo รักษา genetic materials ไม่ ให้
สู ญเสี ย เป็ นเวลานานถึง 3 cell division cycles ซึ่งเป็ น
เวลานานกว่ า mosaic development
พัฒนาการแบบนี้ เรียกว่ า Regulative development
เช่น embryo ของ humans ทีเ่ กิดแฝดเหมือนได้ หลาย
คน (ถึง 8 คน)
17
ผ่ านระยะนีแ้ ล้ ว totipotency ไม่ แน่ นอน อาจ
 คง totipotent เช่ น stem cells/ precursor cells ของ
เซลล์ เม็ดเลือดในใขกระดูก
 สู ญเสี ย genetic potential ส่ วนมากไป เช่ น muscle cells
และ nerve cells
ในพืช adult cell เพียง 1 เชลล์ เป็ น totipotent
differentiated cells สามารถเจริญเป็ นพืชทั้งต้ นได้ ซึ่ งใช้
ประโยชน์ ในการทา tissue culture
18
โดยสรุป : animals & plants
 บางชนิดมี totipotent differentiated cells บางชนิดไม่ มี
 ดังนั้นการสู ญเสี ย genetic material ใน differentiation
ของเซลล์ จึงไม่ จาเป็ น และ
 ไม่ มห
ี ลักฐานการสู ญเสี ย genes ระหว่ าง
cell differentiation
 แต่ มห
ี ลักฐานแสดงว่ า cell differentiation มีสาเหตุจาก
Epigenetic changes ซึ่งเป็ นการเปลีย่ นใน
gene expression ไม่ ใช่ ทตี่ ัว genes โดยตรง
19
20
2. 1 Determinant
ก่ อนเซลล์ differentiate และ express specific function
เซลล์ ต้องผ่ านกระบวนการ Determination
 Determination เป็ นระยะที่เซลล์ ผ่าน point of no return
หรื อ irreversible commitment ใน Development
program หรื อ fate หรื อตัดสิ นชนิดของเซลล์
 พบว่ ามี สาร Effector substances ใน cytoplasm ในใข่
เป็ น Determinants

21

Gradient of
determinations
determinants อยู่ใน
egg และกระจายไม่
เท่ ากันกระจายจากมาก
ไปหาน้ อยเป็ นระดับ
(gradient) จาก บน -> ล่ าง
(animal pole -->
vegetal pole) และจาก
side --> side
22




Determinants อาจเป็ น Maternal messages
mRNA สั งเคราะห์ ขนึ้ จานวนมากแล้ วเก็บสะสมไว้
ระหว่ าง การเจริญของ egg (developing egg) หรื อ
Determinants อาจเป็ น Transcription factors ซึ่งจะไม่
พบใน egg
แต่ สังเคราะห์ โดย embryonic cells ของ embryo ใน
ระยะหลัง
23
2.2 Inducers
Substance ทีเ่ ซลล์ หนึ่งผลิตขึน้ ให้ ไปมีอทิ ธิพลต่ อ
การพัฒนาการของอีกเซลล ์หนึ่ ง
หรื อ เป็ น Signal จาก cell ถึง cell เช่ น
 เนื้อเยื่อ embryo 3 ชั้ น Mesoderm จะ induce
development ของ Ectoderm
 กล้ ามเนื้อ induce พัฒนาการของ ระบบประสาท

24
2.3 Morphogens
เป็ น subsets ของ determinant และ inducer
 Morphogen ตัดสิ นรู ปร่ าง (morphology) ของ embryo
ทีก่ าลังพัฒนา
 Morphogen สามารถชั กนาให้ เกิดการเปลีย
่ นรู ปร่ างใน
ต่ าง embryo ได้ ในการทา transplantation
 เช่ น ใน chick limb bud มี Retinoic acid กาหนดและชั ก
นาให้ พฒ
ั นา เป็ นนิว้ (digits)

25
พบว่ า Retinoic acid เป็ น morphogen ในพัฒนาการของ
หลายเนื้อเยื่อและหลายสิ่ งมีชีวติ รวมทั้งคน
 Retinoic acid ยังสามารถทางานร่ วมกับ hormones อื่น
ใน differentiation ได้ ด้วย

26
II. Control of Gene Expression
in
Differentiation
27
II. Control of Gene Expression in Differentiation
Differentiation เกิดโดยการ turn-on ของ genes
ทีเ่ ลือกแล้ ว
 เป็ น control ของ structural gene expression ระดับ

•Transcription,
•Posttranscription,
•Translation และ
•Posttranslation
28
Control ใน Prokaryote
มีการเปลีย่ นแปลงอย่ างมากใน gene expression และ
cellular activity
 เช่ น ใน bacteria เจริ ญจาก Sporulation
--> Vegetative
 พบการเปลีย
่ นที่ sigma (s) factor ของ RNA
polymerase และ เปลีย่ นตามเวลา

29
Control ใน Eukaryote
Expression ของ luxury genes
1. Hormone activation of genes
2. Hormone-responsive elements
3. Light-induction of plant genes
30
1. Hormone Activation on Genes
Hormone ทางานโดย turn on transcription ของ
specific genes ใน target cells ได้
1. โดยตรง โดย เข้ าไปจับกับ genes ใน nucleus
2. โดยอ้ อม โดยผ่ าน second messenger ที่ cell
membrane หรื อใน cytoplasm
 Hormone action เป็ น complex process ทั้ง 2 วิธี ต้ อง
มี receptor เฉพาะชนิด hormone

31
Steroid Hormone
Steroid hormone มีบทบาทสาคัญใน development และ
differentiation
 Steroid hormone ซึ มผ่ าน cell membrane เข้ า
cytoplasm เข้ า nucleus ไปจับกับ receptor ใน nucleus
 Hormone-receptor complex ไปจับ chromatin ไป
activate genes ทีเ่ กีย่ วข้ องให้ มี Transcription

32
Effect ของ
Steroid
Hormone
ต่ อ Gene
Expression
33
Activation ของ Estrogen ต่ อ Ovalbumin Gene
ใน chick oviduct
estrogen-receptor complex มี binding site ทีร่ ะหว่ าง
250-300 base pairs upstream จาก TATA box
 hormone-receptor complex ก็คือ transcription factor ที่
bind และ stimulate ทีต่ าแหน่ ง enhancer ของ gene

34
Hormone อีกหลาย family ที่มี receptor ใน nucleus
ซึ่งมีบทบาทสาคัญใน development
1) Glucocorticoid receptor : mediate gene โดย
hormone cortisol
2) Vitamin D3 receptor
3) Thyroid hormone receptor
4) Retinoic acid receptor
 Response ของเซลล์ ขึน
้ กับการมี receptor หรื อไม่
35
2. Hormone-Responsive Elements (HRE)



คือ Enhancer สาหรับจับกับ receptor ของ hormone หรื อ
กับ hormone-receptor complex
Enhancer ทีถ่ ูกจับแล้ วจึงไปช่ วย Promotor ของ gene
เพื่อให้ RNA polymerase ทา transcription บน gene ได้
พบมี HRE สาหรับ hormone และ receptor หลายชนิด
36
2.1 HRE สาหรับ Retinoic Acid Receptor
Retinoic acid responsive element (RARE)
เป็ น binding site บน DNA
สาหรับจับ
Retinoic acid receptor (RAR)
RAR โมเลกุลคล้ ายนิว้ มือ
เรียกว่ า Finger protein
ซึ่งมี 2 Zinc fingers
37
Retinoic acid receptor (RAR) = protein
 จับกับ Retinoic acid responsive element (RARE)
= DNA sequence ได้ RAR-RARE complex บน DNA
 แล้ ว Retinoic acid (R) จึงเข้ าจับกับ RAR-RARE
complex
 RAR-RARE complex จึงไป stimulate gene ทีอ
่ ยู่ใกล้
 RARE พบใน growth hormone gene ในต่ อม pituitary
ซึ่งผลิต growth hormone

38
Action ของ Retinoic Acid
RAR (receptor) + RARE (element)
RAR-RARE Complex
/----Promotor-----Gene-----/
/-------RAR-RARE-Promotor-----Gene-----/
Transcription
Retinoic Acid
RNA Polymerase
39
40
2.2 HRE สาหรับ Thyroid hormone receptor (THR)
RARE เป็ น enhancer ของ Thyroid hormone receptor
(THR) ด้ วย
 ทาให้ thyroid hormone ทางานร่ วมกับ retinoic acid ใน
การ ควบคุมการผลิต growth hormone
 โดย thyroid hormone receptor จับกับ RAR ได้ dimer
ไปจับ growth hormone RARE --> turn on growth
hormone gene --> growth hormone

41
2.3 RARE เป็ น Enhancer ของ Vitamin D3 Receptor
Vitamin D3 ทางานร่ วมกับ Retinoic acid
 โดยจับกับ VDR และ RAR ตามลาดับ ที่ RARE
 ร่ วมกัน turn on Osteocalcin gene --> product
เกีย่ วกับ differentiation ของ immature Osteoblasts
 Osteoblasts uptake calcium
 Osteoblasts differentiate เป็ น mature Osteocytes

42
สรุปได้ ว่า Cells ทั้งหมด
response ต่ อ hormoneไม่ เหมือนกัน เพราะ มี
hormone receptor มีความเฉพาะ specificity ต่ างกัน
 Hormones ส่ วนมากมี target เพียง 2-3 cell types
 กรณี Retinoic acid ใน vertebrate มี receptor 3 types
 เฉพาะ type RARa พบมีในเซลล์ เกือบทุกชนิด
 Retinoic acid จึงเป็ น Morphogen พืน
้ ฐาน
 Hormone receptor เองเป็ น protein ก็เป็ นผลของ
differentiation ด้ วยเช่ นกัน

43
3. Light-induction of plant genes
ต้ นกล้ า (Seedling) ของพืชเจริญในความมืด จะไม่ สร้ าง
photosynthetic apparatus ซึ่งคือ chlorophyll เพื่อ
ประหยัดพลังงาน
 เมื่อได้ รับแสง seedling จึงเปลีย
่ นเป็ นสี เขียว โดย enzyme
สร้ าง chlorophyll เป็ น light-activated enzyme ชื่ อ
Ribose biphosphate carboxylase หรื อ Rubisco

44
Rubisco Gene
ลักษณะของ Rubisco gene และ light-inducible genes
 Promoter :




ที่ -35 base pair region มี TATA box
Sequence จาก -35 ถึง -46 เป็ น light dependent และ
จากตาแหน่ ง -46 upstream จึงตอบสนองต่ อแสง
Enhancer :

Region จาก -327 ถึง -48 ช่ วย stimulate rubisco gene
ในการตอบสนองต่ อแสง
45
Promoter & enhancer ของ Light response gene
(a) Rubisco
gene จาก
pea cloned
ใส่ petunia
cells
(b) Rubisco
gene จาก
pea cloned
ใส่ tobacco
46
Control Expression ของ gene ใน cell differentiation ใน
plants และ animals
Regulatory region / 5’-flanking region แบบ
 cis-acting DNA คือ Control region อยู่บนสายเดียวกับ
structural gene เช่ น TATA box และ GC box
 trans-acting protein เช่ น transcription factor จับบน
DNA สายตรงข้ ามกับ template
47
III. Nature of Determination
48
Determination
คือ กระบวนการตัดสิ นที่ไม่ ย้อนกลับ เพื่อให้ cell
ดาเนินไปตาม developmental pathway
 เกีย
่ วข้ องกับการเปลีย่ นสภาวะทางกายภาพของ
Chromatin โดย factor ป้องกัน histones ไปจับที่
control regions ของ genes

49
วิธี Determination
1. DNase Hypersensitivity
 2. Control expression ของ 5S rRNA
 3. DNA methylation

50
1. DNase Hypersensitivity

DNA บริเวณระหว่ าง Nucleosomes (300 bp) บน
chromatin ไม่ มโี ปรตีน histones จะไวต่ อ DNas เรียกว่ า
DNase hypersensitive site
51
DNase hypersensitive region ก็คือ 5’- flanking region /
regulatory region (promoter & enhancer)
 ทาหน้ าที่ turn on/off gene โดยต้ องมี factor (protein)
ป้ องกันไม่ ให้ บริเวณ hypersensitivity นีใ้ ห้ กลายเป็ น
Nucleosome เช่ น




globin gene ในเม็ดแดงของกบ
Hypersensitivity region ที่ 60-260 upstreamป้องกันการ
สร้ าง nucleosome เมื่อ embryo อายุ 14 วัน
พบ Determination factor ให้ globin gene active เมื่ออายุ 14
วันเป็ นต้ นไป
52
2. Control ของ 5S rRNA gene expression
5S rRNA genes (กบ) มี 20,000 genes แบ่ งเป็ น
2 family
1. Oocyte 5S rRNA genes : 98 % , transcription เกิด
เฉพาะ ใน oocytes
2. Somatic 5S rRNA genes : 2 % , transcription เกิด
ใน somatic cells

53
Expression ของ rRNA genes 2 families

หลัง replication แต่ ละรอบของ cell division จะเกิดจากการ
แข่ งขันระหว่ าง


transcription factors RNA Pol III มี factors คือ TFIIIA,
TFIIIB, และ TFIIIC กับ
histones บน hypersensitivity region
 เช่ น ใน immature egg และ developing embryo ของกบ
54
ใน immuture egg:
 Oocyte 5S rRNA genes express แต่
somatic 5S rRNA genes ถูก repressed
ใน developing embryo: Embryo ~ 3,200 cells
 TFIIIA ลดจานวนลงเรื่ อยๆ จนเหลือ 1 โมเลกุล / oocyte
rRNA gene
 ทาให้ oocyte rRNA gene ถูก repressed โดย
histones และ somatic rRNA gene ชนะจะ express
55
3. DNA methylation
Active genes ปกติมี low methyl groups หรื อ ไม่ มี
 Methylation ของ DNA




ทาให้ repress gene และถ่ ายทอดได้ และ
เป็ น signal ให้ DNA สายใหม่ มี methylation ด้ วย
กฎ methylation ใน higher eukaryote ต้ องเกิดกับ C ที่
เป็ น 5’-CG-3’ dinucleotides
56
Determination โดย mehtylation
เพื่อ 1) Repress gene activity และ
2) permanent
 จัดเป็ น Epigenetic mechanism เพราะ methylation ไม่
ทาให้ เปลีย่ น genetic แต่
ทาให้ gene turn off เร็วระหว่ าง development เช่ น



X chromosome ใน female พบว่ าถูก methylated และ
หยุด develop เร็ว
Inactive X chromosome เรียกว่ าถูก Lyonized
ทาให้ เห็นรู ปร่ างเป็ น Barr body
57
Genes ต้ นเหตุ Determination
ใน แมลงหวี่ พบโดยการทา mutation:
พบ genes ทีท่ าให้ เกิด determination ชะตาของเซลล์ ชนิด
ต่ างๆ เรียกว่ า
Homoeotic genes หรื อ Homeotic genes
 โดยเมื่อทา mutation แล้ วทาให้ เกิดการเปลีย
่ นรู ปแบบ
(transformation) ของร่ างกายจากส่ วนหนึ่งไปเป็ นอีกส่ วน
หนึ่ง

58
เช่ น Antennapedia (Antp) mutant มีขาในตาแหน่ งของ
หนวด
 แสดงว่ า genes ของ cells ในตาแหน่ งหนวด ได้ ถูกเปลีย
่น
ให้ เหมือนขา หรื อ cells ปกติทคี่ วร develop เป็ นหนวดได้
ถูก programmed ให้ develop เป็ นขา




Transformation เกีย่ วข้ องกับ activity ของหลาย genes
แต่ พบมีเพียง gene เดียวเมื่อถูก mutated แล้ วเกิด
transformation
แสดงว่ า gene นีต้ ้ อง control genes อื่นๆ ให้ develop
หรื อเป็ น Homeotic gene
59

นั่นคือ Homeotic gene เป็ น Master gene ทีเ่ กีย่ วข้ องกับ
determination ชะตา (fate) ของเซลล์ ว่าจะพัฒนาเป็ น
เซลล์ ชนิดอะไร

ถ้ า mutate gene นีจ้ ะทาให้ determination เปลีย่ นไปสู่ วถิ ี /
programใหม่
Homeotic genes จึงมีบทบาทเป็ น ศูนย์ กลาง
development
 ในแมลงหวีศ
่ ึกษาพบ Homeotic gene แล้ ว 2 กลุ่ม คือ
 Antennapedia complex (ANT-C) และ
 Bithorax complex (BX-C)

60
Homeobox
Common DNA sequence ประมาณ 180 bp พบ
 ใน Homeotic genes เป็ น complex (cluster) genes และ
 ใน Non-homeotic genes ซึ่ งไม่ ได้ ทาให้ เกิด transform
ของ body part แต่ กม็ คี วามสาคัญเช่ นเดียวกับ homeotic
genes ในการ development ด้ านกายภาพและการ
จัดระบบของ embryo
61
ลักษณะของ Homeobox
75 % - 79 % conserved
 share และ control genes อื่นให้ develop อย่ างเป็ น
ขั้นตอน
 code ให้ protein ทีม
่ ี DNA-binding domain ทีเ่ ป็ น
positively charged มาก
 protein ซึ่ งเป็ น transcription factor จะ migrate กลับไป
ใน nucleus ไปจับ control region ของ genes ทีถ่ ูก
ควบคุม

62
Arrangement ของ homeobox genes
เหมือนกันทั้ง vertebrate และ invertebrate คือ
 เรี ยงตาม anterior-posterior body axis ที่ express โดย


genes ทีอ่ ยู่เริ่มต้ นของ cluster เป็ น genes ที่ express ไปทาง
หน้ า (anterior) และ
genes อยู่สุดท้ ายของ cluster ที่ express ไปทางด้ านหลัง
(posterior)
63
Maternal Effect Genes
Genes ที่ code ให้ products ใน egg แล้ ว ปริมาณ ของ
products กระจายจากมากไปหาน้ อย หรื อ ทาให้ egg มี
polarity
 products มี effect ต่ อ development ของ body parts
 bicoid (bcd) gene ~ การเกิด anterior body parts ส่ วน
heads & thoraxes
64
Segmentation genes
Control organization ของปล้ องของร่ างกาย segments
 ftz gene พบ segment เว้ น segment เป็ น pair-rule
genes แสดงออกใน embryo ระยะต้ น
 engrailed gene แบ่ ง embryo ออกเป็ น anterior &
posterior
65
Vertebrate homeoboxes
sequence ของ homeoboxes ของ แมลงหวีก่ บั ของ
vertebrate คล้ ายกันมากถึง 95%
 การจัดเรี ยงของ genes เป็ น cluster ในลาดับเดียวกับที่
express
 homeotic genes ทีอ
่ ยู่ตอนต้ นของ clusters express
ไปข้างหน้า และ
 homeotic genes ทีอ
่ ยู่ตอนปลายของ clusters express
ไปข้ างหลัง

66


homeobox gene ของ vertebrate active ช้ ากว่ าและ
active ทั้งก่ อนและหลัง differentiation
homeobox proteins ใน vertebrates เป็ นทั้ง
Transcription factor และ Regulator ใน development
ของ embryo

เช่ น Pit -1 protein
67
Pit -1 protein ใน mouse dwarf (dw) gene
 ควบคุม development ของ pituitary glands ซึ่ งผลิต
growth hormone, prolactin hormone และ
thyroid - stimulating hormone
แสดงว่ า Pit-1 มี multiple effects ต่ อ development
ของ pituitary gland
68
Developmental pathway
 House keeping genes & Luxury genes
 Mosaic development vs. Regulative development
 Totipotency vs. Epignetics
 Determinants, Inducers & Mophogens
 Differentiation control in Prokaryote vs. Eukaryote



Animal: Hormone-induced genes & Hormone responsive
element
Plant: Light-induced genes
DNA hypersensitivity, rRNA gene expression, and DNA
methylation
 Homeotic genes & Homeobox
 Maternal Effect genes
 Segmentation genes

69