Transcript microRNA
microRNA
מה בתוכניתנו היום:
2
נתאר בקצרה את אופן היווצרות ופעולת .miRNA
נציג דוגמא מעניינת לרגולציה על ידי .miR
נסקור את הגישות באיתור אתרי מטרה בעזרת אמצעים
חישוביים.
נתמקד באלגוריתם מסוים ובניסיון לבדוק בעזרתו את
ההשפעות של קו-רגולציה של .miRNA
נציג ניסוי המשווה את דפוס הביטוי התאי לאחר החדרת
.miRNA
אבל קודם כל סרט!
3
מה זה ?microRNA
4
רצפים אנדוגניים של כ~22-
נוקליאוטידים של מולקולת .RNA
הרצפים מאופיינים בשמירות
פילוגנטית.
עמדות 'גרעין' בד"כ בין
נוקלאוטידים 2-9בקצה ה 5'-של
ה miR-הכרחיות לפעילות ה.miR-
מאופיינים בקומפלימנטציה חלקית
לאתרי המטרה שלהם.
לרצפים קשת רחבה של תפקידים
רגולטוריים משמעותיים.
תופעות בהן נמצא ש microRNA-לוקח חלק:
שליטה בחלוקה התמיינות תאית ,מוות תאי ,ומטבוליזם
של שומן בזבובים.
קביעת דפוסי נוירונים בנמטודות.
שליטה בתהליכי התמיינות של שושלות של תאים
המטופואטים ביונקים.
שליטה בהתפתחות פרחים ועלים בצמחים.
הערכות שמרניות על בסיס גישות חישוביות מצביעות
שדוגמאות אלה מהוות חלק קטן ביותר מהסה"כ.
5
תהליך היווצרות :miRNA
6
אופן פעולת :mircoRNA
miRNAפועל ככל הנראה בשתי צורות עיקריות:
עיכוב תרגום.
חיתוך של mRNAודרגדציה.
7
+-- Metazoa
|
|
|
+-- Arthropoda
|
|
+-- Anopheles gambiae (38)
|
|
+-- Apis mellifera (25)
|
|
+-- Drosophila melanogaster (78)
|
|
+-- Drosophila pseudoobscura (73)
|
|
|
+-- Nematoda
|
|
+-- Caenorhabditis briggsae (79)
|
|
+-- Caenorhabditis elegans (114)
|
|
|
+-- Vertebrata
|
+-- Amphibia
|
|
+-- Xenopus laevis (7)
|
|
|
+-- Aves
|
|
+-- Gallus gallus (122)
|
|
|
+-- Mammalia
|
|
+-- Canis familiaris (6)
|
|
+-- Ovis aries (4)
|
|
|
|
|
+-- Primates
|
|
|
+-- Ateles geoffroyi (45)
|
|
|
+-- Gorilla gorilla (86)
|
|
|
+-- Homo sapiens (326)
|
|
|
+-- Lagothrix lagotricha (48)
|
|
|
+-- Lemur catta (16)
|
|
|
+-- Macaca mulatta (71)
|
|
|
+-- Macaca nemestrina (75)
|
|
|
+-- Pan paniscus (89)
|
|
|
+-- Pan troglodytes (83)
|
|
|
+-- Pongo pygmaeus (84)
|
|
|
+-- Saguinus labiatus (42)
|
|
|
|
|
+-- Rodentia
|
|
|
+-- Mus musculus (249)
|
|
|
+-- Rattus norvegicus (195)
|
|
|
|
|
+-- Sus scrofa (54)
|
|
|
+-- Pisces
|
+-- Danio rerio (369)
|
+-- Fugu rubripes (131)
|
+-- Tetraodon nigroviridis (131)
|
+-- Viridiplantae
|
+-- Arabidopsis thaliana (117)
|
+-- Glycine max (22)
|
+-- Medicago truncatula (16)
|
+-- Oryza sativa (178)
|
+-- Populus trichocarpa (213)
|
+-- Saccharum officinarum (16)
|
+-- Sorghum bicolor (72)
|
+-- Zea mays (97)
|
+-- Viruses
+-- Epstein Barr virus (5)
+-- Human cytomegalovirus (9)
+-- Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (12)
+-- Mouse gammaherpesvirus 68 (9)
miRNA registry-מאגר ה
,על מנת לרכז את הרצפים הידועים
אתרי המטרה שלהם ולהקל על מתן
- הוקם מאגר ה,שפה משותפת
.miRBase
במאגר2006 ממאי8.1 נכון לגירסה
. רשומות3963
8
:מאמר סקירה
בבעלי חייםmicroRNA תפקידי
Ambros Victor1. (2004) The function of animal
microRNAs Nature 431 350-355
1 Dartmouth
Medical School, Department of Genetics, New Hampshire.
ASEL/ASER
חלק ממערכת החישה של הנמטודה בנוי
מאסימטריה של צמד ניורונים
כימו-סנסוריים:
ASE left, ASE right
צמד הנוירונים מזהה תרכובות שונות
ובתאום מאפשר לתולעת להגיב
אפקטיבית לגירויים.
ספציפיות התנהגותית זו נגרמת כתוצאה מהבדלים בביטוי
הגנטי בסוגי התאים השונים – .ASER/ASEL
נמצא שההבדל העיקרי בין התאים הוא ביטוי של כימו-
רצפטורים שונים gcy-7 :ב ASEL-ו gcy-5ב.ASER-
10
על ידי שימוש בשיטת סימון בפלורסנציה נמצאו תולעים מוטנטיות
בהן חסרה האסימטריה הבילטראלית.
בעזרת מוטנטים אלו נמצאו מספר גנים המקודדים לפקטורי
שעתוק שונים .cog-1,lim-6,ceh-36
בנוסף נמצא רצף
מקודד נוסף שאינו
מקודד חלבון אלה
RNAהיוצר את צורת
ה hairpin-האופיינית
ל- miRNA-
.lsy-6
11
על ידי ניסוי של הסרה והוספת
מקטעים נמצא האזור של הרצף
ל.lsy-6-
מדוע הצורך בתהליך סבוך כזה?
לבסוף נמצא רצף שצפוי שיתקפל
למבנה .hairpin
מוטציה שפוגעת במבנה זה
מנטרלת את פעילות .lsy-6
מוטציה מפצה המחזירה את
המבנה מחזריה את רמת
הפעילות.
12
נמצא של lsy-6-רצף עם התאמה חלקית לרצף משלים באזור ה3'-
UTRשל .cog-1
רצף ה miR-גורם להפחתת הביטוי של פקטור שעתוק זה.
13
צפי ואישוש של אתרי מטרה:
החפיפה החלקית בין miRNAלבין מטרה שלו ברצף
mRNAמרמזת על הספקטרום הרחב של רצפים עליהם
יכול miRמסוים לבצע רגולציה ,ועל הפוטנציאל הרב
הטמון במנגנון זה כמנגנון רגולטורי.
אותה חפיפה חלקית מהווה כמובן מכשול עיקרי לשימוש
בכלים חישוביים לאיתור רצפי המטרה.
14
אפיון אתרי מטרה לרגולציית :miRNA
גישות המחקר הרווחות כיום מתבססות על ההנחה שניתן לאפיין את
המטרות ל miRNA-על פי הקריטריונים שנקבעו בחקר lin-4ו-
let-7ואתרי המטרה הבדוקים שלהם.
אפיון אתר מטרה להיקשרות :miR
.1מיקום אתר המשלים לרצף ה miR-בעיקר באזור ה.UTR 3'-
.2ריכוז של זיווג בסיסים ,עפ"י ווטסון-קריק ,רצוף בין ה miR-לאתר
המטרה באזור 'גרעין' ב 5'-של רצף ה.miR-
.3שמירות פילוגנטית של אתרי המטרה ברצפי ה UTR-של גנים
אורתולוגיים.
יש לציין שבסה"כ קיימת כמות ראיות נכבדה המאששת ניסויית את 3
ההנחות לעיל.
15
סקירת התוצאות של קב' שונות:
הקבוצה של Starkושות .דיווחה על 100אתרי המטרה
בעלי הניקוד הגבוה ביותר עבור כל אחד מ 73-רצפי ה-
miRהידועים בזבוב.
הקבוצה של Enrightושות .דיווחה על 10אתרי המטרה
המשמעותיים ביותר סטטיסטית עבור כל רצף miR
בזבוב.
בסה"כ נמצאה חפיפה של 15%בין דיווחי שתי הקבוצות.
16
קבוצה שלישית התמקדה בבדיקת גנים המקודדים
לחלבונים הידועים כקובעי דפוסי התפתחות עוברית בזבוב
מצאה 39אתרי מטרה אפשריים לרגולציה על ידי miRים.
מתוכם 20%נמצאו בניסוי של Starkאולם לא נמצא
אפילו אחד בניסוי של .Enright
17
הסיבות להבדלים:
למרות הגישות הדומות ביסודן לזיהוי אתרי מטרה ,התוצאות
המחקריות אינן מתלכדות היטב .ככל הנראה בעיקר
בשל ההבדלים הבאים:
.1הדרך להגדרת שמירות פילוגנטית.
.2הדרך הספציפית לאפיון אתרי קישור בהתבסס על
האתרים המוכרים.
.3כיצד משוקללים גורמים סטטיסטים ותרמודינאמיים
לדירוג וניקוד אתרי המטרה הצפויים.
18
מופעים כפולים של אתרי מטרה:
הקבוצה של Lewisהראתה שמספר מופעים שמורים רב
עבור רצף מטרה אפשרי ל miR-מסוים באזור הUTR-
הוא פרדיקטור טוב לכך שאותו גן אכן מבוקר ע"י ה.miR-
מאידך גם הגברת הרגישות של אלגוריתמי החיפוש עבור
אתרי קישור יחדניים חשובה .זאת מאחר וקיימות
דוגמאות לבקרה על ידי miRשאינה דורשת מספר רב של
אתרי קישור.
למשל עבור lin-4קיים רצף מטרה יחיד לגן lin-28הידוע
כרצף מטרה בדוק של miRזה.
19
דרכים לשיפור האלגוריתמים הקיימים:
קיים צורך לשלב באלגוריתמים לחיזוי אתרי קישור
פרמטרים שיכילו את המבנה המרחבי של אתרי ה3'-
.UTR
ניסוי מסוים שביצע שינויים בסביבת אתר הקישור הראה
שהייתה לכך השפעה על קישור רצף ה.miR-
יש לבדוק גם רצפי ' UTR 5על מנת לבחון את ההנחה
לגבי חשיבותם של רצפי ה.UTR 3'-
רצפי miRבצמחים מזהים לעיתים קרובות רצפי מטרה
באזורים מקודדים ולכן כדאי לבחון גם אזורים כאלה
בבע"ח.
20
מגבלות משמעותיות באלגוריתמים הקיימים:
ההתבססות על שמירות פילוגנטית רחבה באפיון רצפי
המטרה מצמצמת יכולת האלגוריתמים לזהות אתרי
מטרה.
לראייה:
לקבוצת הmiR-ים miR-290 – miR-295המבוטאת
ספציפית בתאי גזע עובריים בעכבר לא נמצאו עדין רצפים
אורתולוגיים שמורים באדם.
פיתוח אלגוריתמים החוזים אתרי מטרה ל miR-גם
במקרה וקיים אתר קישור בודד.
21
משמעות חוסר השימור הפילוגנטי:
נמצא שמספר מוגבל ביותר של מטרות עבור miRמסוים
בחולייתנים שמור כמטרה בגן האורתולוגי בחרקים.
ניתן להסיק מכך שבעוד שהשמירות הריצפית של miRים
היא גבוה יחסית גם במרחקים פילוגנטים גדולים הרי
שמסלולי ומטרות הרגולציה יכולים להיות שונים.
22
שאלות פתוחות:
מה הגורמים המשפיעים על נגישות ופעילות miRבUTR-
מסוים?
מה הם הגורמים הקובעים האם רצף מסוים יעבור חיתוך
ודגרגדציה או עיכוב תרגום?
באיזו מידה קיים שיתוף וקו-רגולציה בין miRים שונים על
אותם גני מטרה?
23
זיהוי אתרי מטרה קומבינטורית
Azra Krek1,2, Dominic Grun1, Matthew N Poy3 et al. (2005)
Combinatorial microRNA target predictions Nature
Genetics 37 495-500
1
Center for Comparative Functional Genomics, Department of Biology, New York University.
2 Department of Physics, New York University.
3 Laboratory of Metabolic Diseases, The Rockefeller University.
מטרות הניסוי העיקריות המוצגות במאמר:
להציג אלגוריתם למציאת אתרי מטרה עבור רצפי .miR
לעמוד את מידת ההצלחה של האלגוריתם.
25
לבחון היפותזה שמתבצעת קו-רגולציה של גנים על ידי
מספר miRשונים.
תאור האלגוריתם – PicTar
Probalistic Identification of Combinations of Target Sites
קלט:
קבוצת חיפוש – קבוצה של רצפי
miRשאת אתרי המטרה
שלהם נחפש.
מסגרת חיפוש – קבוצה של
רצפים אורתולגויים מיושרים
(.)multiple alignment
פלט:
דירוג של הגנים ממסגרת החיפוש
עפ"י ההסתברות שתת-קבוצה
מסוימת מקבוצת החיפוש
נקשרה לגן.
26
האלגוריתם – מציעת רצפי 'גרעין':
נגדיר:
רצף 'גרעין' עבור miRמוגדר כרצף בן 7נוק' המתחיל במקום
הראשון או השני מתחילת ה.)5'( miR-
רצף 'גרעין' לא מושלם הוא רצף בו אין התאמה
מושלמת לאתר המטרה .בנוסף אינו מגדיל את האנרגיה
החופשית בקשר 'גרעין' mRNA:ואינו מכיל קשרי .U:G
.1שימוש בתוכנה nuclMapעל מנת למצוא את כל רצפי
ה'גרעין' בכל שיירי ה UTR-במסגרת החיפוש.
.2בדיקה האם רצף גרעין עבור miRמסוים נופל במיקום תואם
עפ"י היישור עבור כל המינים בבדיקה.
רצפי מטרה באתרי ה UTR-שעברו את שני המבחנים לעיל
עוברים לשלב הבא.
27
האלגוריתם – מציעת רצפי עגינה:
בשלב זה נבדק ,בעזרת התוכנה ,RNAhybrid
שהאנרגיה החופשית של הרצף השלם
microRNA:mRNAהינה מתחת לערך סף
מסוים.
ערך הסף לרצפי 'גרעין' מושלמים נקבע ל33%-
מהאנרגיה החופשית האופטימאלית של רצף ה-
miRהמלא כשהוא קשור לרצף mRNAמשלים.
ערך הסף לרצפי 'גרעין' לא מושלמים נקבע ל66%-
מהאנרגיה החופשית האופטימלית.
28
האלגוריתם -מציעת רצפי עגינה:
רצפים שעוברים את מבחן אנרגית הסף נקראים
רצפי עגינה ולוקחים חלק באלגוריתם.
ניתן לסנן בשלב זה שיירי UTRשנתגלו בהם
פחות מ n-אתרי עגינה.
29
האלגוריתם – קביעת ציון :PicTar
האלגוריתם משתמש בHidden -
Markov Modelsובאלגוריתם
של Baum-Welchעל מנת
לחשב ציון הסתברות מריבית
שרצף RNAמסוים (')UTR 3
מהווה מטרה לקבוצה מסוימת
של miRים.
אינטואיטיבית – רצפי הmiR-
מתחרים בינם לבין עצמם לבין
הרקע על היקשרות לאתרי
העגינה ברצף ה.RNA-
30
האלגוריתם – שילוב התוצאות לציון:
אתר גרעין מושלם מקבל הסתברות pלהיות
אתר מטרה ( .)p 0.8אתר שאינו מושלם
מקבל הסתברות N .(1-p)/Nמספר אתרי
המטרה שאינם מושלמים (בד"כ .)2-20
הציון הסופי לרצף הוא logהיחס בין הרצף עם
ההסתברות המרבית כפי שנקבע ע"י השלב
הקודם לבין הסתברות הרקע.
כל שנשאר לעשות זה לסכום את ציוני ה-
PicTarעבור כל אחד מהשיירים
האורתולוגים לקבלת ציון סופי עבור כל גן
במסגרת החיפוש.
31
מאפייני האלגוריתם:
האלגוריתם מחזיר ציון סינרגיסטי עבור קבצת .miR
יש משמעות לחיפוש קבוצת miRים.
האלגוריתם מתייחס לחשיבות רצפי הגרעין ולחשיבות אנרגית
הקישור של הרצף הכולל.
אורך הרצף נלקח בחשבון –
רצף ארוך בעל nאתרי קישור יקבל ציון נמוך יותר מרצף קצר.
ניתן להשתמש בתוצאות ניסיוניות עתידיות לשיפור האלגוריתם.
לאלגוריתם זמן ריצה פולינומיאלי באורך הקלט –
32
מצוין זמן ריצה של כ 15-דק' (על מחשב PCסטנדרטי עם 2 GBזיכרון) כאשר מבצעים חיפוש עבור miR 1-6ים.
בדיקת הmiR-ים let-7 lin-4ב C.elegens-ו:C.briggasae-
33
על מנת לבחון את יעילות האלגוריתם הריצו אותו על 10,607רצפי
' UTR 3של צמד הנמטודות הקרובות פילוגנטית עבור מטרות קישור
ל lin4-ו.let7-
מטרות הקישור הידועות לmiR-ים
lin-28 ,daf-12 ,hbl-1 ,lin-14דורגו במקומות ראשון ,שני ,רביעי
ושביעי בהתאמה.
אתר הקישור lin-41אף הוא מטרה בדוקה ניסויית לmiR-ים לא
נמצא על ידי האלגוריתם.
התוצאות מראות שלאלגוריתם רגישות וספציפיות גבוה יחסית.
בדיקת האלגוריתם בחולייתנים:
34
לצורך בדיקת האלגוריתם בחולייתנים החוקרים יצרו
multiple alignmentsשל 20,254רצפי ' UTR 3בעלי
אנוטציה באדם לרצפים גנומיים ב 7-חולייתנים אחרים:
שימפנזה ,עכבר ,חולדה ,כלב ,תרנגולת pufferfish ,ו-
.zebrafish
ישור הרצפים של היונקים כיסה 92%מרצפי האדם.
כאשר נכללה גם התרנגולת .55%
כאשר נכללו כל 8החולייתנים .21%
הערכת :Signal-to-noise
לצורך הערכת כמות ה.false postives-
נבדק מספר אתרי המטרה שזוהו עבור 58רצפי miRים השמורים בין אדם עד
לתרנגולת ומספר אתרי מטרה שזוהו עבור קבוצה בגודל זהה עם רצפים
אקראיים מגודל מתאים.
היחס signal-to-noiseהוא היחס בין מספר האתרים שזוהו עבור קבוצת ה-
miRים לבין מספר האתרים שזוהו עבור הקבוצה האקראית.
התוצאות הובילו את החוקרים
להערכה שלכל miRכ~200-
רצפי מטרה.
35
– Signal-to-noiseהמשך:
36
כאשר נבדק אותו יחס signal-to-noiseעבור רצפים בהם
נמצאו nאתרי מטרה ברצף ה UTR-נמצא שהיחס
השתפר באופן משמעותי.
בבדיקה נוספת נבדקו מספר אתרי המטרה עבור 168
miRים עד כלב וmiR 116-ים עד לתרנגולת.
בגרף מוצגים מספר אתרי הקישור הממוצע ל miR-על מול
ציון סף.
מעל הגרף יחס ה Signal-to-noise -המתאים.
37
בבדיקה נוספת נבדקו צירופים של הmiR-ים
hsa-miR-141, hsa-miR-23a, hsa-miR-136באותו
אופן.
שוב ניתן להבחין בשיפור בתוצאות.
38
בדיקה ניסויית של אתרי קישור:
בבדיקה באמצעות western blottingו luciferase reporter-נבדק
מדגם של 13אתרי קישור צפויים עבור miR-375ו.miR-124 -
בבדיקה אוששו 7מ 13-האתרים על ידי אחת השיטות לפחות.
39
בדיקת הסתברות קומבינטורית:
40
על מנת לקבל הערכה גסה למספר הmiR-ים המבקרים
במשותף גן מטרה יחיד .החוקרים ספרו את מספר השלשות,
מתוך קבוצה של miR 58ים ,להן אתרי עגינה בתעתיק יחיד.
הגרף מציג את הסיכוי שעבור שלשה מסוימת ימצאו n
תעתיקים שונים המכילים אתרי עגינה לשלשה עבור רצפי ה-
miRועבור קבוצת רצפים אקראית.
בדיקת רגולציה של שלשות על הגן :Mtpn
41
על מנת לבחון מקרה ביולוגי של קו-רגולציה של miRים
בחרו החוקרים ב 3-הmiR-ים הנפוצים ביותר בתאי לבלב
בעכבר:
11.5% miR-124מסה"כ פרופיל הmiR-ים בתא.
6.5% miR-375
6.5% miR-7b
האלגוריתם הופעל על השלשה עם הדרישה שלפחות
רצף עגינה אחד יהיה שמור מאדם ועד כלב עבור כל אחד
מהmiRים.
התוצאות נבדקו עבור הימצאות של הגן Mtpnגן שידוע
בכך שהוא עובר רגולציה על ידי .miR-375
רגולציה על הגן - Mtpnתוצאות:
42
כשנבדקו ~18,500רצפי יישור ' UTR 3עבור אתר עגינה
ל miR-375 -הגן ל Mtpn-דורג במקום .102
בבדיקה עבור אתרי עגינה ל miR-124 -דורג Mtpn
במקום .727
שילוב בין miR-124ו miR-375 -הקפיץ את הדירוג ל.14-
לבסוף חיפוש עבור אתרי עגינה לכל השלשה מיקם את
Mtpnבמקום ה 4-מבין האתרים שאותם האלגוריתם
מחזיר כאתרים העוברים רגולציה על ידי הmiRים.
בדיקת פרדיקציות האלגוריתם:
43
תאי ניורובלסטומה מסוג N2Aהודבקו ברצפים של siRNA
ההומולוגיים ל miR-124-ול.miR-7b-
תוצאות ה western blot-המוצגות מראות כי לעומת רצפי הבקרה
הרצפים ההומולוגיים גרמו להפחתה המשמעותית ביותר בביטוי.
44
בבדיקה נוספת נבדקה פעילות :luciferase
לתאי N2Aהוחדרו הרכבה של ' UTR 3של Mtpnו ,Rr-luc-רצפי
si-let-7, si-124, si-375ו si-GFP -עם סוג נוסף של רפורטר
Pp-lucכבקרה פנימית.
התרשים מציג את היחס בין שני הרפורטרים מנורמל כנגד פעילות
.si-GFP
מסקנות וסיכום:
45
המאמר מציג למעשה גישה חישובית למציאת אתרי
מטרה עבור miRיחיד או קבוצת miRים המבצעים קו-
רגולציה של קבוצת גנים.
באמצעות שימוש ביישור רצפים ()multiple alignments
המנצל את זמינות הגנום של 8חולייתנים האלגוריתם
מצליח לנבא מעל רמות רעש כ ~200-רצפי מטרה לכל
.miR
השימוש באלגוריתם הביא לאישוש הניסויי של הגן
הראשון הידוע העובר קו-רגולציה על ידי שלושה miRים
שונים.
המראהMicroarray אנליזה של
הפחתת ביטוי של קבוצת גני מטרה
Lee P. Lim1, Nelson C. Lau2 et al. (2005) Microarray analysis
shows that some microRNAs downregulate large numbers of
target mRNAs Nature 433 769-773
1
Rosetta Inpharmatics (subsidiary of Merck and Co.), Seattle, Washington.
2 Whitehead Institute of Biomedical Research and Department of Biology,
MIT, Cambridge, Massachusetts.
מטרות הניסוי העיקריות המוצגות במאמר:
לבחון שינויים בדפוס הביטוי התאי כתוצאה מביטוי רצף .miR
בחינת מנגנון הרגולציה של רצפי ה.miR-
47
מודל הניסוי:
הניסוי התבצע בתאי - HeLa
זן תאים מסרטן צוואר הרחם מהחולה Henrietta Lacksשנפטרה
בשנת .1951
תאים בני אלמוות -לתאים ביטוי של האנזים טלומרז בשלב חלוקת
התא ולכן אין התקצרות טלומרים.
מקור התאים הסרטניים בהדבקה מווירוס הפפילומה .HPV18
לתאים מבנה גנומי שאינו זהה לגמרי לתאי אדם למשל לתאים 82
כרומוזומים ( 4עותקים של כרומוזום 3 ,12עותקים של כרומוזומים
)6,8,17
48
מהלך הניסוי :
בניסוי הודבקו תאי המודל בשני רצפי miRNA
המתבטאים בעיקר ברקמות מסוימות.
– miR-124רצף המתבטא בעיקר בתאי מוח.
– miR-1רצף המתבטא בעיקר בתאי שריר ולב.
מהתאים הופק mRNAוהוכן פרופיל של הביטוי
באמצעות .microarrays
49 RNA
Figure from: Babak, T.et al. (2004) Probing microRNAs with microarrays: Tissue specificity and functional inference
10: 1813-1819
תוצאות:
סינון תוצאות הביטוי לגנים שביטויים הופחת במידה משמעותית הניב
את התוצאות המרתקות הבאות:
– miR-124נמצאו 174גנים בעלי אנוטציה שהופחת ביטויים
בתאים.
– miR-1נמצאו 96גנים בעלי אנוטציה שהופחת ביטויים בתאים.
דפוסי הביטוי שהופחתו תאמו את הרקמות בהן נפוץ ה:miR-
– miR-124לדפוס הביטוי החדש דמיון לביטוי בתאי מוח.
– miR-1לדפוס הביטוי החדש דמיון לביטוי בתאי שריר ולב.
50
אופן ניתוח התוצאות:
השוואה בין רמות הביטוי בתאי הניסוי לבין רמות ביטוי
של 10,000גנים ב 46-רקמות אנושיות הביאה
לתוצאות הבאות:
גרף 174 – Aהגנים שרמות ביטויים הופחתו.
גרף – Bדרוג הרקע של רצפי mRNAבקורטקס.
בהיסטוגרמות:
ציר ה – X-חלוקה של הגנים לקבוצות עפ"י רמת
הביטוי בריקמה הספציפית( .עמודה ימנית גנים שבאים לידי
ביטוי הכי פחות בקורטקס לאומת רקמות אחרות).
בציר ה – Y-מספר הגנים בקבוצה עפ"י רמת הביטוי
היחסית.
51
miR-1
השוואה בין ערכי Pשל ביטוי קבוצת
הגנים שרמת ביטויים הופחתה בצורה
משמעותיות עבור הרקמות השונות.
ניתן להבחין שההפחתה בביטוי נמצאת
בהתאמה לרקמות בהן מתבטא ה-
.in vivo miR
52
miR-124
מה מנגנון הפעולה של ה?miRNA -
מה הקשר בין השינוי ברמות הביטוי ל?miR-
האם ה miR-גורם לשינוי בביטוי כתוצאה ממנגנון ישיר או מנגנון עקיף
כלשהו?
כיצד ניתן לבדוק זאת בכלים המוכרים לנו?
53
שימוש בכלי לחיפוש מוטיבים MEMEעל מנת לסרוק את רצפי ה UTR 3' -בקבוצת
התעתיקים שעברו הפחתה בביטוי הניב תוצאות.
נמצאו רצפים עבור שני הmiR-ים המשלימים לרצפי ה miR-בנוקלאוטידים .2-7
54
על מנת לבחון את חשיבות הקשר בין רצף הנוקלאוטידים ב 5'-לבין פעילות ה-
knockdownשל ה miR-בוצעו ניסוי בו הוחלפו הבסיסים במקומות 5-6ומקומות
.9-10
55
ניסוי נוסף שבוצע על מנת לעמוד על חשיבות הקשר .החדרת רצפים כימאריים
(מעורבים).
קל להבחין כי דפוס ה knockdown-תואם יותר לחלק הראשון ברצף ה.miR-
56
בדקית התוצאות באמצעות :luciferase reporter
כבדיקה נוספת לכך שהפחתת הביטוי קשורה לרצפי גרעין באזור ה UTR 3'-הוחדרו,
למערכת דיווח ,רצפי גזע-בר ורצפים מוטנטים באזור ה UTR 3'-של גנים שעברו
רגולציה.
( )aגנים שעברו הפחתה בנוכחות )b( miR-1גנים שעברו הפחתה בנוכחות
.miR-124
57
שמירות פילוגנטית של רצפי המטרה:
ממצא נוסף המחזק את ההשארה כי האינטראקציות שנמצאו בניסוי
הינן משמעותיות הוא שמירות פילוגנטית של רצפי הקישור שנמצאו.
למשל ב miR-124-עבור הרצפים באזורי ' UTR 3שלהם אנוטציה
עבור אדם ועכבר ל 44%-מרצפי " "UGCCUUבגנים בהם הופחת
הביטוי נמצא אתר תואם בעכבר ,לאומת 25%של קבוצת הרקע.
עבור miR-1נמצא באופן תואם עבור הרצף "40% "CAUUCC
לאומת .18%
58
מסקנות:
מהניסויים ניתן להסיק כי לmiRים תפקיד בהגדרה ואפיון סוג
התאים בבעלי חיים.
יתכן וחלק ממטרות ה miRNA-משועתקות ברמות נמוכות בתאים
בהן ה miR-מבוטא .יתכן וחלק ממטרות אלו זקוקות לרמות של
ריפרסיה שמנגנוני השעתוק הרגילים אינם יכולים להקנות.
יתכן ומנגנון ה miR-משמש כמנגנון ביטחון להפחתת הביטוי
המאפשר גמישות רבה יותר לשעתוק ברמה התאית והאבולוציונית.
כראייה:
עבור פאראלוגים מוכרים synaptogyrin 2 ,פאראלוג לא נוירוני
שביטויו מופחת כתוצאה מפעילות ,miR-124של הגן
synaptogyrin 1הספציפי לנוירונים שאינו מושפע מפעילות ה-
.miR
59
מסקנות -המשך:
הניסויים שתוארו מחזקים את התפיסה כי מטרות של miRים
בחולייתניים הינן מרובות ביותר.
ניתוח של תפוצת מונחי GOעבור הגנים שביטויים הופחת לא
הניבה תוצאות מה שמחזק את התפיסה שמטרות ה miR-מגוונות
ביותר.
60
מגבלות המודל:
אין להניח שכל miRהספציפי לרקמה מסוימת יציג דפוסי ביטוי
רקמתיים משמעותיים כמו הדוגמאות שהוצגו.
לראייה:
ניסוי שבוצע על רצפי miRהאופייניים לתאי גזע עובריים הניב
תוצאות בהן קבוצת גנים שעברה הפחתה בביטוי היתה עשירה
בחלקי ' UTR 3ברצף גרעין .אולם לא נמצא כל דפוס רקמתי
אופייני.
למרות שקבוצות המטרה של הmiRים בניסוי גדולות למדי סביר
להניח שעדין אינן מקיפות חלק גדול ממטרות הmiR-ים in vivo
זאת מאחר ויתכן שחלק מהמטרות אינן מבוטאות בתאי HeLaאו
שקנטיקת ההפחתה בשעתוק איטית מדי עבור זיהוי ב-
.microarray
61
לסיכום:
נושאים מעניינים בעתיד:
microRNAוסרטן – זיהוי וטיפול.
microRNAוטיפול במחלות וירליות ו.HIV-
microRNAכדרך לטיפול במחלות נוירו-דגנרטיביות.
63
מסקנות וסיכום:
חשיבות המנגנון הרגולטורי של miRNA
רב הנסתר על הגלוי
64
שינוי דפוס ביטוי בתא בהתאם לריקמה ושלב התפתחותי.
האם זהו המפתח להתמיינות תאים?
חסרה עדיין הבנה אמיתי של הדרך בה microRNAמבצע עיקוב תרגום או
דגרדציה .מה קובע איזה מסלול רגולטורי יבחר.
השיטות החישוביות הקימות למציאת אתרי מטרה עושות שימוש אינטנסיבי
בשמירות פילוגנטית לעיתים על פני מרחקים גדולים ,ברור שכתוצאה מכך
אנו מאבדים חלק מהתמונה.
:ביבליוגרפיה
Bartel P. David. (2004) MicroRNAs: Genomics,
Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell 116 281-297
Ambros Victor. (2004) The function of animal microRNAs
Nature 431 350-355
Azra Krek, Dominic Grun, Matthew N Poy et al. (2005)
Combinatorial microRNA target predictions Nature
Genetics 37 495-500
Lee P. Lim1, Nelson C. Lau2 et al. (2005) Microarray
analysis shows that some microRNAs downregulate
large numbers of target mRNAs Nature 433 769-773
Robert J. Johnston, Jr and Oliver Hobert (2003) A
microRNA controlling left/right neuronal asymmetry in
Caenorhabditis elegans Nature 426, 845-849
65
תודה על הקשבתכם.
עוד קצת על האלגוריתם:
67