Transcript 生物技術 Ch6.細胞融合技術及單株抗體 阮雪芬 Oct8&9, 2002

生物技術
Ch6.細胞融合技術及單株抗體
阮雪芬
Oct8&9, 2002
NTUT
http://www.ntut.edu.tw/~yukijuan/lectures/biotech/Oct8&9.ppt
哺乳動物細胞培養
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細胞株(Cell line)
初代培養(Primary culture)
培養液中必須包括四種不可或缺的成分
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必需胺基酸
維他命共九種
無機鹽緩衝液
醣類
哺乳動物細胞培養
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細胞培養的好處
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可以繼續不斷的培養增殖相同之細胞,不用時可以冷
凍收藏
冷凍保存法

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細胞調至0.5~5 x 10 6 cells/ml, in 20%~95% 胎牛
血清及5% DMSO
Room temp  零下液態氮
單株抗體
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由單一細胞株所製造出
來的抗體
多株抗體
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抗血清是多株抗體, 這些
抗體是由各種不同種B
細胞所產生抗體之混合
物
單株抗體的特株性質
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它只和抗原中的某種抗原決定位置結合,不會
與不同之抗原決定位置相結合,所以有很高的
專一性
它和抗原決定位置結合的強度及性質完全相同,
所以容易用它來純化抗原
單株抗體的製造方法
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正常細胞藉由轉型(transform)變成癌細胞;也就
是使正常細胞表現出致癌基因(oncogene)
如何使抗體分泌細胞變成癌細胞
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用致癌物質或病毒使此類細胞內表現致癌基因
細胞融合技術
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致癌細胞之致癌基因融合到抗體產分泌細胞中融合瘤細
胞(hybridoma)
融合瘤細胞(Hybridoma)之製造
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1975, Milstein and Kohler發表1984,或諾貝
爾生理醫學獎
老鼠的融合瘤細胞
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脾臟B細胞 + 骨髓瘤細胞
HGPRT酵素缺損株
融合瘤細胞(Hybridoma)之製造免疫
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用抗原刺激B細胞使其記憶分泌對抗原之抗體
分為
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生體內免疫(in vivo immunization)
生體外免疫(in vitro immunization)
融合瘤細胞(Hybridoma)之製造老鼠骨髓瘤細胞株(Myeloma cell line)
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HGPRT酵素缺損的骨髓瘤細胞株
300萬個
2 or 3 days
1000萬個
融合瘤細胞(Hybridoma)之製造用PEG作細胞融合
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PEG: polyethylene glycol
脾臟細胞 + 骨髓瘤細胞= 10:1~1:1
1
不含蛋白質的培養液洗三次
50%PEG之無血清培養
10%血清培養
融合瘤細胞(Hybridoma)之製造HAT培養液
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HAT:
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Hypoxanthine
Aminopterin
Thymidine
融合瘤細胞(Hybridoma)之製造HAT培養液
融合瘤細胞(Hybridoma)之製造HAT培養液
融合瘤細胞(Hybridoma)之製造HAT培養液
融合瘤細胞(Hybridoma)之製造融合瘤細胞之篩選
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免疫檢驗法
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酵素免疫檢驗法(ELISA)
放射線免疫檢驗法(RIA)
酵素免疫檢驗法(ELISA)
融合瘤細胞(Hybridoma)之製造融合瘤細胞之單株化
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限制稀釋法(limiting dilution method)
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細胞稀釋到5~10 cells/ml
0.1ml 放到96 well plate
1 cell/well
單株抗體的應用
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檢驗試劑的開發製造
醫學治療
生技產品之純化
農業及畜牧業
基礎研究
單株抗體的應用檢驗試劑的開發製造
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荷爾蒙
組織及細胞抗原
藥物監控
藥物濫用
微生物
抗體及過敏原
酵素
生長因子
單株抗體的應用醫學治療
器官移植
腫瘤影像
抗癌藥
生物技術
Ch7.基因轉殖動物
緒言
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基因轉殖鼠(transgenic mice)
基因治療(gene therapy)
基因轉殖的方法
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有三種
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胚原核基因顯微注射法(Microinjection)
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DNA 插入導致
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反轉錄病毒感染法(Retrovirus infection)
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缺點:
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染色體DNA的重新排列,缺損,複製,或移位
花時間去構築帶有轉殖基因的基因重組病毒
轉植基因不能太大
安全性亦有顧慮
胚胎幹細胞載體法(Stem cell insertion)
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胚胎幹細胞拿出來培養 + 外來DNA
送回胚胎中
基因在轉殖動物中的表現
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具有特異性
市由轉殖基因的轉錄啟動子(Promoter)來決定
表一
基因轉殖技術的應用
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基礎研究或醫學方面的應用
農業上的應用-基因轉殖家畜
應用基因轉殖技術的其他考慮因素
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開發基因轉殖家畜的成本昂貴
政府的法規管制
食品安全性問題
對環境的影響
結語
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複製羊