Transcript Document 7201536

Unique and redundant roles for
HOG MAPK pathway
components as revealed by
whole-genome expression
analysis –
O’Rourke and Herskowitz
(2003)
‫השמר נאלץ להתמודד עם השינויים‪ ,‬באמצעות‬
‫מנגנוני הגנה‪.‬‬
‫מנגנון התגובה לאוסמולריות חיצונית גבוהה‪:‬‬
‫חישת‬
‫אוסמולריות‬
‫גבוהה‬
‫שרשרת סיגנאלים‬
‫פירוק חומרי‬
‫תשמורת ליצירת‬
‫גליצרול בתא‬
‫שמירת‬
‫המים‬
‫בתוך התא‬
‫מסלול הסיגנאלים מכונה בקיצור מסלול ‪HOG‬‬
‫(‪)High Osmolarity Glycerol‬‬
‫שני סנסורים שונים לאוסמולריות גבוהה‪ Sln1 :‬ו ‪Sho1‬‬
‫למסלול ה ‪ HOG‬יש שני‬
‫ענפים ‪upstream‬‬
‫שמשתלבים‪.‬‬
‫‪MAP‬‬
‫‪KKK’s‬‬
‫‪MAP‬‬
‫‪KK‬‬
‫‪MAP K‬‬
‫כשמשופעל –‬
‫טרנסלוקציה לגרעין ושם‬
‫מזרחן פקטורי שעתוק‪.‬‬
‫מטרת המחקר של או'רורק והרשקוביץ‪:‬‬
‫הבנה טובה יותר של תפקידי הרכיבים השונים‬
‫במסלול ה ‪.HOG‬‬
‫דמיון והבדלים בתפקידי הרכיבים‪.‬‬
‫* המחקר מתייחס למנגנון התגובה לאוסמולריות‬
‫גבוהה בהיבט הגנטי – שעתוקי‪.‬‬
‫שלבי המחקר ‪:‬‬
‫א‪-‬‬
‫ב‪-‬‬
‫ג‪-‬‬
‫ד‪-‬‬
‫ה‪-‬‬
‫תגובה למומסים שונים‪.‬‬
‫גנים תלויי ‪ HOG1‬בתגובה לאוסמולריות גבוהה‪.‬‬
‫תפקידי רכיבים שונים במסלול ‪ HOG‬בתגובה‬
‫לאוסמולריות גבוהה‪.‬‬
‫הבדלים בתגובה לאוסמולריות מתונה‪.‬‬
‫שרידות ושגשוג של תרביות התאים מהם נמדד‬
‫הרנ"א‪.‬‬
‫א‪ .‬מומסים‪.‬‬
‫בתאי שמר ‪,wild type‬‬
‫שני ניסויים מקבילים‪ 1M :‬סורביטול‪.0.5M KCl ,‬‬
‫בכל ניסויי ‪ 10‬נק' זמן בחשיפה של ‪ 180‬דקות‪.‬‬
‫בכל נק' זמן – "מדידה"‪.‬‬
‫תוצאות שני הניסויים מאד‬
‫דומות‪.‬‬
‫‪ 2277‬גנים נמצאו‬
‫"מבוקרי אוסמולריות"‪.‬‬
‫גנים עבורם היה הבדל‪.‬‬
‫בתגובה ל ‪ KCl‬ביטויים הוגבר‪,‬‬
‫ובתגובה לסורביטול ביטויים‬
‫נשאר רגיל‪.‬‬
‫מספר הגנים המבוקרים‪:‬‬
‫השמר הגיב מהר יותר ל ‪.KCl‬‬
‫יותר גנים נמצאו‬
‫מבוקרי‪KCl-‬‬
‫מאשר מבוקרי‪-‬סורביטול‪.‬‬
‫שחור – מס' גנים שבוקרו ע"י ‪.0.5M KCl‬‬
‫לבן – מס' גנים שבוקרו ע"י ‪ 1M‬סורביטול‪.‬‬
‫עצמת השינוי בביטוי ‪:‬‬
‫גנים הוגברו או‬
‫הושתקו בעצמה‬
‫גבוהה יותר‬
‫בתגובה ל ‪KCl‬‬
‫לעומת סורביטול‪.‬‬
‫שחור – עצמת התגובה הממוצעת ל ‪.0.5M KCl‬‬
‫לבן – עצמת התגובה הממוצעת ל ‪ 1M‬סורביטול‪.‬‬
‫בגלל התגובה המהירה‪ ,‬הרבה והחזקה יותר ל‬
‫‪ KCl‬החליט הצוות להמשיך ולערוך את הניסויים‬
‫הבאים עם ‪.KCl‬‬
‫ב‪ .‬גנים תלויי ‪.HOG1‬‬
‫השוואה בין התנהלות ‪ wild type‬לבין ‪hog1Δ‬‬
‫בתגובה לאוסמולריות גבוהה‪.‬‬
‫לכל גן המגיב לאוסמולריות גבוהה חושב‬
‫יחס השפעת‪-‬המוטנט (‪ :)ME‬רמת ביטוי הגן‬
‫במוטנט חלקי רמת ביטוי הגן ב ‪.wt‬‬
‫‪1‬‬
‫גנים‪ ,‬עבורם יחס ה ‪ ME‬היה גדול מ ‪ 3‬או קטן מ ‪,‬‬
‫‪3‬‬
‫הוגדרו תלויי‪.HOG1-‬‬
‫נמצאו ‪ 579‬גנים תלויי‪HOG1 -‬‬
‫ובאנליזת הצברה אובחנו ‪6‬‬
‫תבניות ביטוי כלליות שונות‪.‬‬
‫הבזאלי‬
‫לביטוי‬
‫‪HOG1‬‬
‫שזקוקים ל‬
‫בתגובה‬
‫זמנית‬
‫השתקה‬
‫עוברים‬
‫גנים שב ‪wt‬‬
‫‪ ::2‬גנים‬
‫צבר ‪6‬‬
‫צבר‬
‫גבוהה‪.‬‬
‫באוסמולריות‬
‫קטנה‬
‫ובחלקם גם‬
‫באופן‬
‫שהוגברואך‬
‫לאוסמולריותבצבר ‪4‬‬
‫כמו‬
‫השתקה‬
‫במוטנט‬
‫אך‬
‫להגברה‪,,‬‬
‫גבוהה‬
‫יותר‪wt.‬‬
‫עובריםב‬
‫קיצוניאך‬
‫הגזעים‪,‬‬
‫בשני‬
‫גנים‬
‫‪::5‬‬
‫צבר ‪4‬‬
‫צבר‬
‫לעקות‬
‫בתגובה‬
‫שמוגברים‬
‫גנים רבים‬
‫ובצבר‪4 .‬‬
‫כאן‬
‫מתמשכת‬
‫יותר‪.‬‬
‫ממושכת‬
‫היתה‬
‫ההגברה‬
‫פוספטאז‪.‬‬
‫ובמוטנט‪-3‬‬
‫זמניתלגליצרול‪-‬‬
‫מוכרים‬
‫גנים‬
‫ביניהם‬
‫נוספות ומשויכים לקבוצת גנים כלליים ל ‪stress‬‬
‫שממחקרים‪.‬‬
‫אופיינית" במוטנט‬
‫בצורה לא‪-‬‬
‫שהוגברו "‬
‫‪1‬‬
‫(צבר‬
‫ריבוזומאליות‪,‬‬
‫יחידות‬
‫גנים לתת‬
‫ביניהם‪.):‬גנים‬
‫‪ESR‬‬
‫לעקות ב‬
‫בתגובותשהיתה‬
‫רפרסיהההגברה‬
‫חסרו את‬
‫שבמוטנט‬
‫קודמים גנים‬
‫צבר ‪:3‬‬
‫התגלה‬
‫בתגובה לפרומון‬
‫שעוברים ידוע‬
‫בעלי תפקיד‬
‫גנים ו ‪.6‬‬
‫ביניהם ‪5 ,4‬‬
‫צברים‬
‫בתגובה לאוסמולריות גבוהה‪.‬‬
‫‪wt‬‬
‫‪.‬‬
‫שונות‬
‫‪. filamentous growth‬‬
‫ההזדווגות או ב‬
‫בביטוי ב ‪.wt‬‬
‫שינוי זמני‬
‫שינוי ממושך במוטנט‪.‬‬
‫ל ‪ HOG1‬יש תפקיד בחזרה לשגרה‪.‬‬
‫מפני שעיקר הרגולציה לאוסמולריות גבוהה ב ‪wt‬‬
‫התרחשה ב ‪ 40‬הדקות הראשונות‪ ,‬החליט הצוות‬
‫לערוך את הניסויים הבאים רק במשך ‪ 40‬דקות‬
‫ולמדוד בזמנים ‪ 30 ,20 ,10 ,0‬ו ‪ 40‬דקות‪.‬‬
‫ג‪ .‬רכיבים שונים במסלול ה ‪.HOG‬‬
‫השוואה בין גזעים שונים‪:‬‬
‫גזע הבר ומוטנטים שונים‪.‬‬
‫דמיון והבדלים בתבניות‬
‫הביטוי הגנומיות בתגובה‬
‫לאוסמולריות גבוהה‬
‫(‪.)0.5M KCl‬‬
‫תוצאה‪:‬‬
‫תבניות הביטוי של המוטנטים ‪ hog1Δ‬ו‬
‫‪ pbs2Δ‬כמעט זהות‪.‬‬
‫מסקנה‪:‬‬
‫תפקידו היחיד של החלבון ‪Pbs2‬‬
‫הוא לשפעל את ‪.HOG1‬‬
‫מוטנט ה (‪ )ste11Δ+ssk1Δ‬חוסם את שני‬
‫הנתיבים הידועים לשפעול ‪( Pbs2‬ו ‪.)HOG1‬‬
‫תוצאה‪ :‬הבדלים בין המוטנט הכפול ובין‬
‫‪ pbs2Δ‬ו ‪.hog1Δ‬‬
‫שתלוייה ב‬
‫הגברה‬
‫זמנית‪.‬‬
‫השתקה‬
‫סיום‬
‫‪ Pbs2‬וב ‪.HOG1‬‬
‫מסקנה‪ :‬ישנם עוד קלטים לשפעול ‪,Pbs2‬‬
‫מלבד ‪ Ste11‬ו ‪.Ssk1‬‬
‫האם הסנסור ‪ Sho1‬הוא היחיד הגורם לשפעול‬
‫‪ Ste11‬באוסמולריות גבוהה?‬
‫נבדקו שני מוטנטים כפולים‪:‬‬
‫‪( ste11Δ+ssk1Δ‬אדום) ו ‪( sho1Δ+ssk1Δ‬כחול)‪.‬‬
‫תוצאה‪ :‬בגזע עם‬
‫המוטציה ל ‪( Sho1‬כחול)‬
‫השפעה פחות חמורה‪.‬‬
‫מסקנה‪ :‬קיים סנסור‬
‫נוסף שגורם לשפעול‬
‫‪ Ste11‬בתגובה‬
‫לאוסמולריות גבוהה‪.‬‬
‫האם יש כפילות בתפקיד שני הענפים‬
‫‪ ,upstream‬בתגובה לאוסמולריות גבוהה?‬
‫הושוו גזעים מוטנטים‪ ssk1Δ ,ste11Δ :‬ו‬
‫‪.sho1Δ‬‬
‫תוצאות‪ :‬הביטוי היה דומה לביטוי ב ‪.wt‬‬
‫מסקנה‪:‬‬
‫בתגובה לאוסמולריות גבוהה‪ ,‬יש כפילות‬
‫בתפקיד של שני הענפים‪.‬‬
‫ד‪ .‬האם יש כפילות גם עבור ריכוזים נמוכים יותר ?‬
‫כדי לבדוק זאת הושוו גזע הבר וגזעים מוטנטים‬
‫בתגובה לריכוזים נמוכים יותר ‪:‬‬
‫‪ 0.0625M KCl‬ו ‪.0.125M KCl‬‬
‫מסקנה‪ :‬בריכוזים מתונים של ‪ KCl‬ענף אחד פעיל‪,‬‬
‫בעוד שהענף השני לא פעיל‪.‬‬
‫ריכוז גבוה‪.‬‬
‫ריכוזים נמוכים‪.‬‬
‫כפילות‪ .‬אפשר להסתדר‬
‫ללא כל אחד מהענפים‪.‬‬
‫אפשר להסתדר ללא ‪,Ste11‬‬
‫אבל לא ללא ‪.Ssk1‬‬
‫ז"א אין כפילות פונקציונלית בריכוזים מתונים‪.‬‬
‫ה‪ .‬תרבית התאים‪.‬‬
‫פרופילי הביטוי הגנומי הנ"ל מציגים את‬
‫רמת השעתוק בתא‪.‬‬
‫כיצד מגיבים התאים בכלל (מעבר לרמת הרנ"א) ?‬
‫בדקו את שגשוג תרביות הגזעים הנבדקים‪.‬‬
‫נמצא שב‬
‫‪,0.5M KCl‬‬
‫תרבית המוטנט‬
‫הכפול ל ‪Ste11‬‬
‫ול ‪ Ssk1‬לא‬
‫שרדה‪ ,‬אך כן‬
‫שרדה ב‬
‫‪. 0.123M KCl‬‬
‫סיכום הממצאים‪ ,‬מסקנות והשערות‪:‬‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫תגובה מהירה וזמנית‪.‬‬
‫זמן חשיפה מספיק ‪ 40 -‬דקות‪.‬‬
‫ל ‪ HOG1‬תפקיד בבקרת עוצמת הגנים‪ ,‬ובחזרה‬
‫לשגרה‪.‬‬
‫שני הענפים ‪ - upstream‬כפילות באוסמולריות‬
‫גבוהה‪ ,‬אבל באוסמולריות מתונה רק אחד מהם‬
‫עובד‪.‬‬
‫• המערכת האמיתית מורכבת יותר ממה שהיה ידוע‬
‫קודם‪.‬‬
‫?‬
‫?‬
‫• פער בין תוצאות פרופילי הביטוי הגנומיות לבין‬
‫תוצאות התרבית ‪.in vivo‬‬
‫למוטנטים החסרים את ‪ Ssk1‬יש ליקויים חמורים‬
‫בהגברת גנים בריכוזים הנמוכים יותר‪ ,‬ובכל זאת‬
‫התרביות של שני המוטנטים הללו שרדו ב‬
‫‪.0.125M KCl‬‬
‫לסיכום השיטה ושני המאמרים‬
‫בעיות בשיטה ‪:‬‬
‫• בדיקת ביטוי גנים רק ברמת הרנ"א‪.‬‬
‫במאמר של או'רורק והרשקוביץ אכן נראתה סתירה בין‬
‫ממצאי שעתוק הגנים לבין התפתחות התאים בתרבית‪.‬‬
‫• ייצוג הגנים ע"י וקטור של תבניות ביטוי הוא הפשטה‪.‬‬
‫בשני המחקרים התחשבו בכך והשתדלו שהוקטור לכל גן‬
‫יהווה מדגם מייצג‪/‬מאפיין ‪:‬‬
‫ הצוות של גאש בחן מגוון רחב של תנאים ונתן משקלים‬‫מושכלים לכל המדידות‪.‬‬
‫ הצוות של או'רורק והרשקוביץ בדק את מסגרת הזמן ונק'‬‫הזמן המייצגות‪ ,‬שיהוו תיאור טוב עבור תגובת התא‪.‬‬
:‫מקורות‬
• Eisen MB et al. (1998) Cluster analysis and display of
genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U
S A. 95(25):14863-14868.
• O'Rourke SM, Herskowitz I. (2004) Unique and
redundant roles for HOG MAPK pathway components as
revealed by whole-genome expression analysis. Mol Biol
Cell. 15(2):532-42.
• Gasch AP et al. (2000) Genomic expression programs in
the response of yeast cells to environmental changes.
Mol Biol Cell. 11(12):4241-4257.