Transcript A synthetic approach to study function and - ETH E

DISS. ETH NO. 22994
A synthetic approach to study function and expression of
the Saccharomyces cerevisiae RNA helicase Ded1.
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
DIANA SILVIA MARINA OTTOZ
Laurea Specialistica in Biologia Molecolare
Università degli Studi di Padova
born on 12.09.1985
citizen of the Italian Republic
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Joerg Stelling
Prof. Dr. Yves Barral
Prof. Dr. John McCarthy
2015
Abstract
The scanning model describes eukaryotic translation initiation. The small ribosomal subunit
recognizes and binds the messenger RNA at its 5'-end and migrates toward the 3'-end of the
molecule. While moving, the ribosomal subunit scans the nucleotide sequence to locate the
start codon. Once the start codon has been identified, the large subunit joins to assemble a
complete ribosome competent for polypeptidic chain synthesis. The small ribosomal subunit
is assisted by factors in all steps of translation initiation. Among these are the RNA helicases,
that use ATP to unwind RNA secondary structures. RNA helicases promote loading and
scanning by clearing the secondary structures that impede the movement of the small subunit
along the RNA. In Saccharomyces cerevisiae two essential RNA helicases, eIF4A and Ded1,
perform di↵erent tasks in translation initiation. While eIF4A is mainly involved in the loading
step, Ded1 has been implicated in scanning. Ded1 is needed to scan long and structured
messenger leaders. Two main aspects of its action remain unclear in vivo. One aspect concerns
stability, shape, and position of the RNA secondary structures Ded1 can unwind. The other
aspect concerns the functional relationship with the other translation initiation factors; few
it is known about Ded1 recruitment on messengers and its physical interactions with other
initiation factors. This thesis describes the implementation of a synthetic heterologous system
to control gene expression and its application to study the function and the regulation of the
expression of Ded1.
The alteration of the expression levels of a gene of interest is a traditional approach of
molecular biology to study the corresponding protein. Under- or overexpression may cause
informative phenotypes to characterize the function and the action of the protein under study.
Expression levels can be altered by putting the gene of interest under the control of a transcription factor controlled by an external input. This thesis describes the implementation
of LexA-ER-AD, a transcription activator whose activity is modulated by the hormone estradiol. The design of LexA-ER-AD ensured essential features for its application to a wide
range of experimental set-ups. Tight and precise regulation were two binding requirements
for such a system. The expression levels caused by the activity of LexA-ER-AD could be
adjusted with the concentration of the inducer and with the number of binding sites placed in
front of the gene under study. The choice of the activation domain proved to be important for
the activity range and to avoid toxic e↵ects upon induction. The heterologous DNA-binding
domain ensured the possibility to use LexA-ER-AD in di↵erent growth conditions.
The next results show the application of the LexA-ER-AD system to study Ded1. The transcription factor was used for an assay to mechanistically characterize the action of Ded1 during
scanning. LexA-ER-AD was used to control the expression of DED1. The key point of this
assay was that the e↵ects of the alteration of Ded1 concentration within the cell were tested
directly on the translation levels of reporter messenger RNAs containing selected structural
features. These messengers were constitutively transcribed in the cells to easily visualize any
change in the abundance of the corresponding encoded protein upon Ded1 perturbation. An
increase of Ded1 abundance caused an increased protein expression depending on the length
and on the amount of secondary structures contained in the leader preceding the start codon.
The last results of this thesis concern the regulation of DED1 expression. The heterozygous
strain for the loss-of-function ded1 allele expresses more than half of the Ded1 levels, compared to the wild-type strain. This suggests a compensatory process for DED1 gene dosage.
iii
Abstract
The strategy followed to study this compensatory process consisted in introducing in a haploid
strain an extra DED1 copy under the control of the LexA-ER-AD system. The accumulation
of Ded1 upon induction caused a specific decrease of the expression levels of the DED1 locus.
This decrease depended on the termination region of the endogenous gene. This regulatory
region was necessary and sufficient to cause a decrease of the abundance of the corresponding
messenger RNA.
iv
Sommario
L'inizio della traduzione eucariotica avviene mediante il cosiddetto processo di scansione. La
subunità minore del ribosoma riconosce l'RNA messaggero all'estremità 5', a cui si lega e
da cui migra in direzione 3'. Durante questa migrazione, la subunità ribosomale scansiona
la sequenza nucleotidica per individuare il codone di inizio della traduzione. In seguito al
riconoscimento del codone di inizio, la subunità maggiore del ribosoma si associa a quella
minore per formare un ribosoma competente per l’allugamento. Durante tutte le fasi di inizio
della traduzione, la subunità minore è assistita dai fattori di inizio. Tra questi, le RNA
elicasi usano l'ATP per risolvere le strutture secondarie dell'RNA che altrimenti impediscono
il caricamento della subunità minore stessa e la scansione della sequenza nucleotidica. Nel
lievito Saccharomyces cerevisiae due RNA elicasi essenziali, eIF4A e Ded1, ricoprono diversi
ruoli durante l'inizio della traduzione. eIF4A assiste il caricamento della subunità minore
sul messaggero, mentre Ded1 è coinvolta nella scansione. Ded1 è necessaria per la scansione
di messaggeri lunghi e strutturati. Ci sono due aspetti dell'attività di Ded1 che non sono
stati ancora chiariti in vivo. Il primo riguarda gli aspetti delle strutture secondarie dell'RNA
che Ded1 è in grado di risolvere, come stabiltà, forma e posizione lungo il messaggero. Il
secondo aspetto riguarda le relazioni funzionali con gli altri fattori di inizio della traduzione che
potrebbero rivelare quando e come Ded1 è caricata sul messaggero. In questa tesi si descrivono
l'implementazione di un sistema per controllare l’espressione genica e la sua applicazione per
la caratterizzazione della funzione e della regolazione dell'espressione di Ded1.
Il controllo dei livelli dell'espressione genica è un approccio tipico della biologia molecolare per caratterizzare la proteina d'interesse. L'alterazione dei livelli di espressione sotto
o sopra i livelli selvatici spesso determina fenotipi informativi sulla funzione della proteina
studiata. I livelli di espressione di un gene possono essere regolati attraverso un fattore di
trascrizione la cui attività è controllata da uno stimolo esterno. In questa tesi si descrive la
costruzione del fattore di trascrizione LexA-ER-AD, la cui attività è controllata dall'ormone
-estradiolo. La possibilità di una regolazione stringente e precisa permette l'uso di questo
fattore di trascrizione in una vasta gamma di condizioni sperimentali. I livelli di espressione indotti da LexA-ER-AD posso essere regolati attraverso il controllo della concentrazione
dell'ormone nel mezzo di coltura o scegliendo il numero appropriato di siti di legame nel promotore bersaglio. La scelta del dominio di attivazione si è rivelata importante sia per la forza
del fattore sia per evitare e↵etti tossici. Infine, l'uso di un dominio eterologo di legame del
DNA garantisce la possibilità di utilizzare questo fattore di trascrizione in diverse condizioni
di crescita.
I risultati seguenti descrivono la caratterizzazione di Ded1 attraverso l'utilizzo di LexA-ERAD. Il fattore di trascrizione è stato utilizzato per sviluppare un saggio per caratterizzare i
dettagli molecolari dell'azione di Ded1 durante la scansione dell'RNA messaggero. Gli e↵etti
dell'alterazione dei livelli di espressione di DED1 per opera di LexA-ER-AD sono stati valutati
direttamente sui livelli della traduzione di messaggeri reporter contenenti specifiche strutture
secondarie. Questi messaggeri sono espressi costitutivamente per poter visualizzare facilmente
tali cambiamenti. L'aumento della concentrazione di Ded1 causa un aumento dei livelli di
espressione dei reporter in base alla lunghezza e alla quantità di strutture secondarie contenute
nelle sequenze a monte del loro codone di inizio.
Infine si descrivono i risultati ottenuti sulla regolazione dell'espressione di DED1. Un ceppo
v
Sommario
diploide eterozigote per la delezione ded1 esprime Ded1 a livelli maggiori di quelli attesi,
rivelando un meccanismo di compensazione di dosaggio genico. Per studiare questo fenomeno
è stata introdotta in un ceppo aploide una copia aggiuntiva del gene DED1 sotto il controllo
di LexA-ER-AD. L'accumulazione di Ded1 in seguito all'induzione del fattore di trascrizione
causa un calo specifico dei livelli di espressione del locus di DED1. Questo e↵etto dipende dal
terminatore di questo gene, che si è rivelato essere necessario e sufficiente per indurre un calo
dei livelli dell'RNA messaggero trascritto.
vi