Transcript Manuale strumenti AB 7900 HT e 7500 fast

 MANUALE
NLM 7093
VER 14/05/2014
DX001
ABI PRISM 7900HT
ABI 7500 FAST
MANUALE D’USO
NUCLEAR LASER MEDICINE S.r.l.
UFFICI OPERATIVI: Viale delle Industrie, 3 – 20090 SETTALA MI (Italy)
Tel (+39) 02/95. 24. 51 - Fax (+39) 02/95. 24. 52. 37
SITO INTERNET: www.nlm.it – E-MAIL: [email protected]
ABI PRISM 7900 PROTOCOLLO PER CHIMICA FRET


Accendere il PC e lo strumento ABI Prism 7900; aprire il software dedicato.
Aprire File, quindi New. Si apre una finestra; alla voce Assay selezionare Standard Curve (AQ),
alla voce Container selezionare 96 Wells Clear Plate e alla voce Template selezionare Blank
Template. Dare OK.
A. IMPOSTAZIONI DELLA PIASTRA

Nella parte destra della pagina (in modalità setup in alto) selezionare alla voce passive reference:
None. Selezionare Add Detector; nella sottopagina che si apre selezionare New e aggiungere il
fluoroforo ROX alle voci Name e Reporter e lasciare NON FLUORESCENT alla voce Quencher.
Dare OK. Selezionarlo e cliccare Copy To Plate Document e Done; si torna così alla pagina
iniziale. Selezionare le posizioni utilizzate per la seduta nella piastra (alla sinistra della pagina) e
associare il fluoroforo, spuntando con una X alla voce USE. Se non si utilizza tutta la piastra per la
seduta, selezionare i pozzetti che non vengono utilizzati ed escluderli dall’analisi attivando la
casella OMIT WELLS (controllare che solo i pozzetti che si vogliono escludere dall’analisi siano
barrati da una croce rossa. Questa operazione velocizza la seduta in quanto accorcia i tempi di
lettura della fluorescenza; solo i pozzetti che interessano vengono letti e non tutta la piastra).

Selezionare quindi ogni pozzetto nella piastra associato all’analisi e assegnargli un nome alla voce
Sample Name. Indicare anche alla voce Task il tipo di campione che si analizza in quella
determinata posizione: es. per un controllo negativo come l’acqua selezionare NTC, per i
campioni lasciare Unknown.
B. PROFILO TERMICO




Selezionare Instrument (in alto nella parte destra).
Compaiono tre pagine: Thermal Cycler, Real Time e Queue.
Selezionare Thermal Cycler, quindi nel campo Mode scegliere Standard e inserire 25l come
Sample volume.
Alla voce Thermal profile impostare il profilo termico come segue:
Pagina 2 di 18








Alla voce Auto Increment lasciare 0, alla voce Rampe Rate lasciare 100% per tutti i passaggi di
amplificazione, mentre per la melting impostare 5% nella casella vicino agli 80°C finali. Alla voce
Data Collection impostare l’acquisizione del segnale di fluorescenza solo in fase di annealing nei
cicli di PCR (deselezionando col mouse le eventuali altre acquisizioni impostate di default dallo
strumento) e nella fase di melting.
Selezionare quindi Real-Time. Se l’Instrument Status risulta disconnesso, cliccare Connect to
Instrument ed aspettare la connessione. Una volta avvenuta ed in modalità Idle, selezionare
Open/close ed aspettare l’apertura della porta e la fuoriuscita del supporto meccanico per
l’inserimento della piasta (se così non fosse, ripetere l’operazione open/close fino alla fuoriuscita
del supporto).
Lo strumento è quindi pronto per lavorare. Lasciare in standby (Idle) e preparare la piastra con i
campioni e la mix.
Una volta preparata la piastra, sigillarla con la specifica pellicola adesiva (Micro Amp Optical
Adesive Film PCR Compatible) facendo attenzione a non creare bolle d’aria.
Centrifugare la piastra qualche secondo per eliminare eventuali bolle nei pozzetti che potrebbero
falsare la lettura.
Mettere il tappetino dedicato sulla piastra (con il lato grigio verso il basso e a diretto contatto con la
pellicola adesiva) e quindi posizionare la piastra sul supporto dello strumento (con la posizione A1
in alto a sinistra)
Premere Start per cominciare. Lo sportello si chiuderà autonomamente. Salvare la seduta in una
cartella di lavoro a piacere.
La seduta viene completata in circa 2 ore.
C. ANALISI DEI DATI



Selezionare Analysis Analysis Setting e nella sottopagina Detector lasciare Automatic CT quindi
cliccare OK.
Passare all’analisi dei dati: nella pagina Results compare l’Amplification Plot.
Controllare che nella casella Detector sia selezionato il canale Fret; nella casella Plot selezionare
Rn vs. Cycle per vedere la curva di amplificazione.
Pagina 3 di 18


Nella pagina Dissociation Curve compaiono le curve di melting.
Selezionare nelle caselle Detector Fret
Plot Derivative


Analizzare la curva di dissociazione per ogni campione cliccando sui pozzetti della piastra.
Per ogni campione assegnare il corretto genotipo come riportato nella specifica metodica, in base
alle temperature dei picchi visualizzati. Questa operazione va eseguita manualmente per ogni
singolo campione.
Per l’analisi può essere utilizzato il programma RealGene (codice DO015).
Questa metodica è scaricabile dal sito NLM.
Per scaricarla seguire: http://www.nlm.it/downloads.aspx?CID=1876&SORD=1&MID=10180
Pagina 4 di 18
ABI 7500 FAST PROTOCOLLO PER CHIMICA FRET



Accendere il PC e lo strumento AB7500 FAST; aprire il relativo software. Lasciare GUEST nel
menù a tendina e cliccare Log in as Guest.
Cliccare Advanced Setup nella parte sinistra dello schermo: si apre una nuova finestra.
Nella parte Experiment Properties inserire il nome dell’esperimento e selezionare lo strumento
7500 Fast (96 wells), melt curve, other e standard (2 hours to complete a run).
A. IMPOSTAZIONI DELLA PIASTRA







Selezionare a sinistra Plate Setup
Selezionare define targets and samples in alto.
Nella parte sinistra della pagina (define targets) selezionare add new target e inserire il nome del
target; dal menù a tendina selezionare FAM come reporter e none come quencher e un colore.
Nella parte destra della pagina (define samples) selezionare add new sample per ogni campione
che si deve analizzare e inserire il nome del campione; dal menù a tendina selezionare un colore.
Selezionare assign targets and samples in alto.
Selezionare le posizioni utilizzate per la seduta nella piastra e associare il fluoroforo, spuntando il
target a sinistra (assign). Selezionare quindi ogni pozzetto nella piastra associato all’analisi e il
nome scritto in precedenza, spuntando il nome a sinistra (assign). Indicare anche alla voce Task il
tipo di campione che si analizza in quella determinata posizione: es. per un controllo negativo
come l’acqua selezionare Negative control, per i campioni selezionare Unknown.
Selezionare none alla voce select the dye to use as the passive reference.
Pagina 5 di 18
B. PROFILO TERMICO












Selezionare a sinistra Run Method.
Selezionare Graphical View in alto.
Inserire 25l come Reaction volume per well.
Impostare il profilo termico specifico del kit in uso (fare riferimento all’appendice).
Attenzione: per lo step di annealing la durata minima è 30 secondi.
Lasciare 100% per tutte le rampe mentre per la melting impostare 1.5%. Impostare l’acquisizione
del segnale di fluorescenza solo in fase di annealing nei cicli di PCR e nella fase di melting.
Lasciare deselezionato Enable AutoDelta
Selezionare Run e controllare che l’Instrument Status risulti connesso: lo strumento è quindi
pronto per lavorare.
Preparare la piastra con i campioni e la mix, sigillarla con la specifica pellicola adesiva (Micro Amp
Optical Adesive Film PCR Compatible) facendo attenzione a non creare bolle d’aria.
Attenzione: utilizzare solo piastre “MicroAmp FAST 96-Well reaction plate (0,1 ml)
Centrifugare la piastra qualche secondo per eliminare eventuali bolle nei pozzetti che potrebbero
falsare la lettura.
Aprire lo strumento e posizionare la piastra sul supporto, con la posizione A1 in alto a sinistra.
Salvare la seduta in una cartella di lavoro a piacere.
Premere Start per cominciare. La seduta viene completata in circa 2 ore.
C. ANALISI DEI DATI



Selezionare Analysis e Melt Curve a sinistra della pagina.
Selezionare dal menù a tendina Plot, la voce Derivative Reporter
Selezionare dal menù a tendina Target lo specifico target che si vuole analizzare o lasciare All.
Pagina 6 di 18


Analizzare la curva di dissociazione per ogni campione cliccando sui pozzetti della piastra.
Per ogni campione assegnare il corretto genotipo come riportato nella specifica metodica in base
alle temperature dei picchi visualizzati. Questa operazione va eseguita manualmente per ogni
singolo campione.
Per l’analisi può essere utilizzato il programma RealGene (codice DO015).
Questa metodica è scaricabile dal sito NLM.
Per scaricarla seguire: http://www.nlm.it/downloads.aspx?CID=1876&SORD=1&MID=10180
Pagina 7 di 18
ABI 7500 FAST Appendice
 AA978 Emocromatosi HFE H63D e S65C
 AA979 Emocromatosi C282Y
Profilo termico
Picchi curve di melting
AA978 (HFE H63D, S65C)



Un singolo picco a 52  2°C per campioni wild-type per entrambe le mutazioni
Un singolo picco a 60.5  2°C per campioni omozigoti H63D
Un singolo picco a 47  2°C per campioni omozigoti S65C
 Un doppio picco 52°C-60.5°C per campioni eterozigoti H63D
 Un doppio picco 47°C-52°C per campioni eterozigoti S65C
 Un doppio picco 47°C-60.5°C per campioni eterozigoti per entrambe le mutazioni
AA979 (HFE- C282Y)
 Un singolo picco a 54,5  2°C per campioni omozigoti mutati
 Un singolo picco a 63,2  2°C per campioni wild-type
 Un doppio picco per campioni eterozigoti
Pagina 8 di 18
 AA831 - Fattore II (G20210A)
 AA832 - Fattore V (G1691A)
 AA901 - MTHFR (C677T)
 AA902 - MTHFR (A1298C)
Profilo termico
Picchi curve di melting
AA831 - Fattore II (G20210A)
 Un singolo picco a 58  2°C per campioni wild-type
 Un singolo picco a 51  2°C per campioni omozigoti mutati
 Un doppio picco per campioni eterozigoti
AA832 - Fattore V (G1691A)
Un singolo picco a 57,5  2°C per campioni wild-type
 Un singolo picco a 63  2°C per campioni omozigoti mutati
 Un doppio picco per campioni eterozigoti

AA901 - MTHFR (C677T)
Un singolo picco a 60,5  2°C per campioni wild-type
 Un singolo picco a 51  2°C per campioni omozigoti mutati
 Un doppio picco per campioni eterozigoti

AA902 - MTHFR (A1298C)
 Un singolo picco a 61  2°C per campioni wild-type
 Un singolo picco a 55  2°C per campioni omozigoti mutati
 Un doppio picco per campioni eterozigoti
Pagina 9 di 18
MANUAL
NLM 7093
VER 14/05/2014
DX001
ABI PRISM 7900HT
ABI 7500 FAST
OPERATOR’S MANUAL
NUCLEAR LASER MEDICINE S.r.l.
HEAD OFFICE: Viale delle Industrie, 3 – 20090 SETTALA MI (Italy)
Tel (+39) 02/95. 24. 51 - Fax (+39) 02/95. 24. 52. 37
WEB: www.nlm.it – E-MAIL: [email protected]
ABI PRISM 7900 PROTOCOL FOR FRET PROBES CHEMISTRY


Turn on the PC and the ABI PRISM 7900 instrument; open the specific program.
Open File New; for the Assay, select Standard Curve (AQ), for Container, select 96 Wells Clear
Plate and for Template select Blank Template. Click OK.
A) PLATE LAY OUT

Move into the settings page of the instrument. On the right side of the page (mode setup on top)
for Passive Reference select None. Click Add Detector, select New and add for Name and Report
the fluorophore ROX; select for Quencher NON FLUORESCENT; Click OK. Select the fluorophore
and click Copy To Plate Document and Done. Return to home page. On the left of the page select
the fluorophore for each position used in your plate, selecting with an X where it appears USE. If
you do not need the whole plate, deselect the wells not used and exclude them from analysis
selecting OMIT WELLS (check that only the wells you wish to exclude from analysis are selected
by a red cross. This operation speeds up the session as shortens the time for reading the
fluorescence; only the wells of interest are read and not the whole plate).

Assign a name to each sample selecting Sample Name. For Task, indicate the type of sample that
is analyzed in that particular position: e.g. for a negative control select NTC; for the samples, leave
Unknown.
B) THERMAL PROFILE




Select Instrument (at the right top of the page).
There are three pages: Thermal cycler, Real Time and Queue.
Select Thermal cycler and in mode choose standard and add 25l as sample volume.
In Thermal profile set the RT-PCR profile as follows:
Pagina 11 di 18








For Auto Increment leave 0, leave the ramp Rate to 100% for all steps except Melting Curve where
you have to set 5% at 80°C. For Data Collection set the acquisition of the fluorescence at the
annealing step of PCR cycles and at the Melting Curve (deselecting any other acquisition option,
selected by default).
Select Real-Time. If the Instrument Status is disconnected, click Connect to Instrument and wait
for the connection. Once in Idle mode, click Open/close and wait for the opening of the door and
the release of the mechanical support to introduce the plate (if necessary, repeat Open/close until
the release of the support).
The instrument is now ready to work. Leave it in Standby mode (Idle) and prepare the plate with
samples and mix.
When the plate is ready, seal it with the specific adhesive film (Micro Amp Optical Adesive Film
PCR Compatible); avoid leaving air bubbles under the film.
Centrifuge the plate for few seconds to remove any bubble in the wells, that could inhibit the
detection.
Place the specific pad over the plate (with the grey side down and at direct contact with the
adhesive film) and put the plate on the support of the instrument (with A1 position at the upper
left).
Press start to begin. Save the session in a workbook.
The session will take about 2 hours.
Pagina 12 di 18
C) DATA ANALYSIS



Click on Analysis Analysis Setting and set Automatic CT. Click Apply and OK.
Go to Analysis of data: the Amplification Plot appears on the Results page
Select Fret as Detector and Rn vs. Cycle as Plot


The Melting Curve appears on the page Dissociation Curve
Select Detector Fret
Plot Derivative


Analyze the Melting Curve for each sample selecting the specific well of the plate.
For each sample assign the correct genotype based on the peaks temperature as reported in the
specific assay instructions for use. This operation has to be done manually for each sample.
For the analysis of the results the software RealGene (code DO015) can be used.
Download this manual from the NLM website:
http://www.nlm.it/downloads.aspx?CID=1876&SORD=1&MID=10180
Pagina 13 di 18
AB 7500 FAST PROTOCOL FOR FRET PROBES CHEMISTRY



Turn on the PC and the ABI 7500 FAST instrument; open the specific software. Click on Log in as
Guest.
Select Advanced Setup on the left of the page.
In the Experiment Properties: enter the name of experiment, select the instrument 7500 Fast (96
wells), melt curve, other and standard (2 hours to complete a run).
A) PLATE LAY OUT







Select Plate Setup on the left of the page.
Select define targets and samples on the top.
On the left side of the page (define targets) select add new target and add the name of the target;
from the menu, chose for report FAM and for Quencher none; select a color.
On the right side of the page (define samples) select add new sample for each sample, write the
sample name and select a color.
Click assign targets and samples on the top.
Select the fluorophore for each position used in your plate, selecting the target on the left (assign).
Assign the name for each position used in your plate, selecting the name on the left (assign). For
Task, indicate the type of sample that is analyzed in that particular position: e.g. for a negative
control select NTC; for the samples, leave Unknown.
Select none for select the dye to use as the passive reference.
Pagina 14 di 18
B) THERMAL PROFILE








Select Run Method (on the left of the page).
Select Graphical View on the top.
Add 25l as Reaction volume per well
Set the PCR profile as indicated in the Appendix.
Warning: the annealing step must be at least of 30 seconds
Leave the ramp Rate to 100% for all steps except Melting Curve where you have to set 1.5%. Set
the acquisition of the fluorescence in the annealing step of PCR cycles and in the Melting Curve
only.
Deselect Enable AutoDelta
Select Run on the left of the page and check if the Instrument Status is connected.
The instrument is now ready to work. Prepare the plate with samples and mix, seal the plate with
the specific adhesive film (Micro Amp Optical Adesive Film PCR Compatible), avoid air bubbles
under the film.
Warning: You should use “MicroAmp FAST 96-Well reaction plate (0.1ml)” only




Centrifuge the plate for few seconds to remove any bubble in the wells, that could inhibit the
detection.
Open the instrument and place the plate on the support (with A1 position at the upper left).
Save the session in a workbook. Press start to begin.
The session will take about 2 hours.
C) DATA ANALYSIS



Click on Analysis and Melt Curve.
Select for Plot Derivative Reporter.
Select for Target the specific target that you want to analyze or All.
Pagina 15 di 18


Analyze the Melting Curve for each sample selecting the single well on the plate.
For each sample assign the correct genotype based on the peaks temperature as reported in the
specific assay instructions for use. This operation has to be done manually for each sample.
For the analysis of the results the software RealGene (code DO015) can be used.
Download these instructions for use from the NLM website:
http://www.nlm.it/downloads.aspx?CID=1876&SORD=1&MID=10180
Pagina 16 di 18
AB 7500 FAST Appendix
 AA978 Hemochromatosis HFE H63D and S65C
 AA979 Hemochromatosis HFE C282Y
Thermal profile
Melt Peaks
AA978 (HFE H63D, S65C)



single peak at 47  2°C for homozygous S65C mutant samples
single peak at 52  2°C for wild-type samples for both mutations
single peak at 60.5  2°C for homozygous H63D mutant samples
 double peak 52°C-60.5°C for heterozygous H63D samples
 double peak 47°C-52°C for heterozygous S65C samples
 double peak 47°C-60.5°C for heterozygous samples for both mutations
AA979 (HFE- C282Y)
 single peak at 54,5  2°C for homozygous mutant samples
 single peak at 63,2  2°C for wild-type samples
 double peak for heterozygous samples
Pagina 17 di 18
 AA831 - Factor II (G20210A)
 AA832 - Factor V (G1691A)
 AA901 - MTHFR (C677T)
 AA902 - MTHFR (A1298C)
Thermal Profile
Melt Peaks
AA831 - Factor II (G20210A)



single peak at 51  2°C for homozygous mutant samples
single peak at 58  2°C for wild-type samples
double peak for heterozygous samples
AA832 - Factor V (G1691A)



single peak at 57,5  2°C for wild-type samples
single peak at 63  2°C for homozygous mutant samples
double peak for heterozygous samples
AA901 - MTHFR (C677T)



single peak at 51  2°C for homozygous mutant samples
single peak at 60,5  2°C for wild-type samples
double peak for heterozygous samples
AA902 - MTHFR (A1298C)



single peak at 55  2°C for homozygous mutant samples
single peak at 61  2°C for wild-type samples
double peak for heterozygous samples
Pagina 18 di 18