IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI NELL’ESONE 11 DEL GENE c-Kit AMPLI-c-KIT 11 Cat. n. 1425

I tumori stromali gastrointestinali (GISTs) sono le neoplasie mesenchimali più frequenti del tratto gastrointestinale. Rappresentano il 2% dei tumori dello stomaco, il 14% dei tumori dell’ intestino tenue e lo 0,1% dei tumori del colon. L’85% di tali tumori esprime il recettore tirosino-chinasi KIT (stem cell factor receptor CD 117). L’attivazione di tale recettore innesca una cascata di segnali intracellulari che controllano la proliferazione, l’adesione e l’apoptosi cellulare. Le mutazioni a carico del gene c-kit sono responsabili dell’attivazione costitutiva del recettore in assenza del ligando. Coinvolgono più frequentemente l’esone 11 del gene, più raramente gli esoni 9, 13 e 17. Molteplici studi hanno evidenziato che tra il 50 ed il 90% dei tumori GIST presentano mutazioni a carico del gene c-kit. La presenza di tali mutazioni, inoltre, correla con un fenotipo più aggressivo del tumore. I tumori GISTs che risultano negativi per mutazioni a carico del gene c-kit, inoltre, presentano frequentemente mutazioni attivanti a carico del gene codificante per il recettore del PDGF. Il kit permette l’identificazione di mutazioni a carico dell’esone 11 del gene c-kit. La metodica prevede l’amplificazione con oligonucleotidi specifici e successiva analisi di sequenza nucleotidica. La caratterizzazione delle mutazioni rappresenta un importante target terapeutico e prognostico. Il recettore attivato, infatti, rappresenta il bersaglio della terapia attualmente più efficace contro la proliferazione di tali tumori. Il principio attivo Imatinib (Gleevec in USA; Glivec in Europa) è un potente inibitore competitivo di proteine attivate quali KIT, BCR-ABL e PDGFR α e β .

Principio del metodo:

A) estrazione del DNA genomico da tessuto B) amplificazione C) rivelazione sul gel di agarosio D) sequenza nucleotidica.

Applicabilità:

Su DNA genomico estratto e purificato 200 – 1000 microlitri; Termociclatore programmabile; Cappa Biohazard classe II; Camera elettroforetica con alimentatore; fotografico. Transilluminatore UV; Apparato da campioni di tessuto.

Numero di Test:

40.

CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE

Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono essere sterili, DNase e RNase free e monouso.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

ESTRAZIONE Reagente 1 (Buffer di separazione) Reagente 2 (Buffer di lisi) Reagente 3 (Soluz. di deproteinizzazione) Reagente 4 (Proteinase k) Reagente 5 (soluzione satura NaCl) AMPLIFICAZIONE e DIGESTIONE PCR mix esone 11 H 2 O sterile Taq Polymerase (5U/ µ l) RIVELAZIONE Gel precast di agarosio 2% per elettroforesi in TBE 1X Loading buffer 10 X Buffer di corsa 5 X (TBE 5X) Marker di peso molecolare +4°C +4°C +4°C -20°C +4°C -20°C -20°C -20°C T.A. T.A. T.A. -20°C

Stabilita':

superiore a 18 mesi se correttamente conservato (I gels di agarosio se conservati lontano dalla luce, sono stabili per un anno a temperatura ambiente). Materiali Richiesti: tubi da 1,5 ml; tubi da 15 ml in polipropilene; portaprovette refrigerato; puntali sterili con barriera antiaerosol; bacchetta di vetro (o pasteurs di vetro); Portaprovette refrigerato; tubi PCR.

Reagenti richiesti non compresi nel kit:

acqua bidistillata sterile, cloroformio, etanolo 100 %, etanolo 70 %.

Strumenti richiesti:

centrifuga con rotore ad angolo fisso per tubi da 2 ml (12.000 x g) e centrifuga a rotore oscillante con adattatori per tubi da 15 ml (1.500 x g), Set di pipette pre-PCR e post-PCR: 1) 0.5 – 10 microlitri 2) 5 – 50 microlitri 3) 50 – 200 microlitri 4) Il prodotto di amplificazione e’ un frammento di 303 bp. L’analisi di sequenza nucleotidica rivelerà la presenza o l’assenza di mutazioni.

REFERENZE:

World J Gastroenterol 2005; 11 (7): 1052-1055. Cancer Research 64, 5913-5919 (2004). Science 279 (1998) 577-580. Cancer Control (2005) 12, 44-56. REV. 01