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EFFETTO PROTETTIVO
DELL'IDROSSITIROSOLO E DEL TIROSOLO
CONTRO L'AZIONE PRO-OSSIDANTE DEGLI
OSSISTEROLI IN CELLULE CACO-2
Caterina Scarano, Angela Atzeri, Alessandra Incani, Gessica Serra, M. Paola
Melis, Laura Tronci, Danilo Putzu, Antonella Rosa e Monica Deiana.
Unità di Patologia Sperimentale, Dipartimento di
Scienze Biomediche, Università di Cagliari.
via enzimatica (idrossilazione
del colesterolo)
ossisteroli
via non enzimatica
(ossidazione da parte dei
ROS)
origine esogena (dieta)
L’assorbimento avviene a livello intestinale e il
trasporto ai tessuti attraverso i chilomicroni.
L’escrezione è a livello intestinale.
Gli ossisteroli possono formarsi nei cibi in seguito a:
•lunghi periodi di conservazione senza uso del sottovuoto;
•alte temperature;
•disidratazione;
•radiazioni.
Ne sono un esempio:
Carni rosse
Latte in
polvere
Uova essiccate
Gli ossisteroli più comuni nei cibi sono gli steroli
7-ossigenati, come 7-chetocolesterolo e
7β-idrossicolesterolo. (G. Leonarduzzi et al., 2002)
(Biasi et al., 2009; Biasi,
Mascia & Poli, 2008)
Gli ossisteroli sono causa di:
aterosclerosi
•Stress ossidativo vascolare
……………………
•alterazione dello stato redox degli enterociti con
aumento dello stato ossidato dei sistemi ossidoriduttivi cellulari (es. GSH/GSSG) (M. L. Circu, et al., 2012)
La diminuzione del GSH provoca:
•infiammazione intestinale;
•apoptosi;
•degenerazione dell’epitelio intestinale;
•stress ossidativo per produzione di ROS da parte dei
macrofagi;
•aumento composti tossici (es.MDA).
IBD (inflammatory bowel
disease) (M. L. Circu, et al., 2012)
tumore colon-rettale
(C. Mascia et al., 2010; A. Jusakul et al.,
2011)
Gli antiossidanti possono essere naturalmente presenti
negli alimenti o aggiunti.
•polifenoli
•vitamine (A, C, E)
che ritroviamo in:
• frutta
•ortaggi
•vino rosso
•olio extra-vergine
di oliva
Olio EVO
(25-50 ml)
polifenoli
(8 mg + 1 mg di
fenoli semplici)
L’idrolisi avviene ad opera di enzimi e
in condizioni particolari come il pH
acido dello stomaco.
HT e TYR vengono assorbiti in
modo dose-dipendente a livello
intestinale.
La concentrazione colonica dei fenoli
semplici è dell’ordine delle μM. (Corona,
G., Tzounis, X., Dessi, M.A., Deiana, M., Debnam, E.S., Visioli,
F., Spencer, J.P.E., 2006. Free Radical Res. 40, 647–658.)
TIROSOLO (TYR) e
IDROSSITIROSOLO
(HT)
Biotrasformazione in
glucuronide coniugati, metilati
e solfati.
I derivati possono hanno
attività biologica
confrontabili con HT e TYR
(Deiana M et al, 2011; Incani A et al., 2010;
Deiana M et al., 2008)
HT e TYR possono svolgere la loro azione protettiva
come scavenger nei confronti di radicali liberi, o
attraverso la modulazione di segnali intracellulari
(I. Rodriguez-Ramiro et al., 2011; Halliwell et al., 2005)
IL TIROSOLO:
•Inibisce l’ossidazione delle LDL
•Previene l’effetto tossico delle LDL ossidate (es. apoptosi,
induzione della proliferazione cellulare)
•Effetto antiossidante: scavenger dei radicali idrossilici e
rigenerazione dell’α-tocoferolo
•bassa attività di scavenger del H2O2
(C. Giovannini et al., 1999; D. Loru et al.
2009).
L’IDROSSITIROSOLO:
•Protegge dall’aterosclerosi, diminuendo la
sintesi di VCAM-1 e ICAM-1;
•Protegge le LDL dall’ossidazione
(J.M. Landete, 2013)
;
•Ha effetto anti-infiammatorio: diminuisce
l’espressione dei geni per gli enzimi proinfiammatori (COX-2 e iNOS);
•Antitumorali;
•Antiossidanti
scavenger
modulazione dei sistemi
antiossidanti e detossificanti
(H. Rafehi et al., 2012;
I. Rodriguez-Ramiro et al., 2011)
Scopo del lavoro:
Effetto protettivo dell’idrossitirosolo e del tirosolo
dall’azione pro-ossidante degli ossisteroli attaverso il
trattamento di cellule CaCo-2 con il colesterolo
ossidato.
Misura dei ROS
(test della
diclorofluoresceina)
Determinazione dello
stato redox cellulare
(livelli di GSH)
Misura del danno
ossidativo cellulare
(test del TBARs)
Studi di assorbimento e
permeabilità
Meccanismi di stress
ossidativo e difesa
antiossidante
CaCo-2
Cellule coloniche di natura tumorale
DIFFERENZIAMENTO
confluenza
Assumono caratteristiche di enterociti maturi
con.
•enzimi antiossidanti (catalasi, SOD, GPx,
GRED);
•microvilli;
•tight junction.
(Pinto et al., 1983)
Preparazione del colesterolo ossidato:
Colesterolo
(10 mg)
OX
3 ore
140 °C
•60% di colesterolo
Principali prodotti di ossidazione:
•10% di 7β-idrossicolesterolo;
•14% di 7-chetocolesterolo;
…………………………….
Caratterizzazione al GC-MS
MISURA DEI ROS
(TEST DELLA DICLOFLUORESCEINA)
20-22 g
differenziamento
•Pretrattamento
15’ a 37 °C con HT e TYR
(5-50 µM)
•Trattamento
•30’ con il colesterolo ossidato(75 µg/ml in
ETOH).
DETERMINAZIONE DELLO STATO REDOX
CELLULARE:
DETERMINAZIONE DEL GSH
20-22 g
differenziamento
•Trattamento
•30’ con il colesterolo ossidato (50 µg/ml in
ETOH).
•Pretrattamento
•15’ a 37 °C con HT e
TYR (5-50 µM)
VALUTAZIONE DELLA CAPACITÀ ANTIOSSIDANTE IN SEGUITO AL
TRATTAMENTO CON OSSISTEROLI E AL PRETRATTAMENTO CON
HT E TYR
20-22 g
differenziamento
•Trattamento
•24 ore con il colesterolo ossidato (100
µg/ml in ETOH).
•Pretrattamento
•24 ore a 37 °C con
HT e TYR (1-10 µM)
Test del TBARs
e analisi all’HPLC con rivelatore a serie di
diodi.
Livelli di ROS (% del
controllo)
Misura dei ROS in diversi tempi di
incubazione
°°°
150
°°
100
50
0
0
30
60
Tempo di incubazione (min)
180
Livelli di ROS in cellule CaCo-2, incubate a tempi diversi con il colesterolo ossidato (75
μg/ml), espressi come percentuali rispetto alle cellule di controllo, trattate al tempo 0. °°°=
p<0.001 °°= p<0.01 rispetto alle cellule trattate al tempo 0.
MISURA DEI ROS
HT
TYR
ROS (% del controllo)
a
200
*
150
*
**
**
100
50
0
ox
5
10
25
Concentrazione (μM)
Livelli di ROS, espressi come % del controllo, in cellule CaCo-2 pretrattate e non con HT e TYR
(15 minuti) e il colesterolo ossidato (75 µg/ml) per 30 minuti, esposte alla DCF per 30 minuti. a=
p<0.001 verso i controlli **= p<0.01; *= p<0.05 rispetto ai campioni trattati con ossisteroli.
Livelli di GSH a diversi tempi di incubazione
GSH( % del controllo)
120
100
°°°
80
°°°
°°°
°°°
60
40
20
0
0
30min
1h
3h
6h
18h
24h
Tempo di incubazione (min)
Livelli di GSH misurati in CaCo-2, trattate a diversi tempi di incubazione con il
colesterolo ossidato (75 μg/ml) , ed espressi come percentuali rispetto ai campioni di
controllo trattati al tempo 0. °°°= p<0.001 rispetto ai campioni trattati al tempo 0.
GSH (% del controllo)
DETERMINAZIONE DEL GSH
HT
120
100
TYR
**
a
***
***
*
*
80
60
40
20
0
OX
5
10
Concentrazione(μM)
25
Livelli di GSH, espressi come % del controllo, in cellule CaCo-2 pretrattate e non con HT
e TYR (15 min), trattate con il colesterolo ossidato per 30 minuti (75 µg/ml). a=p<0.001
rispetto ai controlli, ***= p<0.001; **= p<0.01; *=p<0.05 rispetto ai campioni trattati con
ossisteroli.
MISURA DELLA MALONILDIALDEIDE (MDA)
MDA (% del controllo)
HT
200
TYR
a
150
*
*
*
**
**
100
50
0
Ox
2,5
5
Concentrazione (μM)
10
Valori di MDA, espressi come % del controllo, misurati in cellule CaCo-2 dopo
incubazione con il colesterolo ossidato e pre-trattati con HT e TYR (24h). a=p<0.001
rispetto al controllo, **= p<0.01; *= p<0.05 rispetto ai campioni trattati con ossisteroli.
In conclusione…
Colesterolo ossidato
•produzione dei ROS a tutte le concentrazioni testate;
•riduzione della concentrazione del GSH;
•produzione di MDA.
I risultati ottenuti indicano che il pre-trattamento con
HT e TYR di cellule CaCo-2 differenziate, porta alla
protezione dal danno ossidativo e dall’alterazione
dell’equilibrio redox, indotti nelle stesse cellule dal
trattamento con il colesterolo ossidato.
L’attività antiossidante di HT e TYR, che si concentrano
nel lume intestinale insieme ai loro metaboliti, può avere
un ruolo importante nella protezione dalle più comuni
patologie correlate al danno ossidativo.
CLAIM EFSA 2011: l’assunzione di almeno 5 mg/die
di HT e derivati al fine di proteggere dalle patologie
correlate con il danno ossidativo per le loro proprietà
antiossidanti, di protezione delle LDL e delle cellule
dai danni ossidativi