Transcript Lavaggio Bronco-alveolare (BAL)

Dipartimento di Diagnostica di Laboratorio
SODc LABORATORIO GENERALE
Dir. f.f. Dott.ssa Alessandra Fanelli
SODs MICROSCOPIA E CITOMETRIA EMATOLOGICA
BAL: TECNOLOGIE PER
L’ANALISI DI LABORATORIO
Roberto Caporale
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL)
E’ una tecnica broncoscopica che consiste
nell’instillazione di soluzione fisiologica nelle vie
aeree distali con seguente aspirazione e recupero
del liquido. Si basa sul principio che le cellule e i
componenti non cellulari presenti sulla superficie
epiteliale degli alveoli sono rappresentativi del
sistema infiammatorio e immunitario di tutto il
tratto respiratorio inferiore.
BRONCOSCOPIO
Sol.Fisiologica a 37°C
100-200 mL
in tre aliquote (20-50 mL)
50 mL
SIRINGA
VALVOLA
VACUUM PUMP 60-70
mm Hg
FLUIDO ASPIRATO
MICROBIOLOGIA
prima Aliquota
CITOMETRIA
CITOLOGIA
Analisi delle cellule infiammatorie
nel Lavaggio Bronco-alveolare (BAL)
• Nelle malattie respiratorie non maligne il BAL raffigura
abbastanza accuratamente le reazioni immuni che
avvengono nel bronchiolo terminale e nell’interstizio
alveolare e complementano la TAC ad alta risoluzione
(HRCT)
• Il BAL è fortemente consigliato nella diagnosi differenziale
dei
processi
infiammatori
interstiziali:
Sarcoidosi,
Pneumconiosi, Polmoniti da ipersensibilità, Bronchiolite
obliterante (BOOP) , Fibrosi polmonare, coinvolgimento
polmonare nella Malattie autoimmuni……
• La standardizzazione della procedura e il coordinamento tra
medici e laboratorio sono estremamente importanti per
ottenere risultati coerenti.
• E’ un’analisi delicata: le cellule nel fluido del BAL sono
stabili fino a 4 ore.
Raccomandazioni:
• Trasporto del campione
• Processazione
• Analisi
• Utilità diagnostica
Meyer KC. Am J Respir Crit Care Med 2012; 185: 1004-1014.
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): preparazione del campione
400 µL per la
conta cellulare
assoluta
BAL
appena prelevato
AB
12
cd
Annotare:
• apparenza
• quantità
• eventuale contaminazione
con sangue
AB
12
cd
Filtrare con garza
sterile per
eliminare muco e
grossi detriti (non
aggiungere liquido)
AB
12
cd
400 µL
per Cytospin
1 mL
per analisi
citometrica
(FCM)
AB
12
cd
FCM
Eventale
centrifugazione a
1500 rpm per 10’
per scarsa cellularità
e risospensione in
1 mL PBS
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): preparazione del campione
Valutazione della
cellularità totale
• Conta su contaglobuli Sysmex XE-5000
con software per liquidi biologici
Citogramma
• Colorazione con Wright-Giemsa modificato
• Esame morfologico e conta differenziale
dei leucociti su sistema DM96
Determinazione
dell’Immunofenotipo
• Vitalità con colorante nucleare 7-AAD
• Pannello linfocitario completo
• Determinazione di altri tipi cellulari con
pannelli di MoAb specifici.
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): conta cellulare
SYSMEX XE-5000 (+ body fluid software)
Body Fluid Linearity
3
WBC-BF: 0.000 - 10.000 x 10 /µL
3
TC-BF:
0.000 - 10.000 x 10 /µL
6
RBC-BF: 0.000 - 5.000 x 10 /µL
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): conta cellulare
SYSMEX XE-5000 (+ body fluid software)
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): preparazione del cytospin
Questa procedura :
• Concentra le cellule
• Minimizza la distorsione cellulare
• Produce un monostrato di cellule
Materiale citocentrifuga:
•
•
•
•
Filtri di carta
Contenitori ad imbuto
Ganci di metallo
Vetrini
200 µL
Le cellule saranno cosi concentrate in un pellet . La colorazione di WrightGiemsa modificato è raccomandata perché mostra ottimi dettagli morfologici.
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): morfologia cellulare
SYSMEX DM96
• Scansiona un'area definita dall'utente del vetrino per microscopio
• Individua e presenta automaticamente le immagini delle cellule su strisci
presenti in diversi tipi di campioni
• È destinato all'uso da parte di operatori esperti
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): morfologia cellulare
SYSMEX DM96 (+ body fluid software)
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): morfologia cellulare
SYSMEX DM96 (+ body fluid software)
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): morfologia cellulare
SYSMEX DM96 (+ body fluid software)
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Normale morfologia cellulare
•
•
•
•
•
80 - 200 cellule per mL
Macrofagi: 80 – 90 %
Linfociti: 10 – 15 %
Neutrofili: 1 – 2 %
Eosinofili: < 1%
Le caratteristiche del Cytospin sono determinanti per
l’analisi immunofenotipica
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Analisi Citometrica (CFM)
Sistema FACSCanto II
BD Biosciences
La CFM consente l’analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse,
misurandone le caratteristiche fisiche e/o biochimiche all’interno di un flusso
laminare che interseca una sorgente di eccitazione
Immunofenotipizzazione cellulare
Insieme di metodi diretti al riconoscimento, alla
quantificazione ed alla localizzazione di strutture cellulari
per mezzo di reagenti immunologici (anticorpi
monoclonali).
L'analisi
dell‘immunofenotipo
permette
la
classificazione delle cellule in termini di:
• differenziazione (linea di appartenenza)
• maturazione
applicata all'analisi di cellule patologiche ne consente la
definizione, in termini di linea, di stadio
differenziativo e di clonalità.
Valutazione su sangue midollare (Pannelli multicolore)
precursori
Linfociti
maturi
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Analisi Citometrica
Cosa possiamo studiare:
• Vitalità cellulare (colorante nucleare 7-AAD)
• Linfociti (T, B, NK, ratio CD4/CD8)
• Monociti / Macrofagi (CD14+, CD36+, CD11b+)
• Granulociti neutrofili (CD13+, CD15+, HLA-DR neg.)
• Granulociti eosinofili (CD13+, CD16+ dim. CD9+)
• Altri tipi cellulari:
– Linfociti T attivati (CD3+/HLA-DR+)
– Istiociti (CD1a+, CD45+++)
– Mastcellule (CD117+, HLA-DR neg.)
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Analisi Citometrica: vitalità cellulare
7-aminoactinomycin D (7-AAD)
Cellule morte
Cellule vitali
Le cellule vitali sono 7-AAD negative
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Distribuzione dei linfociti
•
•
•
•
•
T CD3+: 70 - 90%
•
•
B CD19+/CD20+: 3 - 6%
T CD4+: 38 - 45%
T CD8+: 30 - 40%
CD4/CD8 Ratio: 1.2 - 1.8
Linfociti T attivati (CD3+ / HLA-DR+): 32 – 45%
NK CD16+/CD56+: 4 - 7%
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Distribuzione dei linfociti in campione normale
CD3/CD4
58%
Linfociti
15%
CD3
94%
CD3/CD8
36%
CD4/CD8 ratio = 1,6
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Distribuzione dei linfociti in campione con linfociti T attivati
CD3/CD4
14%
Linfociti
25%
CD3
97%
CD3/CD8
74%
CD3/HLA-DR
53%
CD4/CD8 ratio = 0.18
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Distribuzione dei linfociti in campione con sospetta
Sarcoidosi
CD3/CD4
87%
Linfociti
27%
CD3
96%
CD4/CD8 ratio = 7.9
CD3/CD8
11%
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Distribuzione dei linfociti in campione con LNH-B
Linfociti
72%
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Distribuzione dei linfociti in campione con Linfopatia T
Linfociti totali: 50%
Fenotipo atipico: CD2+, CD5+, CD4+ CD7+, HLA-DR+.
Negativi CD3, CD8, TCR alfa/beta e TCR gamma/delta.
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Linfopatia T
MACROFAGI
EOSINOFILI
LINFOCITI
Granulociti eosinofili
(CD13+, CD16+ dim. CD9+)
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Linfopatia T
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Sospetta infezione polmonare
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Sospetta infezione polmonare
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Sospetta infezione polmonare
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Sospetta infezione polmonare
neutrofili
neutrofili
neutrofili
macrofagi
Neutrofili: CD15+, CD16+, CD11b+, CD14-, HLA-DR-
Macrofagi: CD15- CD16+/-, CD14+, HLA-DR+
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Valutazione Macrofagi e g. neutrofili
NEUTROFILI
NEUTROFILI
MACROFAGI
MACROFAGI
Macrofagi: CD13+, CD14+, CD11b+, CD36+
Neutrofili: CD15+ CD13+, CD11b+, CD14-, CD36-
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
Valutazione Mastcellule e Istiociti
macrofagi
macrofagi
PMN
linfociti
CD1a+ istiociti
vs CD45+
istiociti
FSC / SSC BACKGATING
CD1a+ PE istiociti
Mastcellule
Mastcellule: CD117+ HLADR- (< 1%)
Istiociti: CD1a+ CD45+++ (< 2%)
linfociti
macrofagi
BAL Cell Pattern May Suggest the Underlying Disease
Meyer KC. Am J Respir Crit Care Med 2012; 185: 1004-1014.
Lymphocytes > 25%
Granulomatous Diseases (Sarcoidosis,
Hypersensitivity Pneumonitis, Berillosis), Cellular
non-specific Interstitial Pneumonia, Lymphocytic
Interstitial Pneumonia, Cryptogenic Organizing
Pneumonia, Drug Reactions, Lymphomas.
Lymphocytes > 50%
Hypersensitivity Pneumonia
Cellular non-specific Interstitial Pneumonia
CD4 / CD8 ratio > 4
Sarcoidosis (Highly specific, in absence of
other inflammatory cells)
Neutrophils > 50%
Acute Lung Injury, Aspiration Pneumonia,
Suppurative Infection
Eosinophils > 25%
Acute or Chronic Eosinophilic Pneumonia
Mast Cells > 1%
Lymphocytes > 50%
Neutrophils > 3%
Acute Hypersensitivity Pneumonitis
Le malattie interstiziali del polmone (ILD) sono associate
con la prevalenza di T CD4+ o CD8+ nel BAL
• Sarcoidosi
• Berillosi
• Asbestosi
• Artrite reumatoide
• Morbo di Crohn
• Tuberculosi
prevalenza
di CD8+
prevalenza
di CD4+
• Alveolite da iperesensibilità (EAA)
• Silicosi
• Collagenopatia e Vasculite
(con o senza Fibrosi)
• Bronchiolite obliterante (BOOP)
• Blastomicosi
• GVHD
• AIDS e infezioni da HTLV1
• induzione da farmaci
• Rigetto del trapianto di polmone
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): nuove prospettive
Immunofenotipo avanzato della funzionalità di CD4
•
linfociti Th 1:
CD4+ CXCR3+ CCR6-
producono
IFN- e TNF-
(Immunità cellulare)
•
linfociti Th 2:
CD4+ CXCR3- CCR6-
producono
IL-4, IL-5, IL-13
(Immunità umorale)
•
linfociti Th 17:
producono
IL-17
(Immunità innata)
CD4+ CXCR3- CCR6+
Lavaggio Bronco-alveolare (BAL):
CONCLUSIONI
• Con l’introduzione delle tecniche di analisi del BAL
l’approccio diagnostico alla patologia polmonare è
radicalmente cambiato, riducendo di fatto il numero di
biopsie polmonari.
• Particolarmente utile a scopo diagnostico sia nella patologia
interstiziale del polmone che nella patologia infettiva e
neoplastica.
• La standardizzazione della procedure e il coordinamento tra
medici e laboratori di citologia, microbiologia e citometria
sono estremamente importanti per ottenere risultati coerenti.
• Futuri sviluppi: introduzione di immunofenotipi avanzati che
studiano la funzionalità dei linfociti CD4 (TH1, TH2, TH17) e
lo studio delle citochine per diagnosi differenziale e attività di
malattia.