Transcript Alessandra Cuccurullo

Seminari congiunti Scuola di Specializzazione di Genetica Medica Dottorato di Scienze Biomediche e Oncologia, curriculum di Genetica Umana
Alessandra Cuccurullo
Introduzione
- Le tecniche di NGS individuano sempre maggiori quantità di
varianti geniche di significato sconosciuto, come possibili
mutazioni patogeniche.
- Uno dei maggiori sforzi consiste nell’interpretazione del significato
funzionale di queste varianti.
Aritmie cardiache: analisi funzionale in vitro
di mutazioni candidate
- In passato l’analisi funzionale delle varianti candidate per le aritmie
cardiache si è basata su sistemi di espressione in vitro associati a
patch-clamp, in diversi tipi cellulari.
- Il limite dei modelli in vitro sta nell’impossibilità di valutare l’influenza
di fattori ambientali, fattori neuro-ormonali, stretch meccanico,
carico emodinamico o geni modificatori, che influenzano la
funzionalità cardiaca in vivo.
Aritmie cardiache: generazione di modelli
murini per l’analisi di mutazioni candidate
- La generazioni di modelli in vivo può essere vantaggiosa e numerosi
modelli murini sono stati utilizzati per lo studio di aritmie cardiache.
- I modelli murini presentano, tuttavia, alcuni limiti importanti:
• sono costosi e lunghi da ottenere;
• esistono profonde differenze tra topo e uomo nella frequenza
cardiaca, nelle caratteristiche del potenziale d’azione e nel
tracciato elettrocardiografico.
Un modello alternativo: perché Zebrafish
- Zebrafish è un piccolo pesce tropicale, facile da mantenere, cresce
rapidamente e genera prole numerosa.
- Il genoma di zebrafish è stato pressoché completamente
sequenziato ed esistono valide tecniche di manipolazione
genetica.
- L’embrione è trasparente e consente una valutazione dello sviluppo
cardiaco ed una caratterizzazione fenotipica non invasive.
Il cuore di Zebrafish
- Il cuore di zebrafish ha un’anatomia molto distante da quella dei
mammiferi: ha solo un atrio e un ventricolo.
- Tuttavia, sia in stadio embrionale che nell’animale adulto il cuore di
zebrafish ricorda quello umano in termini di frequenza cardiaca,
caratteristiche
del
potenziale
d’azione
e
tracciato
elettrocardiografico.
Mutanti di zebrafish
- Zebrafish viene usato per studiare l’effetto di loss-of-function di geni
attraverso le strategie di knockdown con Morpholino.
- Sono stati inoltre descritti numerosi mutanti di zebrafish, spontanei o
indotti chimicamente, con alterazioni dei canali ionici cardiaci o delle
pompe ioniche.
Baker et al, Proc Natl Acad Sci USA 1997
Rottbauer et al, Dev Cell 2001
Ebert et al, Proc Natl Acad Sci USA 2005
Shu et al, Development 2003
Hassel et al, Nat Med 2009
Langheinrich et al, Toxicol Appl Pharmacol 2003
- Tuttavia, le mutazioni in SCN5A nell’uomo hanno effetto dominantenegativo, richiedendo la generazione di modelli transgenici.
Obiettivi del lavoro
Definire se lo zebrafish transgenico può costituire un valido sistema
modello per dimostrare gli effetti funzionali delle varianti sospette di
causare sindromi aritmogene.
La mutazione D1275N nel gene SCN5A
- D1275N si trova nel 3° dominio transmembrana del canale del Na+
cardiaco Nav1.5 ed è una delle mutazioni più ampiamente studiate.
- È stata identificata indipendentemente in 4 famiglie che presentano
spettri fenotipici differenti fra loro.
Groenewegen et al, Circ Res 2003
McNair et al, Circulation 2004
Olson et al, JAMA 2005
Laitinen-Forsblom et al, J Cardiovasc Electrophysiol 2006
- D1275N altera le proprietà del Nav1.5 in studi di elettrofisiologia su
topi transgenici: determina una riduzione del picco INa e
caratteristiche fenotipiche simili a quelle osservate nell’uomo.
Watanabe et al, Circulation 2011
Linee transgeniche di zebrafish con
espressione cardiaca di SCN5A WT e D1275N
Iniettato nell’uovo
fecondato allo
stadio di 1 cellula
PCR
su DNA genomico
Espressione
mRNA
Espressione
proteina
D1275N causa bradicardia, pause sinusali e
blocco di conduzione atrio-ventricolare
Analisi tra 5 e 20 dpf
Circa 20% dei transgenici D1275N
mostra un fenotipo anomalo.
Penetranza e fenotipo variabili con D1275N
D1275N altera la conduzione AV e si associa
a morte precoce
Larva 20 dpf
Zebrafish adulto
Intervalli elettrocardiografici in zebrafish adulto
Nav1.5 WT compensa il silenziamento dei
canali del Na+ endogeni meglio di D1275N
Conclusioni
- L’espressione stabile di un transgene che causa aritmia nell’uomo
può provocare la comparsa di fenotipi confrontabili in zebrafish.
- Le caratteristiche fenotipiche degli zebrafish transgenici SCN5AD1275N sono bradicardia, disfunzione del nodo del seno, blocco
di conduzione AV e morte prematura, simili ai pazienti eterozigoti
per la mutazione.
- Non sono state osservate tachiaritmia atriale o ventricolare, né
disfunzione contrattile ventricolare. Possibili spiegazioni sono:
- potrebbero comparire più avanti nello zebrafish adulto;
- tali fenotipi sono associati ad una funzione «non ionica» di
NaV1.5 non conservata nei pesci;
- la dimensione della camera atriale è un fattore critico per il
mantenimento dell’aritmia.
Conclusioni
- La mutazione D1275N agisce come dominante negativo in presenza
dei canali del Na+ endogeni.
- Le pathway di base in cui è coinvolto SCN5A sono conservate in
zebrafish.
- In questo studio, la penetranza del fenotipo tra gli animali SCN5AD1275N è del 76%. Anche gli umani portatori della mutazione
mostrano una penetranza incompleta. Una possibile spiegazione:
- la co-espressione di varianti in geni modificatori potrebbe
aumentare la penetranza.