Effetti sulle microvescicole plasmatiche indotti dal fumo di sigaretta

Laura Pergoli

Dipartimento di Scienze Cliniche e di Comunità, Università degli Studi di Milano e Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Milano ‘Clinica del Lavoro Luigi Devoto’

FUMO E MALATTIE CARDIOVASCOLARI Infiammazione polmonare Aumentato rischio cardiovascolare Attivazione dell’endotelio

IPOTESi: MV COME MEDIATORI DELL’INFIAMMAZIONE

CIGARETTES SMOKING

VESCICOLE EXTRACELLULARI

VESCICOLE EXTRACELLULARI: DIMENSIONI

MICROVESCICOLE E microRNA • Le MV contengono, oltre a proteine e DNA, anche mRNA e miRNA. • I miRNA rappresentano un meccanismo di controllo epigenetico in grado di regolare a distanza l’espressione genica agendo a livello post-trascrizionale.

Nobel Medicina 2013

James Rothman, Randy Schekman e Thomas Südhof per la scoperta dei meccanismi che regolano il traffico delle vescicole, uno dei più importanti sistemi di trasporto della cellula

POPOLAZIONE IN STUDIO: CARATTERISTICHE finanziato dai grant ERC europei) reclutati dal nostro Centro per l’Obesità e il Lavoro, con età media di 51 anni ( ± 14). SESSO BMI FUMO Maschi Femmine <25 Normale 25-30 Sovrappeso ≥30 Obeso Attuali fumatori Ex fumatori

Non fumatori N

106 106 105 105 105 106 106 106

FREQUENZA

32 74 3 36 66 13 40 53

%

30.2 69.8 2.9 34.3 62.9 12.3 37.7 50.0

COME SI ISOLANO LE MICROVESCICOLE?

Plasma EDTA

( 2X1.5ml

) - Centrifuga a 4 ° C 1000g X 15min 2000g X 15min 3000g X 15 min Ultracentrifuga a 4 ° C: 110000g X 75 min Risospeso in PBS (doppio filtrato 0.1µm) Pellet ultracentrifugato di MV

Immunofenotipizzazione Conta Dimensione

Estrazione miRNA

IMMUNOFENOTIPIZZAZIONE Parametri fisici : informazioni sul volume cellulare e densità/complessità delle MV. Parametri biologici: con uso di anticorpi coniugati a fluorocromi che emettono fluorescenza Anticorpi (Abs) MV da

PIASTRINE : CD61

MV da

NEUTROFILI: CD66

MV da MONOCITI: CD14

RISULTATI: MV E TIPI CELLULARI

Sottopopolazione MV variabile

indipendente Exp(β) MV CD66 +

(conta/µl)

Neutrofili

(migliaia/dl)

1.11 MV CD14 +

(conta/µl)

MV CD61 +

(conta/µl)

Monociti (migliaia/ml) Piastrine (migliaia/ml) 1.55 1.00 Modelli di regressione univariati (95% CI) 1.00; 1.24 0.49; 4.90 1.00; 1.01 Δ% 11 55 0.4 p-value 0.054 0.455 0.022

RISULTATI: FUMO E MV

Sottopopolazione MV Fumatori MV CD66+ (conta/µl) MV CD14+ (conta/µl) MV CD61+ (conta/µl)

Ex vs Attuali Non vs Attuali Ex vs Attuali Non vs Attuali Ex vs Attuali Non vs Attuali

Exp(β) (95% CI)

0.83 0.59 0.55 0.82 0.74 0.51; 1.33 0.37; 0.93 0.31; 0.97 0.41; 1.61 0.38; 1.43

Δ%

-17.4 -41.5 -45.2 -18.2 -26.1

Modelli di regressione multivariati aggiustati per età, sesso e BMI

p-value

0.424

0.023 0.041

0.558 0.363

DISCUSSIONE • I nostri risultati hanno mostrato come il fumo di sigaretta possa indurre modificazioni nel rilascio di microvescicole plasmatiche. • In particolare, la condizione di non fumatore rispetto a quella di fumatore mostra un minor rilascio di MV da neutrofili e monociti. • Tali studi verranno ampliati mediante una complementare analisi di espressione dei miRNA contenuti nelle MV.

IN PROGRESS • Analisi del profiling di espressione dei miRNA contenuti nelle MV di tutti i soggetti del progetto SPHERE (N=1000) attraverso la metodica dell’Openarray (QuantStudio™ 12K Flex -Real-Time PCR System). • Valutazione dell’associazione tra l’espressione dei miRNA e l’esposizione al particolato atmosferico (PM 10 ) e ai metalli ad esso associati.