Transcript Metodo del PAS - Morfologia umana e biologia applicata

Metodo del PAS
REAZIONE ACIDO PERIODICO-reattivo di SCHIFF
(PAS)
PRINCIPI SU CUI SI BASA LA REAZIONE
•Questa reazione fu introdotta in istochimica da Mc
Manus e successivamente elaborata da altri Autori
(Lillie, Hotchiss, Gomori)
•ha un valore fondamentale per l’istochimica dei
carboidrati
•Si basa sull’utilizzo di Acido Periodico e del Reattivo di
Schiff
Azione dell’acido periodico
•
•
l’acido periodico (HIO4), viene usato
come ossidante
attacca selettivamente i gruppi:
•1,2 glicolico
•vic-glicolico
•OH ossidrilico
glicogeno
glucosio
Azione dell’acido periodico

In conseguenza della ossidazione con acido periodico si
verifica:
◦ rottura di un legame fra due atomi di carbonio adiacenti
◦ Formazione di almeno un gruppo aldeidico a livello degli atomi di
carbonio che rimangono alle estremità della catena rotta
REATTIVO DI SCHIFF
• La presenza dei gruppi aldeidici che si sono formati viene
rivelata dal reattivo di Schiff
• Il reattivo proposto da Schiff nel 1866 è utilizzato per rivelare
gruppi aldeidici ed è di largo impiego in istochimica
• trova applicazione:
• nello studio dei polisaccaridi (reazione PAS)
• nello studio degli acidi nucleici (reazione di Feulgen)
• nello studio di alcuni lipidi e di alcune proteine
• Il reattivo di Schiff è un derivato della fucsina basica
• E’ un colorante (ottenuto dalla fucsina), il cui principale
costituente è rappresentato dalla pararosanilina
(triaminotrifenilmetano)
 Nelle
preparazioni commerciali di fucsina
basica sono contenute anche piccole
quantità di altre sostanze, (impurezze del
colorante) che possono condizionare la
possibilità di ottenere un buon reattivo di
Schiff
 Alcune industrie producono reattivo di
Schiff già pronto per l’uso
PREPARAZIONE DEL REATTIVO DI SCHIFF
Per preparare il reattivo di Schiff si utilizza una soluzione di fucsina basica 0,5%
in acqua; si aggiungono quindi l’l% di tiosolfato di potassio e 5 ml di acido
cloridrico 1N
 Queste ultime due sostanze reagiscono tra loro formando acido solforoso, che
in acqua è in equilibrio con l’anidride solforosa
 L’anidride solforosa si lega alla fucsina e causa la decolorazione della fucsina a
leucofucsina ( reattivo di Schiff)

pararosanilina
leucofucsina
Per completare la preparazione, si aggiunge alla soluzione del
carbone finemente tritato e si filtra, in modo da assorbire e
allontanare tutte le impurezze presenti nella fucsina basica
 Si ottiene un liquido limpido, incolore o paglierino, con odore
pungente di anidride (per la presenza di anidride solforosa in
eccesso)
 Se il reattivo presenta una sfumatura rosa non va usato
perché ciò indica la presenza di fucsina basica, che
colorerebbe i substrati basofili, togliendo specificità alla
reazione.
Azione del reattivo di Schiff
 Il reattivo di Schiff reagisce specificamente con i gruppi
aldeidici, formando legami covalenti con il carbonio
portatore del gruppo aldeidico e riacquistando colore (rosso
Magenta)
 Rende identificabili le sedi dei gruppi aldeidici medesimi
 La reazione è altamente specifica, tanto da essere usata
anche nei dosaggi chimici di molecole in soluzione

Perché la reazione risulti evidente è necessario
che:
•i gruppi da ossidare siano liberi
•il composto suscettibile di reagire con l’acido periodico
sia conservato durante le manipolazioni che precedono
la reazione
•i composti che si formano in seguito alla ossidazione
non siano diffusibili
•i gruppi aldeidici di questi composti siano in quantità
sufficiente per essere rivelati istochimicamente
la elettività della reazione può essere testata
mediante controlli
COME SI ESEGUE LA PAS REAZIONE
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Fissazione in Formalina, Carnoy, Zenker, Susa, Bouin ecc.
Disidratazione in etanolo, inclusione in paraffina
sparaffinatura in xilolo o composti analoghi
idratazione attraverso la serie degli alcoli discendenti fino all’acqua .
Ossidazione per 5-10 min in una sol. di ac. periodico 0,2 -1%.
Lavaggio in acqua corrente per 5-10 min
Passaggio delle sezioni nel reattivo di Schiff per 30-40 min
Lavaggio in acqua di fonte per 5-10 min
Colorazione dei nuclei con emallume di Mayer (ematossilina)
Disidratazione e montaggio in resina sintetica
Le sostanze reattive appaiono colorate in varie gradazioni di
rosso- violetto (magenta).