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Emoglobina (Hb): tetramero
(le globine si associano formando
due copie di dimeri αβ (α1β1 e α2β2)
che si associano a formare un
tetramero attraverso interazioni
idrofobiche, legami H e ponti salini
che si formano nell’interfaccia α1β1
e α2β2 e α1β2 e α2β1
Ogni globina α possiede 7 α-eliche
Ogni globina β possiede 8 α-eliche
Ogni globina ha una tasca
in cui lega un gruppo EME,
quindi l’Hb può legare e
trasportare 4 molecole di O2
2 catene globiniche α e
2 catene globiniche β
Graficamente la relazione esistente fra Y e pO2 è rappresentato da una CURVA DI
OSSIGENAZIONE SIGMOIDALE, infatti il legame Hb/O2 è di tipo COOPERATIVO.
a) L’AFFINITA’ DELL’Hb
PER L’OSSIGENO
AUMENTA MANO A
MANO CHE LE
MOLECOLE DI O2
OCCUPANO I GRUPPI
EME.
b) Esiste una cooperatività
positiva fra i siti di
legame dell’ossigeno
(fra i gruppi EME)
c) Il legame di 1 molecola
di O2 ad un gruppo
EME facilita il legame
di altre molecole di O2
agli altri gruppi EME
1,00
0.75
Y
Hb semisatura, con
minime variazioni di
pO2 si deossigena e
si ossigena quasi
completamente
Hb ad alta affinità,
raggiunge la saturazione
(STATO R)
0.50
0.25
Hb a bassa
affinità, poco
ossigenata
STATO T
p50 ~ 26 mm Hg, valore di
pO2 che satura il 50% dei siti
di legame dell’Hb
0.0
20,0
40,0
pO2 (mmHg)
60,0
80,0
Qual’è il vantaggio per un organismo vivente nel possedere una proteina
respiratoria che lega l’O2 in modo cooperativo?
pO2 presente nei
capillari tissutali
1,00
0.75
pO2 presente nei
capillari polmonari
Hb
Mb
Y
Hb
rilascia e lega efficientemente
l’ossigeno
0.50
0.25
0.0
20,0
40,0
60,0
pO2 (mmHg)
80,0
100,0
Il grado di ossigenazione della Hb dipende dalla pO 2 e dalla Kdiss
del complesso Hb(O2)4.
Hb + 4[O2]
Frazione di saturazione:
Hb[O2]4
La Frazione di saturazione è
legata alla pO2 e alla Kdiss
secondo la seguente
relazione:
[Hb(O2)4]
Y=
[Hb(O2)4] + [Hb]
n 4
pO
pO2 2
Y= 4
Y=
4n
n
p50 ++ pO
pO22
p50
Equazione di HILL
pO24
Y=
Kdiss+ pO24
Kdiss = p50n
Le diverse emoproteine (per es. le diverse varianti di Hb prodotte a causa di mutazioni)
possono avere un grado di cooperatività differente. Il termine “n” dà la misura della
cooperatività
pOn2
Y= n
n
p50 + pO2
La proteina è completamente cooperativa se il n° dei siti di legame è uguale al
coefficiente di Hill, cioè n = nH
Se l’Hb avesse nH = 4 vorrebbe dire che tutte le molecole di Hb sono o
completamente legate o completamente dissociate e il legame con l’O2 è
contemporaneo in tutti i siti.
In realtà in condizioni fisiologiche nH dell’Hb è ~ 3
1< nH <n >> la proteina è Cooperativa e subisce una transizione fra stato a bassa
affinità e stato ad alta affinità, per cui, nello stesso momento, avremmo una
miscela di molecole di Hb completamente ossigenate, altre non ossigenate e altre
parzialmente ossigenate.
nH = 1 >> Non cooperativa (Mb)
nH < 0 >> Cooperatività negativa
STATO T
Hb a bassa affinità
α1
β1
Transizione completa: quando sono occupati gli
ultimi siti ormai tutte le molecole di Hb sono nella
forma ad alta affinità
β2
α2
STATO R
ALTA AFFINITA’
+ O2
α1
β1
α1
β1
β2
α
α2 1
β1
β2
α
α2 1
β1
α1
β1
β2
α2
+ O2
β2
α2
Legame con la
molecola di O2 >>
cambia la struttura 3aria
della subunità legata
β2
α2
α1
β1
β2
α2
α1
β1
β2
α2
α1
β1
α1
β1
β2
α2
+ O2
β2
α2
+ O2
α1
β1
β2
α2
CON LA PARZIALE OSSIGENAZIONE (almeno un sito
occupato dall’O2 in ciascuno dei 2 dimeri αβ) L’INTERA
PROTEINA VA INCONTRO AD UNA MODIFICAZIONE DELLA
SUA STRUTTURA 4aria ASSUMENDO UNA STRUTTURA PIU’
DISPONIBILE AD ACCETTARE ALTRE MOLECOLE DI O2 .
La cooperatività di legame dell’emoglobina è possibile perché lo stato di
ossigenazione di un sito può essere comunicato agli altri siti attraverso
un cambiamento della conformazione proteica dell’Hb.
L’Hb passa da uno stato conformazionale a bassa affinità per l’O2
ad uno stato conformazionale ad alta affinità
in funzione della concentrazione di O2 (pO2).
IL LEGAME CON L’O2 MODIFICA LA STRUTTURA DELLA PROTEINA
DEOSSI-Hb >> stato T >> conformazione a bassa affinità
OSSI-Hb >> stato R >> conformazione ad alta affinità
PER PASSARE DALLO STATO A BASSA AFFINITÀ
A QUELLO AD ALTA AFFINITÀ L’ HB SUBISCE
UNA TRANSIZIONE ALLOSTERICA.
L’Hb è una proteina ALLOSTERICA.
L’Hb è una proteina ALLOSTERICA.
1) Ha più siti di legame per il suo ligando
1) Il ligando è un effettore omoallosterico: occupando uno dei siti di
legame della proteina influisce sull’affinità degli altri siti liberi
2) Il legame proteina/ligando causa sempre una modificazione della
struttura 3aria e anche della struttura 4aria della proteina che
modifica la sua affinità nei confronti del ligando stesso.
3) Ha siti di legame per altri ligandi che agiscono come molecole
regolatrici (effettori eteroallosterici) che influenzano l’affinità
della proteina verso il suo ligando
4) La modulazione e il legame proteina/effettori è sempre
REVERSIBILE
Il legame fra l’EME e l’O2 produce il cambiamento strutturale nella proteina.
EME
convesso
EME
appiattito
|||||
His93 F8
His64, E7
Deossi-Hb:
Il legame con l’His
prossimale trascina
il Fe2+ al di sopra
del piano dell’EME.
Ossi-Hb: Il Fe2+, è trascinato all’interno dell’EME per
effetto del legame con l’O2, nel muoversi si tira
dietro tutta l’elica F e i segmenti adiacenti rompendo
le interazioni che stabilizzavano lo stato T.
COSA SUCCEDE ALLA STRUTTURA DELLA EMOGLOBINA QUANDO AVVIENE LA
TRANSIZIONE T↔ R
LA DEOSSI-HB (STATO T) È
STABILIZZATA DA UNA
RETE
DI
LEGAMI
IDROGENO E INTERAZIONI
IONICHE INTRA- E INTERCATENA.
Ponti salini molto
importanti coinvolgono
l’His146 delle catene β che
interagisce con l’Asp94 e
con la Lys40 delle catene α
per mezzo del suo gruppo
carbossi-terminale
Lys C5
o 40
Asp FG1
o 94
His HC3
o 146
C-term.
Quando l’Hb inizia a ossigenarsi, il legame EME/O2 provoca un CAMBIAMENTO sia
DELLA STRUTTURA TERZIARIA sia DELLA QUATERNARIA: un dimero α/β ruota e
scivola rispetto all’altro dimero α/β , questo movimento distorce e indebolisce la rete
di legami H e ponti salini che stabilizza o stato T, le catene beta si avvicinano e si
restringe la cavità centrale
(146)
(146)
(146)
Nello stato R l’estremità C-terminale (His-146, HC3) delle catene β è
ruotato verso la cavità centrale e non può più formare ponti salini
Effettori allosterici dell’emoglobina
O2
H+ (pH)
CO2
2,3-bisfosfoglicerato
Regolano la transizione allosterica tra stato ad
alta affinità e bassa affinità, aumentando
l’efficienza dell’Hb nel rilasciare ossigeno ai
tessuti.
EFFETTO BOHR
TESSUTI
Hb · 4O2 + nH+
Hb · nH+ + 4O2
POLMONI
La diminuzione di pH nei capillari
abbassa l’affinità dell’Hb verso
l’O2 rendendone più efficiente il
rilascio.
La p50 sale a ~ 40 mm Hg
COME SPIEGARE IL MECCANISMO DELL’EFFETTO BOHR?
La DEOSSI-Hb ha un pI più alto della OSSI-Hb, lega gli ioni H+ con maggiore affinità.
L’Hb ha vari siti di legame per gli ioni H+ come:
1) ammino-gruppi N-terminali delle catene alfa
2) His 146 (residuo C-terminale delle catene β).
DEOSSI-Hb
-
+
COO- terminale delle
catene β
+
(catene β)
DEOSSI-Hb: His-146 (C-terminale
delle catene β) ha un pKa
anormalmente elevato (> 7.2).
Poiché nei capillari tissutali il pH
scende a ~6.8: l’His-146 si trova
nella sua forma PROTONATA e
forma un ponte salino intra-catena
con l’Asp 94, che stabilizza la forma T
deossi.
OSSI-Hb: il pKa dell’His 146 scende a ~6.5 a causa della
transizione dallo stato T a quello R
Nel pH del sangue circolante (7.2) o dei capillari polmonari
(7.6), l’His sarà quasi del tutto DEPROTONATA e non formerà
più il ponte salino. Questo contribuisce al cambiamento
strutturale che favorisce l’ossigenazione completa della Hb.
6
l14
―
C
C― l
O
¯ O
CH 2 H
l
N
C― + CH
N
C― H
H
H
l94
―
―C
l
CH 2
l
O
C=
l
O
H
ANIDRIDE CARBONICA (CO2)
La CO2 viene liberata nel circolo sanguigno a livello periferico durante i
processi metabolici cellulari. La CO2 è trasportata nel sangue in tre forme:
1) disciolta: obbedisce alla Legge di Henry come l'O2 ma è 20 volte più
solubile di questo. In questa forma costituisce il 10% del gas liberato dal
sangue venoso nel polmone.
2) Diffonde all’interno degli eritrociti dove:
CO2 + H2O
HCO3- + H+
il bicarbonato quando aumenta di
concentrazione diffonde dal
globulo rosso al plasma
scambiandosi con ioni Cl-
(ANIDRASI CARBONICA)
Gli ioni H+ si legano alla DEOSSIHb (che è meno acida della
forma ossigenata ed è quindi un
accettore di protoni migliore)
Contribuisce all’effetto BOHR e quindi al rilascio di O2
e aumenta la capacità del sangue di trasportare H+ e CO2 (effetto HALDANE)
3) La CO2 in parte si lega all’Hb alle estremità N-terminali libere
delle catene globiniche β formando CARBAMMATI = gruppi carichi
negativamente che stabiliscono interazioni elettrostatiche con i
residui di Arg-141 delle catene α stabilizzando la forma T
CONCENTRAZIONE CO2
Effettore allosterico negativo per l’Hb
1,00
0.75
Se la pCO2 diminuisce
l’affinità aumenta
(p50 + bassa)
Se la pCO2 aumenta
l’affinità diminuisce
(p50 + alta)
Y
0.50
0.25
0.0
20,0
40,0
60,0
pO2 (mmHg)
80,0
100,0
2,3-bisfosfoglicerato
È presente nel citoplasma degli eritrociti (ad
una concentrazione ~ 5 mM), dove si forma a
partire dall’1,3-bisfosfoglicerato (intermedio
della glicolisi)
È un effettore allosterico negativo, come gli
ioni H+ e la CO2.
Il 2,3-BPG si lega fortemente alla DEOSSI-Hb
stabilizzando la forma T.
Il 2,3-BPG si lega saldamente nella
cavità centrale dell’Hb fra le 4 catene
globiniche nell’Hb DEOSSIGENATA
stabilizzandola e riducendo l’affinità
per l’O2
α2
β1
+
-
+-
+
+
+
β2
α1
+
+
Il 2,3-BPG forma interazioni elettrostatiche con gruppi carichi positivamente che
sporgono nella cavità centrale della DEOSSI-Hb:
NH3+ N-terminale
ciò rafforza i ponti salini della
Lys-82
delle 2 catene β
forma T dell’Hb.
His-143
His-2
Quando l’Hb lega la prima molecola di O2 si innesca il cambiamento
conformazionale che distrugge i ponti salini, la cavità centrale si restringe e il 2,3BPG viene espulso.
Se negli eritrociti non ci fosse il 2,3-BPG la curva di ossigenazione
dell’Hb diventerebbe iperbolica, l’Hb legherebbe l’O2 in modo non
cooperativo
Il 2,3-BPG modula
l’ossigenazione dell’Hb in
funzione delle condizioni
ambientali
in alta montagna
>> basse pO2
adattamento alla
carenza di
ossigeno nei
Gli eritrociti aumentano la
tessuti.
produzione di 2,3-BPG,
>> diminuisce l’affinità
dell’Hb per l’O2 (aumenta la
p50)
>> aumenta il rilascio di O2 ai
tessuti che altrimenti non
sarebbero sufficientemente
ossigenati
Emoglobina fetale: α2γ2
Le catene γ hanno un residuo di Ser al posto dell’His-143, manca una coppia
di interazione ionica che stabilizza il complesso 2,3-BPG-deossiHb
Le mutazioni alterano la struttura
e la funzione dell'emoglobina
Sono state scoperte più di 1000 forme mutanti dell’Hb, spesso con 1 unica sostituzione
amminoacidica, non tutte le varianti emoglobiniche conducono a sintomi clinici.
ca il 5% della popolazione mondiale possiede almeno una variante emoglobinica
Eritrociti umani normali
Eritrociti umani falciformi
Nell’anemia falciforme viene prodotta Hb-S nella quale il residuo di Glu in
posizione 6 delle catene β è sostituito da un residuo di Val.
Nella Deossi-Hb-S questo residuo di Val costituisce un “punto
appiccicoso” esposto sulla superficie del tetramero, infatti va ad inserirsi
in una tasca idrofobica situata nelle subunità β di un altro tetramero: l’Hb
polimerizza, forma delle fibre insolubili
La deossiemoglobina S: la Val 6 mutante
interagisce con la Phe 85
Struttura di una fibra di deossiemoglobina S