Transcript lezione 19
Osteogenesi imperfetta La variabilità genetica umana e le sue conseguenze Capitolo 13 Dott.ssa Giorgia Chiatante Differenze esistenti tra le sequenze genomiche di DNA nei diversi individui della specie umana Ora che è disponibile la sequenza del genoma umano di alcuni individui, è possibile osservare che queste sequenze differiscono tra loro in mille modi La maggior parte delle differenze NON sembra avere alcun effetto VARIAZIONI NEUTRE Variazioni che influenzano il fenotipo generando la normale gamma di varianti che riguardano le caratteristiche che rendono ciascun individuo UNICO Es. struttura corporea, metabolismo, pigmentazione VARIAZIONI PATOGENICHE Tra le varianti, alcune possono essere responsabili di una malattia o far si che il portatore sia suscettibile a una malattia che un individuo può o meno contrarre a seconda dell’influenza di altri geni, dello stile di vita, dell’ambiente o semplicemente per caso Dott.ssa Giorgia Chiatante VARIAZIONI Cambiamento di un singolo gene Cambiamenti su PICCOLA scala Dott.ssa Giorgia Chiatante Cambiamento di alcuni o molti geni Cambiamenti su LARGA scala VARIAZIONI Quando si confrontano le sequenze genomiche di diversi individui, la maggior parte dei nucleotidi risultano identici in tutti i soggetti (in termini generali parliamo di genoma umano) Tuttavia, si possono osservare occasionalmente cambiamenti a livello di ogni nucleotide (rari) Circa 1/300 nucleotidi è POLIMORFICO, cioè presente nella popolazione in più di una forma POLIMORFISMI - Genetisti molecolari: una variante è polimorfica se è presente nella popolazione con una frequenza superiore ad una soglia arbitraria che generalmente è pari a 0,01 (1%). Es. polimorfismo: 2 alleli C e A con una frequenza di 0.93 e 0.07 rispettivamente Se la frequenza di un allele è inferiore all’1% allora si considera variante rara - Genetisti clinici: spesso usano il termine polimorfismo per indicare una variante non patogenica, a prescindere dalla sua frequenza. Dott.ssa Giorgia Chiatante POLIMORFISMI • SNP (polimorfismo di singolo nucleotide) • Indel (polimorfismi dovuti a delezioni o inserzioni di uno o più nucleotidi non ripetuti) • Sequenze intersperse (SINE, LINE): alcune inserzioni sono polimorfiche nel genoma umano in quanto presenti in alcuni cromosomi ma assenti in altre copie dello stesso cromosoma • Ripetizioni in tandem: le sequenze ripetute in tandem sono polimorfiche perché tra individui cambia il numero di unità ripetute • Microsatelliti: unità che si ripete è di 2-4 nucleotidi • Minisatelliti: unità che si ripete è di 10-50 nucleotidi • Satelliti: unità che si ripete è >50 nucleotidi (es. α-satellite: 171 bp) • Varianti su larga scala del numero di copie di sequenze ripetute in tandem • Variazione della dimensione della regione eterocromatica presenti nel centromero dei cromosomi 1, 9 e 16 e del braccio lungo del cromosoma Y • Dimensione e morfologia del braccio corto dei cromosomi acrocentrici • Siti fragili (segmenti di cromatina non superavvolta) • Varianti su larga scala del numero di copie di DNA non ripetitivo (CNV) Dott.ssa Giorgia Chiatante CNV (copy number variant): Fino a poco fa si riteneva che la delezione o l’inserzione di un lungo tratto di DNA non ripetitivo fosse causa di patologie, tuttavia l’avvento di nuove tecniche ha permesso di scandagliare il tutto il genoma alla ricerca di tratti mancanti o soprannumerari Nel genoma delle persone normali e apparentemente sane si possono ritrovare molte varianti anche di grandi dimensioni Es. nel 2006 Redon e i suoi collaboratori hanno identificato 1447 regioni contenenti un numero variabile di copie di sequenze con una lunghezza di almeno 1000 bp (12% del genoma umano, anche se attualmente è stata ridotta) e comprendevano numerosi geni noti. Dott.ssa Giorgia Chiatante Il DNA di individui sani ha un elevato numero di variazioni di sequenza, la maggior parte delle quali sono innocue (non sono noti effetti sul fenotipo) La maggior parte delle variazioni che ha effetti sul fenotipo fa parte delle normali variazioni che ci caratterizzano come individui Una speciale interesse rivestono le variazioni patogeniche, cioè quelle varianti che causano loro stesse le malattie o che ci rendono più suscettibili ad una determinata malattia Dott.ssa Giorgia Chiatante Come capire se un cambiamento della sequenza del DNA è patogenico? A. Dal momento che negli individui affetti sono presenti numerose variazioni così come succede nelle persone sane, l’unico modo per capire se il cambiamento è patogenico è effettuare un test funzionale Per molti prodotti genici non sono disponibili test di laboratorio che verifichino tutti gli aspetti della funzione genica in vivo. B. In mancanza di saggi funzionali risolutivi, possiamo dedurre se la variazione è patogenica analizzando la natura del cambiamento: Dove si realizza il cambiamento? • nella sequenza codificante • nelle sequenze che fiancheggiano la giunzione introne-esone (siti di splicing) • nella sequenza del promotore immediatamente a monte del gene • nelle sequenze regolatrici C. Un approccio alternativo è basato sulla ricerca di precedenti: • ricerca su dbSNP (banca dati delle rare varianti patogeniche) • ricerca su Decipher (banca dati delle variazioni patogeniche su larga scala) D. Analizzare le sequenze dei geni correlati (paraloghi e ortologhi) Dott.ssa Giorgia Chiatante Variazioni di un singolo nucleotide • • • • • Mutazioni MISSENSO Mutazioni NONSENSO Mutazioni FRAMESHIFT Mutazioni SILENTI Mutazioni DI SPLICING Dott.ssa Giorgia Chiatante Variazione di un singolo nucleotide: sequenza codificante / sequenza regolatrice Mutazioni MISSENSO La sostituzione all’interno della sequenza codificante NON altera la proteina codificata degenerazione del codice genetico Quando un cambiamento di codone dà origine a un cambiamento di aminoacido (cambiamento non sinonimo), gli effetti dipendono in parte dalle differenze chimiche esistenti tra il vecchio aminoacido e quello nuovo • Es. 4 classi di aminoacidi (acidi, basici, non carichi polari, carichi apolari) Sostituzione conservativa ha un effetto minore sulla struttura della proteina • Es. aggiunta di una cisteina altera la capacità della proteina di formare ponti disolfuro Aminoacidi cruciali per il corretto funzionamento di una proteina (presenti nel sito attivo di un enzima) o per il mantenimento della struttura proteica PREDIZIONE EFFETTI DI MUTAZIONE: • Conoscendo la struttura tridimensionale della proteina è possibile simulare le sostituzioni • Utili indicazioni si possono ottenere qualora sia disponibile la sequenza di proteine correlate (umane o di altri organismi) Dott.ssa Giorgia Chiatante Variazione di un singolo nucleotide: sequenza codificante / sequenza regolatrice Mutazioni MISSENSO Es. Proteine globulari (aminoacidi polari all’esterno, apolari all’interno) La mutazione che causa l’anemia falciforme è patogena in quanto determina la sostituzione di un amminoacido polare con un amminoacido apolare all’esterno della molecola della globina le molecole tendono ad aggregarsi e questo comporta la distorsione dei globuli rossi Dott.ssa Giorgia Chiatante Variazione di un singolo nucleotide: sequenza codificante / sequenza regolatrice Mutazioni NONSENSO 3 dei 64 codoni che costituiscono il codice genetico sono codoni di terminazione Quando i ribosomi incontrano un codone di stop si distaccano e l’mRNA e il polipeptide nascente viene rilasciato Tuttavia i geni mutati che contengo un codone di sto prematuro raramente portano alla produzione della proteina tronca che ci aspetterebbe l’effetto della mutazione nonsenso è quello di impedire del tutto l’espressione del gene coinvolto Meccanismo di degradazione mediata da codoni nonsenso (NMD) Dott.ssa Giorgia Chiatante Meccanismo di degradazione mediata da codoni nonsenso (NMD) L’mRNA che ha subito uno splicing tiene traccia della posizione degli introni (blocchi rossi), poi il ribosoma scorrendo rimuove tutti i blocchi rossi. Se c’è un codone di stop prematuro il ribosoma si stacca prima di aver raggiunto tutti i siti di giunzione. I blocchi persistono: è il segnale per avviare degradazione di questo mRNA Non sempre questo meccanismo di degradazione è completamente efficiente Capita a volte che una certa quantità di proteina tronca venga comunque prodotta RICORDA: Le proteine tronche sono potenzialmente più patogeniche della loro semplice mancanza Dott.ssa Giorgia Chiatante Variazione di un singolo nucleotide: sequenza codificante / sequenza regolatrice Mutazioni FRAMESHIFT Il modulo di lettura della traduzione è determinato dal codone di inizio AUG: ogni cambiamento a valle di questo codone che aggiunga o rimuova un numero non intero di codoni (cioè un numero di nucleotidi che non sia tre o multiplo di tre) provocano uno scivolamento del modulo di lettura Lo scivolamento della lettura di un filamento può generare la comparsa di un codone di stop Meccanismo di degradazione mediata da codoni nonsenso (NMD) L’inserzione della lettera in rosso ne altera completamente il significato Dott.ssa Giorgia Chiatante Variazione di un singolo nucleotide: sequenza codificante / sequenza regolatrice Mutazioni SILENTI I cambiamenti sinonimi sono quelle sostituzioni nucleotidiche che convertono un codone che codifica un particolare aminoacido in un altro che codifica anch’esso lo stesso aminoacido In linea teorica non dovrebbe esserci nessun effetto fenotipico ma a volte delle variazioni sono riscontrabili a livello proteico Es. Mutazioni silenti possono non essere completamente neutre, come nel caso del gene MDR1 che codifica per la glicoproteina P, responsabile del trasporto di molti farmaci. Una mutazione silente nell’esone 26 del gene (CT) porta alla produzione di una proteina che ha una sequenza aminoacidica immutata (Isoleucina vs Isoleucina) ma che si ripiega in maniera leggermente differente e ha un diverso profilo di attivazione PERCHÉ ? Il codone mutato utilizza un tRNA alternativo che scarseggia nella cellula e questo determinerebbe un cambiamento nella cinetica della traduzione Dott.ssa Giorgia Chiatante Variazione di un singolo nucleotide Mutazioni DI SPLICING Sono un insieme di quattro tipi di mutazioni che coinvolgono sequenze importanti per lo splicing del pre-mRNA. Una prima tipologia coinvolge il sito donatore di splicing (GT) o il sito accettore (di norma AG) A. La sostituzione GA causa il mancato riconoscimento della giunzione da parte dello spliceosoma e impedisce il processamento di quel sito B. Il cambiamento di un singolo nucleotide (CT) all’interno dell’introne 19 attiva un sito di splicing criptico Dott.ssa Giorgia Chiatante Variazioni di un singolo nucleotide • • • • • Mutazioni MISSENSO Mutazioni NONSENSO Mutazioni FRAMESHIFT Mutazioni SILENTI Mutazioni DI SPLICING Variazioni di più nucleotidi • Mutazioni DINAMICHE Dott.ssa Giorgia Chiatante Variazione di un più nucleotidi: sequenza codificante / sequenza regolatrice Mutazioni DINAMICHE Quando gli STRP (microsatelliti, ripetizioni brevi in tandem) superano una certa dimensione diventano altamente instabili Le malattie causate da ripetizioni nucleotidiche che si espandono in maniera instabile sono per molti aspetti eterogenee in quanto presentano unità ripetute di differenti dimensioni, caratterizzate da diversi gradi di espansione, con localizzazione diverse rispetto al gene colpito Es. Corea di Huntington: (CAG)n nella sequenza codificante iperespansione di glutammina Es. Distrofia miotonica di tipo 1: (CTG)n nel 3’ UTR porta alla formazione di un mRNA che è in grado di sequestrare le proteine nucleari necessarie per il corretto splicing di numerosi trascritti primari di molti geni non correlati tra loro Una caratteristica distintiva delle malattie causate da ripetizioni in dinamiche è l’anticipazione: nel corso delle generazioni, a causa di successive espansioni della ripetizione, l'età di insorgenza della malattia si abbassa e la gravità stessa della malattia aumenta Dott.ssa Giorgia Chiatante Variazioni di un singolo nucleotide • • • • • Mutazioni MISSENSO Mutazioni NONSENSO Mutazioni FRAMESHIFT Mutazioni SILENTI Mutazioni DI SPLICING Variazioni di più nucleotidi • Mutazioni DINAMICHE Variazioni che alterano il dosaggio di uno o più geni • Microdelezioni • Microduplicazioni Dott.ssa Giorgia Chiatante Variazioni che alterano il dosaggio di uno o più geni (microdelezioni / microduplicazioni) Il potenziale patogenico è dovuto ad un alterato dosaggio genico ma solo pochi geni sono effettivamente sensibili all’alterazione del dosaggio genico. Es. i caratteri distintivi della sindrome di Down sono dovuti principalmente all’errato dosaggio di due geni, DSCR1 e DSCR1A DELEZIONI vs DUPLICAZIONI Un notevole numero di geni mostra effetti fenotipici apprezzabili quando presente in dose dimezzata rispetto al normale, piuttosto che quando è presente in dose 1.5 volte superiore COME SI ORIGINANO? Dott.ssa Giorgia Chiatante Variazioni che alterano il dosaggio di uno o più geni (microdelezioni / microdplicazioni) Il potenziale patogenico è dovuto ad un alterato dosaggio genico ma solo pochi geni sono effettivamente sensibili all’alterazione del dosaggio genico. • Sindromi dovute a singoli geni Tutti gli effetti fenotipici sono dovuti alla delezione (a volte alla duplicazione) di un singolo gene • Sindromi dovute a geni adiacenti Si osservano principalmente in maschi con la delezione a carico della regione X • Sindromi da aneuploidia segmentale Sono un caso speciale di una sindrome dovuta a geni adiacenti che si presenta in maniera ricorrente con un fenotipo ben caratterizzato Es. microdel Hereditary neuropathy with liability to pressure palsies syndrome (HNPP) microdup Charcot–Marie–Tooth type 1A (CMT1A) Dott.ssa Giorgia Chiatante EFFETTI DELLE VARIAZIONI In patologia molecolare non conta tanto la sequenza dell’allele mutato quanto l’effetto che essa può avere. La mutazione produce una perdita o un acquisto di funzione? • mutazioni per perdita di funzione: il prodotto genico ha perso/ridotto la propria funzione • mutazioni per acquisto di funzione: il prodotto genico fa qualcosa di anormale in più Alcune patologie NON possono essere facilmente classificate come perdita o acquisizione di funzione Es. Un canale ionico che rimane sempre aperto ha perso la capacità di chiudersi o ha acquisito la capacità di aprirsi in maniera corretta? Il tipo di ereditarietà ci fornisce una prima indicazione circa la patologia molecolare che sta alla base di una mutazione Dott.ssa Giorgia Chiatante EREDITARIETA’ Acquisizione di funzione La presenza di un allele normale non dovrebbe essere in grado di impedire all’allele mutato di comportarsi in maniera anomala Perdita di funzione Nella maggior parte dei casi avere una determinata quantità di prodotto genico non è fondamentale La funzione alterata dovrebbe essere visibile negli individui eterozigoti Avere metà dose normale del prodotto genico è ben tollerato Produce fenotipo dominante Produce fenotipo recessivo* Dott.ssa Giorgia Chiatante *Due eccezioni: 1. Aploinsufficienza 2. Effetto dominanza negativa Nel caso in cui un fenotipo clinico sia causato da una perdita di funzione di un gene, è atteso che qualsiasi cambiamento che porti all’inattivazione dello stesso prodotto genico mostri lo stesso quadro clinico Al contrario, l’acquisizione di funzione è un fenomeno abbastanza specifico in cui probabilmente solo uno specifico cambiamento all’interno del gene può portare all’acquisizione di una nuova funzione ETEROGENEITA’ ALLELICA Acquisizione di funzione Perdita di funzione Patologie associate SEMPRE con lo stesso tipo di mutazione Patologie causate da mutazioni di diverso tipo all’interno del gene Es. Corea di Huntington Es. sindrome della X fragile Dott.ssa Giorgia Chiatante 1. Perdita di funzione: APLOINSUFFICIENZA La maggior parte dei prodotti genici NON è sensibile a variazioni di quantità del prodotto genico stesso Gran parte delle mutazioni per perdita di funzione determina fenotipi recessivi, il che significa che un individuo possiede una sola copia funzionante del gene ed è fenotipicamente normale In alcuni casi, tuttavia, un livello pari al 50% di quello normale NON è sufficiente per svolgere una funzione normale e, di conseguenza, persone eterozigoti per una mutazione per perdita di funzione mostrano un fenotipo che viene ereditato come carattere dominante Es. Sindrome di Waardenburg (perdita dell’udito e anomalie nella pigmentazione) Le mutazioni nel gene PAX3 che causano questa patologia sono svariate ma producono tutte lo stesso risultato clinico perdita di funzione Tuttavia questa sindrome è dominante ed è considerata una aploinsifficienza Dott.ssa Giorgia Chiatante 2. Perdita di funzione: DOMINANZA NEGATIVA Gli effetti della dominanza negativa forniscono un’altra spiegazione di come alcune mutazioni per perdita di funzione possano portare a un fenotipo dominante. Un individuo che presenta una mutazione X in un gene ha ancora il 50% del livello normale della funzione del gene, dato che ha ancora un allele normale perfettamente funzionante Ho dominanza negativa se il prodotto dell’allele mutato non solo non è funzionale ma interferisce con la funzione svolta dall’allele normale Il meccanismo di degradazione mediata da codoni nonsenso (NMD) si è probabilmente evoluto come strumento di protezione per i possibili effetti della dominanza negativa delle proteine tronche Sono particolarmente suscettibili agli effetti della dominanza negativa soprattutto le proteine che fanno parte di strutture multimeriche Dott.ssa Giorgia Chiatante Gly-X-Y le mutazioni che determinano la sostituzione della glicina hanno solitamente un effetto dominante negativo perché interferiscono con il ripiegamento della tripla elica OI severa: Riduzione della quantità delle catene funzionanti ben al di sotto del 50% OI moderata: La malattia è meno grave in quanto la semplice mancanza da parte del collagene ha effetti meno deleteri della presenza di catene alterate Dott.ssa Giorgia Chiatante Acquisizione di funzione: INVERSIONI E TRASLOCAZIONI Difficilmente una mutazione è in grado di fornire al prodotto genico una funzione radicalmente nuova l’unico meccanismo tramite il quale si possa acquisire una nuova è quello attraverso il quale si forma un gene chimerico • Traslocazione cromosomica • Inversione Gene chimerico: prodotto della fusione degli esoni appartenenti a due geni differenti I geni chimerici si osservano soprattutto nei tumori Dott.ssa Giorgia Chiatante Varianti geniche e suscettibilità Negli ultimi due anni sono state dimostrate numerose associazioni fra l’elevato/ridotto numero di copie per un certo gene e la suscettibilità̀ ad una specifica malattia Ad esempio il numero di copie di geni per le chemochine, delle proteine che attivano la funzione immunitaria, è molto variabile nella popolazione. Variabilità del numero di geni per la chemochina CCL3L1 Questa chemochina è il ligando più potente per il recettore CCR5, che a sua volta funge anche da co-recettore for l’HIV. Quando CCR5 è legato a CCL3L1, il virus non può entrare. È intuitivo che persone che producano numerose chemochine CCL3L1 sono protette dall’infezione da HIV Variabilità del numero di geni per CCL3L1 nelle diverse popolazioni, gli africani fra 5 e 7 copie, gli europei fra 1 e 3 Referenza: The Influence of CCL3L1 Gene-Containing Segmental Duplications on HIV-1/AIDS Susceptibility, 2005, Science; IF: 31.477 Dott.ssa Giorgia Chiatante Correlazione Genotipo-fenotipo A causa della complessità delle interazioni genetiche è molto difficile trovare una correlazione genotipo-fenotipo I più grandi successi riportati fino ad oggi sono la comprensione del cancro e delle emoglobinopatie PROBLEMI: I cambiamenti nella sequenza del DNA possono provocare perdite di funzione di diversa gravità • Mutazione può avere effetto nullo • Mutazione può eliminare completamente la funzione del gene • Una mutazione può essere presente in una o più copie del gene Spesso gli individui con malattie autosomiche recessive sono eterozigoti composti cioè hanno mutazioni diverse nei due alleli e, se le due mutazioni causano una perdita di funzione di diversa entità, l’allele meno severo determina il livello residuo di funzione genica Dott.ssa Giorgia Chiatante Perdita di funzione malattia recessiva Perdita di funzione aploinsufficienza Perdita di funzione malattia recessiva ma la sua gravità dipende dal livello di funzionalità genica residua Caso in cui le conseguenze cliniche sono diverse a seconda del livello residuo di funzione genica Dott.ssa Giorgia Chiatante Conclusioni • Abbiamo descritto i molteplici modi per cui il genoma di due individui può differire • La maggior parte di queste differenze è dovuta a cambiamenti di singoli nucleotidi (SNPs), alla presenza di sequenze variabili ripetute in tandem e a variazioni su lunga scala di sequenze ad elevato numero di copie • Lo studio della variabilità genetica offre un enorme vantaggio ai fini della comprensione della struttura della popolazione umana e delle relazioni esistenti tra le varie popolazioni • Alcune varianti, però, sono patogeniche e spesso sono molto difficili da studiare occorre considerare la variazione nel DNA e il fenotipo patologico DIFFICOLTA’: 1. Stabilire se la variante genica è o meno patogenica 2. Prevedere i sintomi clinici della malattia analizzando il cambiamento del DNA Dott.ssa Giorgia Chiatante