Transcript poster UZI 2010 S.Tricarico

Ultime novità nello studio dei tessuti connettivi mutabili
(MCTs): un approccio biochimico e biomolecolare in
Paracentrotus lividus
TRICARICO S.1, BURLINI N.2, DEL GIACCO L.3, GHILARDI A.3, BARBAGLIO A.1, BONASORO F.1,
CANDIA CARNEVALI M.D.1
Università degli Studi di Milano - Dipartimento di Biologia “Luigi Gorini” - Sezione di Zoologia e Citologia
1
Sez. Zoologia e Citologia - Dip. di Biologia - Università degli Studi di Milano, Via Celoria n°26, 20133 Milano, Italia; 2 Sez. Biochimica delle proteine - Dip. di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie - Università
degli Studi di Milano; 3 Sez. Functional and Reproductive Biology (FURBI) - Dip. di Biologia - Università degli Studi di Milano. tel. (+39)02.503.14796 fax (+39)02.503.14781 E-mail [email protected]
MCTs: MUTABLE COLLAGENOUS TISSUES
JLC type 2
Gli echinodermi posseggono un
Le principali componenti
peculiare tipo di tessuto connettivo
extracellulari degli MCTs sono
mutabile (MCT), in grado di andare
rappresentate da: fibrille di
incontro a rapidi cambiamenti delle
collagene, fibrillina,
proprietà meccaniche intrinseche,
proteoglicani e glicoproteine, in
mediati dal sistema nervoso, fenomeno
particolare stiparina e tensilina,
noto come mutabilità.
che modulano l’aggregazione
collagen
stiparin
Gli MCTs possono quindi
tensilin
fibrosurfin
delle fibrille collagene e le loro
tensilin inhibitor
proteoglycans
stiparin inhibitor
microfibrils
JLC type 1
rappresentare una preziosa fonte di
possibilità di slittamento
ispirazione per biomateriali dinamici Ipotesi sulla struttura e i fenomeni della mutabilità degli MCTs. In particolare due tipi di cellule neurosecretrici reciproco, stabilendo legami
indirizzati all'applicazione
applicazione biomedica
biomedica. (juxtaligamentali) sarebbero implicate nel rilascio della tensilina (tipo 2) e del suo inibitore (tipo 1). Modif. Wilkie,
interfibrillari reversibili.
2005.
MODELLO E SCOPO
Paracentrotus lividus,
La membrana peristomiale di P. lividus è
un'ampia area circolare di parete
corporea flessibile che circonda la bocca
e connette la lanterna alla teca
dermascheletrica. Va incontro a fasi di
irrigidimento e rilassamento reversibili,
comportandosi come un biomateriale
viscoelastico ed è un tipico MCT.
il nostro modello
sperimentale,
è un echinoide che,
come è stato
dimostrato, presenta
diversi esempi di MCT.
APPROCCIO BIOCHIMICO
APPROCCIO BIOMOLECOLARE
Caratterizzare una delle principali molecole ritenute responsabili delle proprietà
degli MCTs, la tensilina, allo scopo di testarne la proprietà di modulazione dello
stato di aggregazione sul collagene estratto.
Mettere a punto un protocollo di estrazione biochimica, di purificazione e
quantificazione del collagene estratto dalla membrana peristomiale di P.
lividus.
MATERIALI E METODI
ESTRAZIONE COLLAGENE (Matsumura, 1974)
•Estrazione dell’RNA dalla
membrana peristomiale e
retrotrascrizione in cDNA.
Membrana peristomiale in agitazione per due giorni in una soluzione
disaggregante (0.1 M Tris-HCl pH8.0, 0.2 M β-mercaptoetanolo, 0.5 M
NaCl, 0.05M EDTA-Na). Il campione viene filtrato, centrifugato due volte
a 10.000 g, dializzato e conservato a -20°C.
Questa metodica permette di estrarre il collagene sotto forma di fibre
intatte, facilitandone lo studio morfologico.
•Disegno di primers specifici nelle
regioni geniche di interesse.
QUANTIFICAZIONE (Taşkiran et al., 1999)
Il Sirius red F3BA è un forte colorante anionico che con i suoi gruppi acidi
sulfonici lega i gruppi basici del collagene. Il campione viene liofilizzato,
digerito con pepsina e colorato con una soluzione di Sirius red in acido
acetico 0.5 M. L’assorbanza viene letta a 540 nm contro acido acetico 0.5
M. Il saggio è calibrato usando il collagene di tipo I estratto da coda di ratto.
Disegno dei primers.
primers Primers degenerati sono
stati ottenuti allineando la sequenza nota della
tensilina dell’oloturia Cucumaria frondosa, e la
sequenza “predicted: similar to tensilin”
dell’echinoide Strongylocentrotus purpuratus.
•Utilizzo di opportune PCR
(polymerase chain reaction) per
l’amplificazione della sequenza.
•Clonaggio e sequenziamento.
RISULTATI
L’osservazione al TEM delle fibre di collagene
estratte e colorate con acido fosfotungstico ha
dimostrato l’efficacia del protocollo di estrazione
del collagene dal tessuto peristomiale di P. lividus.
La quantificazione spettrofotometrica mediante
colorazione con un colorante istologico, il Sirius red,
ha confermato i risultati del protocollo di estrazione.
Questa metodica di quantificazione verrà presto
messa a confronto con il classico test di
quantificazione dell’idrossiprolina, come ulteriore
conferma della sua efficienza.
300 nm
600 nm
50 µm
STD con pepsina
1,4
da R.V. Krstić
Sono stati ottenuti risultati preliminari nella ricerca della
tensilina per via biomolecolare in P. lividus. Infatti, sono state
trovate sequenze la cui funzione è però ancora da verificare.
1,6
1,2
528 WL nm
300 nm
Il tessuto peristomiale
trattato con 0.1 N
Cellule
NaOH si presenta più
lasso, in seguito alla
rottura dei legami crosslink tra proteoglicani.
Matrice
extracellulare Campione
in figura
e collagene
colorato con metodica
Tricromica di Milligan.
STD con
pepsina
1
0,8
Estrazione
Matsumura
0,6
0,4
Lineare
(STD con
pepsina)
0,2
0
0
10
20
30
40
Type I collagen g/ml
50
CONCLUSIONE
Questo lavoro mostra dei risultati preliminari e pone le basi per uno studio più
approfondito delle diverse componenti degli MCTs.
Infatti, è in corso un progetto di ricerca finanziata dalla Fondazione Cariplo volto allo
studio e all’isolamento biochimico delle singole componenti strutturali e delle molecole
responsabili delle proprietà degli MCTs, con lo scopo ultimo di “mimarne” struttura e
funzione in materiali biosintetici.
Invece, è stata confermata la sequenza “predicted: similar to
tensilin” dell’echinoide Strongylocentrotus purpuratus. Questo
incoraggia la continuazione della ricerca in P. lividus.