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CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2011-12 Titolare del corso: Adriana Maggi LEZIONE 9 Ingegneria cellulare 2 Metodi di manipolazione del genoma cellulare Valeria Benedusi Vettori virali: • • • • • • • • • Retrovirus Lentivirus (derivati da HIV) Adenovirus Virus adeno-associati Herpesvirus Vettori non virali: Plasmidi nudi Elettroporazione in vivo Liposomi Amine, proteine cariche positivamente Vettori virali Infezione con vettori virali I virus si sono evoluti per trasferire il loro DNA nelle cellule in maniera efficiente e specifica Infezione Lisi Iniezione del DNA Assemblaggio Replicazione Sintesi del capside Vettori virali • Si ottengono inserendo il gene di interesse nel genoma di diversi tipi di virus, sotto il controllo di un promotore forte. •In genere vengono introdotte modifiche in modo da rendere il virus incapace di riprodursi autonomamente. Questo è importante per evitare la diffusione di virus ricombinanti •Il principale vantaggio consiste nell’elevata efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule). Vettori virali Il genoma virale deve essere modificato Inserimento del gene di interesse Eliminazione dei “late genes”, codificanti per il capside, in modo da evitare la lisi della cellula infettata Virus difettivi Per la produzione del vettore virale si rendono necessarie coinfezioni con i virus “helper” oppure riproduzione in “packaging cell lines” (linee cellulari capaci di complementare i difetti introdotti nel virus) Packaging cell lines Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni. La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del costrutto nel virione. Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo. Vettori virali Vantaggi: Alta efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule) Possono essere specifici per una tipologia cellulare (minore risposta immunitaria e minori effetti off-target in vivo) Replicano naturalmente in colture cellulari Svantaggi: Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite Mutagenesi inserzionale (se integrazione casuale) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati Vettore ideale: tropismo per specifiche tipologie cellulari minima trasduzione di cellule off target alta efficienza di trasduzione durata dell’espressione che permetta massimo effetto No risposta immunitaria o patogenesi Vettori virali Vettore virale Retrovirus Lentivirus Adenovirus Vantaggi Svantaggi Capacità d'inserimento del gene, Difficoltà nel controllare l'infezione integrazione stabile nel DNA virale, mancata infezione delle dell'ospite, elevati titoli di virus cellule non in divisione, ricombinante, ampio tropismo integrazione a caso nel genoma (Mutagenesi inserzionale) d'infettività, relativa facilità di dell'ospite manipolazione del genoma virale Infezione delle cellule in divisione o meno, espressione stabile del gene, elevata capacità d'inserimento Mutagenesi potenziale presenza di sequenze proteiche regolatrici e accessorie Affinità per diverse tipologie cellulari Elevati titoli di virus, alta espressione genica, grande capacità d'inserimento, infezione di cellule in divisione e non in divisione Risposte immuni alle proteine virali, nessuna integrazione nel genoma dell'ospite, espressione genica transitoria Virus adeno-associati Infettano le cellule in divisione o meno, Limitate capacità per i transgeni, ampio tropismo cellulare, potenziale difficile generazione di alti titoli virali, d'integrazione, bassa immunogenicità e presenza di adenoviruds o herpevirus non patogenicità per la moltiplicazione dei virus adenoassociati Herpesvirus Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, Possibile tossicità, rischio di alta capacità d'inserzione, tropismo ricombinazione, nessuna integrazione naturale per le cellule neuronali, seguita virale nel DNA dell'ospite dalla produzione di alti titoli virali Poxvirus Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione di grandi framenti di DNA, alti livelli di di espressione transgenica,, Possibile effetto citopatico Retrovirus (genoma a ssRNA) Ciclo vitale dei Retrovirus dsDNA non passa attraverso i pori nucleari, quindi integrazione avviene solo quando la cellula si sta dividendo Retrovirus • virus con envelope • genoma di 10 Kb costituito da una molecola di RNAss • dopo l’infezione il genoma è retrotrascritto a DNAds • integra nel genoma dell’ospite (possibile mutagenesi) • infetta solo cellule in divisione LTR gag pol • gag: codifica per le proteine del core • pol: codifica per la trascrittasi inversa • env: codifica per le proteine dell’envelope • LTR: long terminal repeat, comprendono promotore/enhancers e sequenze necessarie per l’integrazione • : sequenze per il packaging env LTR Vettori retrovirali Per costruire un vettore retrovirale è necessario rimuovere i geni codificanti per gag (core virale), pol (trascrittasi inversa e integrasi) e env (involucro virale). Si ottiene così lo spazio per l’inserto di DNA ma la replicazione virale può verificarsi solo nelle “packaging cell lines” o in presenza di virus helper Packaging cell lines Virus helper Le proteine virali necessarie per l’infezione iniziale vengono fornite in trans da virus helper Vettori retrovirali Vantaggi: Non provocano malattie umane Scarsa risposta immunitaria Lunghezza inserti di DNA ≤8 kb Integrazione stabile nel DNA dell’ospite (transgene può essere espresso per tutta la vita dell’ospite) Ampio tropismo Alta efficienza di trasduzione Svantaggi: Incapacità di infettare cellule quiescenti Integrazione casuale nel genoma dell’ospite (mutagenesi inserzionale oncogenesi) Vettori retrovirali Applicazioni Riparazioni ossee: vettori retrovirali usati per inviare fattori di crescita e di differenziamento a cellule ossee mature o cellule staminali Riparazione cartilagine Clinical trial per trattamento X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) infezione di cellule ematopoietiche con vettori retrovirali contenenti gene per IL2Rg miglioramento funzionalità linfociti T Virus HIV Lentivirus (genoma a ssRNA) Sono una classe di retrovirus Il più comune lentivirus è l’HIV e il più comune vettore lentivirale viene costruito da questo virus. Per la costruzione del vettore i geni codificanti per gag, pol, env e per altri geni regolatori e accessori vengono deleti e inseriti in plasmidi helper (come per i retrovirus) Vettori lentivirali Vantaggi: Infezione di cellule in divisione o quiescenti lunghezza inserti di DNA di dimensioni ≤8 kb Espressione stabile del gene Integrazione stabile nel DNA dell’ospite (espressione del transgene per tutta la vita dell’ospite) Non vengono inattivati dal complemento Espressione duratura Svantaggi: Integrazione casuale nel genoma dell’ospite (mutagenesi inserzionale) Patogenesi Difficili da coltivare Vettori lentivirali Applicazioni Grazie alla loro capacità di veicolare grossi geni vengono usati per la produzione di animali transgenici con espressione tessuto-specifica del transgene Utilizzati in cellule quiescenti (neuroni o cellule cardiache) Primo trial approvato –> Anti-HIV RNA therapy Adrenoleucodistrofia Morbo di Parkinson Beta-talassemia Cancro Adenovirus (genoma a dsDNA) • virus senza envelope, struttura icosaedrica regolare • genoma di 36 Kb costituito da una molecola di DNAds • il genoma è fiancheggiato da sequenze ITR (inverted terminal repeats) che servono come origine di replicazione • dopo l’infezione il virus entra nel nucleo della cellula ospite e viene replicato • non si integra nel genoma dell’ospite (resta episomale) • infetta sia celule in divisione che non • dotato di ampio tropismo Adenovirus Trascrizione DNA virale: Early phase: trascritti geni che portano la cellula ospite nella fase S della mitosi e ne inibiscono apoptosi, codificano per DNA Pol e altre proteine necessarie per replicazione DNA virale e inibiscono risposta cellulare all’infezione Geni deleti nella generazione di vettori virali Late phase: replicazione DNA virale, assemblaggio nuove particelle virali e rilascio tramite lisi della cellula ospite Geni Early (E) e geni Late (L) 3’ 5’ E1a E1b L1 L2 L3 L4 E2b E2a E3 L5 E4 • E1A: coinvolto nell’attivazione della trascrizione e nella promozione dell’entrata della cellula ospite in fase S (lega Rb inducendo il rilascio del fattore di trascrizione E2F) • E1B: blocca azione di p53, evitando entrata della cellula in apoptosi • E2: codifica per 3 proteine coinvolte nella replicazione del DNA e nella modulazione della trascrizione (DNA-pol; proteina terminale e DNA-binding protein) • E3: modula la risposta immunitaria • E4: regola la trascrizione, la transizione dell’espressione da early a late gene, la replicazione virale e l’assemblamento dei virioni • • L1-5: coinvolti nella produzione e nell’assemblaggio delle proteine del capside Vettori adenovirali: helper dipendenti Generati sostituendo i geni E1a e E1b con il transgene di interesse, posto sotto il controllo di un elemento enhancer e di un promotore. Il vettore così ottenuto è replicazione-difettivo e le funzioni replicative vengono fornite in trans da un virus helper (privato della sequenza e di E1) . Il vettore è cresciuto in E1-expressing cell-lines (es. cellule 293A che presentano una copia del gene E1 integrata stabilmente). Vettori adenovirali: gutless Vettori adenovirali helper-dipendenti di generazione: sono vettori ad alta capacità. nuova Sfruttano il fatto che tutte le proteine adenovirali possono essere complementate in trans, quindi quasi tutta la sequenza codificante può essere sostituita dal transgene che può avere dimensioni comprese tra 100 b e 36 Kb. Le uniche sequenze essenziali in cis sono le ITRs e la sequenza . PRODUZIONE DI VETTORI GUTLESS 1. 2. 3. Vettore virale: contiene solo sequenze ITRs e + la cassetta di espressione del trangene Cellule di packaging (293): esprimono gene E1 Virus Helper: E1-deleto, privo di sequenza . Fornisce elementi strutturali Vettori adenovirali Vantaggi: Produzione di elevata quantità di virus Esprimono ad alti livelli Lunghezza inserti di DNA ≤8 kb, fino a 36 kb per i gutless AV Infezione di cellule in divisione e quiescenti Ampio tropismo Sicuri (non integrano nel genoma) Svantaggi: Risposta immunitaria Espressione genica transitoria Vettori adenovirali Applicazioni Cancro vettori esprimenti geni oncosoppressori come p53 o p16 alle cellule tumorali Suicide therapy usa proteine virali per metabolizzare farmaci non tossici a farmaci tossici Es: Cancro alla prostata: Adenovirus codificante per nitroreduttasi batterica in combinazione con profarmaco CB1954 Patologie del fegato siRNA contro PAI-1 nella fibrosi epatica Differenziamento cellule staminali AIDS Patologie cardiovascolari Tubercolosi Virus adeno-associati (genoma a ssDNA) • capside icosaedrico • no envelope • genoma fiancheggiato da sequenze ITRs, che contengono la sequenza di packaging • solo due tipi di geni: cap (proteine del capside) rep (proteine necessarie per la replicazione e l’integrazione) • per replicare necessita della presenza di un adenovirus o di un Herpes simplex virus (virus helper) • in assenza di AV o HSV, i virus AAV integrano stabilmente nel genoma della cellula ospite con un’alta frequenza, in una regione precisa del cromosoma 19 (19q 13,3q-ter) • una successiva superinfezione con AV o HSV attiva la replicazione del virus integrato Virus adeno-associati Per la costruzione di vettori virali vengono deleti geni Rep e Cap (necessari per replicazione DNA e assemblaggio capside) per creare spazio all’inserto di DNA esogeno. Queste proteine necessarie vengono espresse da un plasmide coinfettato, eliminando la necessità di coinfettare la cellula con Adenovirus helper Vettori virali adeno-associati • Il vettore: è costruito sostituendo il transgene a Cap e Rep, in quanto le sequenze ITRs contengono tutte le informazioni necessarie per l’integrazione e per il packaging. • Le cellule di packaging: linea cellulare 293 transfettata con un plasmide contenente i geni cap e rep e successivamente infettata con un adenovirus helper difettivo per E1 e privo della sequenza . Recentemente è stato sviluppato un nuovo sistema di produzione: il virus helper è sostituito con un plasmide mini-Ad (contiene parte del genoma di adenovirus) Vettori virali adeno-associati Vantaggi: non patogeni per l’uomo Ampio tropismo Alta efficienza di trasduzione Infezione di cellule in divisione o quiescenti Mantiene alti livelli di espressione in vivo (anni) Integrazione sito-specifica nel genoma Prodotti in grosse quantità Svantaggi: Lunghezza inserti di DNA ≤4,1-4,9 kb non è in grado di replicarsi senza assistenza di virus helper (Es. Adenovirus) o Herpes virus Vettori adeno-associati Applicazioni Adatti per ingegneria tissutale perché stabili in diversi tessuti fino a 1 anno (cervello, muscolo, occhio) Diversi sierotipi hanno diverse proteine del capside che conferiscono specificità tissutale: Es: AAV1 muscolo AAV6 polmone AAV7 fegato Sierotipi mosaico: combinazione di diversi vettori AAV Trials per terapia genica Patologie monogeniche e cancro Fibrosi cistica aerosol con vettore AAV contenente regolatore transmembrana della Fibrosi cistica Herpes simplex virus Vantaggi: (genoma a dsDNA) Tropismo per cellule neuronali Lunghezza inserti di DNA di 30-100 kb Possibilità di produrre alti titoli virali Svantaggi: Tossicità Rischio ricombinazione Mancata integrazione nel genoma dell’ospite Inizialmente effettua un’infezione produttiva nelle cellule epiteliali (ciclo litico), risale poi attraverso le terminazioni dei nervi sensoriali fino ai gangli dorsali. Qui stabilisce un’infezione latente (non necessita di espressione genica). Il ciclo litico viene riattivato periodicamente: le nuove particelle virali vengono trasportate con trasporto anterogrado e provocano lesioni a livello epiteliale 1. DISABLED HSV VECTORS Virus ricombinanti ottenuti eliminando uno o più geni precoci immediati. Vengono prodotti in cellule di packaging che complementano i geni mancanti. Vettori di ultima generazione: prodotti eliminando il gene che codifica per la glicoproteina-H di HSV-1 e cresciuti in una linea cellulare che complementa questa proteina. I virus ottenuti sono infettivi, ma possono effettuare un solo ciclo di infezione. 2. AMPLICON HSV VECTORS Si usa un amplicone, un plasmide contenente: • un’origine di replicazione batterica (generalmente da Escherichia coli), • un’origine di replicazione di HSV-1 (OriS) • la sequenza di packaging di HSV-1 • il transgene Il tutto viene inserito in una linea cellulare infettata da un virus helper contenente i geni regolatori e strutturali mancanti. Baculovirus Vantaggi: (genoma a dsDNA) Non patogeno e non tossico Incapace di replicare in cellule di mammifero Si degrada nella cellula ospite col tempo Non immunogenico: poiché in natura infetta insetti e invertebrati, l’uomo non ha anticorpi o linfociti T contro questo virus Lunghezza inserti di DNA ≤ 30 kb Svantaggi: Rapida inattivazione da parte del sistema del complemento (vettore ricoperto con Polietilenimine per proteggerlo) Molto utilizzato in studi su animali per veicolare geni a diverse tipologie cellulari e per la produzione di proteine ricombinanti in insetti, sarà oggetto di futuri studi Poxvirus (genoma a dsDNA) A questo gruppo appartiene il virus del vaiolo Tra i primi virus animali usati per costruire vettori per gene transfer Replicazione del genoma nel citoplasma e non nel nucleo Vantaggi: Incapacità di replicare nelle cellule umane (linee MVA e NYVAC) Lunghezza inserti di DNA ≤ 25 kb Alti livelli di espressione Svantaggi: Possibile citossicità Poxvirus Applicazioni Studiati come vettori virali per suscitare risposta immunitaria in patologie diventate resistenti ai farmaci Cancro utilizzati per veicolare antigeni alle cellule tumorali che ne permettano il riconoscimento da parte del sistema immunitario Vantaggi dei vettori non virali • • • • Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni Riduzione del rischio di reazione immunitaria Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo Svantaggi dei vettori non virali • • Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale Vantaggi dei vettori virali • Alta efficienza di trasduzione Svantaggi dei vettori virali • • • • • Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA • Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato). • Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina terapeutica (a livelli adeguati). • Capace di incorporare DNA di varie dimensioni. • Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o post-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico • Non dovrebbe essere patogeno. • Somministrabile direttamente nel paziente. • In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio. • Ben tollerato. • Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune. • Facile da produrre in maniera riproducibile. Integrazione di DNA esogeno nel genoma cellulare Gene trapping ( integrazione casuale nel genoma di un costrutto contenente un gene reporter (entrapment vector)) Gene targeting (integrazione sito-specifica mediante ricombinazione omologa) Gene Trapping Vector Endogenous gene X Promotore ASSENTE P' neo lac Z SA Introne gene X Vector Integration SA DNA lac Z neo lac Z neo Spliced transcript SA RNA protein PROTEIN X β-gal Promotore e pA INDIPENDENTI NeoR Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE pA pA Gene Trapping Il GENE TRAPPING consente 1)Identificazione NUOVI GENI 2)Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO) 3)ANALISI dell’ESPRESSIONE di GENI GENE TARGETING Mutagenesi MIRATA mediante ricombinazione omologa in cellule ES Permette la creazione di una mutazione in un gene PREDETERMINATO Questa mutagenesi può avere come risultato: 1) INATTIVAZIONE dell’espressione di un gene (KNOCK-OUT) 2) DIMINUZIONE dell’espressione di un gene (KNOCK-DOWN) 3) INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (correzione) (KNOCK-IN) IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA La ricombinazione omologa è il processo alla base della integrazione sito specifica Es. di gene targeting DNA esogeno DNA genomico vettori utilizzati per GENE TARGETING 1) VETTORI DI INSERZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-OUT) Gene di interesse M: marker esterno alla regione omologa Singolo evento di ricombinazione Distruzione del locus genico: KO 2) VETTORI DI SOSTITUZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-IN) Gene di interesse M: marker interno alla regione omologa Doppia ricombinazione Sostituzione di parti del locus genico 1) Per correggere un gene 2) Per produrne forma inattiva C9H13N5O4 peso molecolare: 255.23 Gancyclovir, un analogo della 2-deossi-guanosina che puo’ essere fosforilato ad un analogo della deossi-guanosina trifosfato (dGTP) da parte dell’enzima timidina chinasi di Herpes simplex. Venendo incorporato nel DNA al posto della dGTP inibisce per competizione l’incorporazione di dGTP da parte della DNA polimerasi virale, portando alla terminazione dell’elongazione del DNA virale. GENE knock-out; GENE Knock-in neor A tk Integrazione random A* A neor neomicina A neor gancyclovir neor A Cellule resistenti sia alla neomicina che al gancyclovir A neor tk neomicina A neor gancyclovir neomicina tk Cellule uccise dalla neomicina Regioni di omologia Cellule resistenti alla neomicina, uccise da gancyclovir Tk = timidina kinasi Timidino chinasi Blocca sintesi purine e pirimidine Nucleotidi: Biosintesi ex novo o “salvataggio” L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio Mutanti tk- non sopravvivono in terreno HAT (contenente ipoxantina, aminopterina e timidina) se la via di salvataggio non è praticabile 5-fosforibosil-1pirofosfato Uridina monofostato AMINOPTERINA Timidina monofostato Inosina monofostato Guanina monofostato Ipoxantina Adenina monofostato Timidina 3. Modalità di trasfezione Transfezione transiente o stabile Tecnologia per la transfezione Transfezioni transienti o stabili Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della cellula transfettata. Serve marcatore dell’efficienza di transfezione. A ogni mitosi raddoppiano le cellule e si dimezza la quantità di DNA trasfettato in rapporto alle cellule che viene perso dopo pochi cicli replicativi Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza di una adeguata pressione selettiva (gene marcatore che conferisce alla cellula la capacità di crescere in un terreno selettivo) viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura duplicandosi con il genoma cellulare. La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-4, 10-6 sul totale delle cellule transfettate Transfezione stabile Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50% delle cellule contengono il DNA esogeno. In seguito, a causa della degradazione e della diluizione, le cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo perdono. Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare una pressione selettiva, utilizzando un apposito marker di selezione. Marcatori di selezione per cellule di mammifero ENZIMA FARMACO MECCANISMO Aminoglicoside fosfotransferasi (APH) G418 (Inibitore sintesi proteica) APH inattiva G418 Diidrofolato reduttasi (DHFR) Metotrexate (Inibisce DHFR) Variante resistente DHFR Igromicina fosfotransferasi (HPH) Igromicina B (Inibitore sintesi proteica) HPH inattiva igromicina Adenosina deaminasi (ADA) 9-b-D-furanosil (Xyl-A) (danneggia DNA) Inattiva Xyl-A Xantina-guanina fosforibosil transferasi (XGPRT) Acido micofenolico (Inibisce sintesi GMP) XGPRT sintetizza GMP Timidina chinasi (Tk) Aminopterina (Inibisce sintesi timidina-P) Tk fosforila la timidina Transfezione transiente - applicazione Studio della regolazione dell’espressione genica con sistemi reporter Studio dei meccanismi di trasduzione del segnale Identificazione di molecole attive su enzimi o recettori Studi di correlazione struttura attività di mutanti Transfezione stabile - applicazioni Generazione di linee cellulari con caratteristiche specifiche per la produzione di biofarmaci o lo screening di molecole farmacologicamente attive. Servono markers specifici per poter selezionare le cellule transfettate