Transcript download pdf

MINISTERIE VAN MIDDENSTAND EN LANDBOUW
Bestuur voor Onderzoek en Ontwikkeling
RIJKSSTATION VOOR ZEEVISSERIJ (CLO-GENT)
Oostende
Snelle detectie
van histamine in
visserijproducten
met dunnelaagchromatografie
W. V Y N C K E
M ededelingen van het Rijksstation voor Zeevisserij (CLO Gent)
Publicatie nr. 243 - D/1997/0889/2
MINISTERIE VAN MIDDENSTAND EN LANDBOUW
Bestuur voor Onderzoek en Ontwikkeling
RIJKSSTATION VOOR ZEEVISSERIJ (CLO-GENT)
Oostende
Snelle detectie
van histamine in
visserijproducten
met dunnelaagchromatografie
W. V Y N C K E
M ededelingen van het Rijksstation voor Zeevisserij (CLO Gent)
Publicatie nr. 243 - D/1997/0889/2
S am en vattin g
D e sn elle sc reen in g test m aakt gebruik van H P T L C K ie selg e lp la te n m et ais
loopm iddel b e n z ee n /trie th y la m in e (80/20). A is ex tra ctiem id d el kan m ethanol,
trich lo o razijn zu u r o f p erch lo o rzu u r w orden gebruikt. H et g eëx trah e e rd e histam ine
w ordt v o o ra f g ed an sy leerd . D e ontw ikkelingstijd b edraagt 20 m in. D e identificatie
geschiedt o n d e r U V -lic h t (366 nm ). D e gevoeligheid van de m eth o d e is 5 m g/100 g,
hetgeen v o ld o en d e is d aar de w ettelijke lim iet 10 m g /1 0 0 g bed raag t. D e test is
bruikbaar zo w el op o n b eh an d eld e ais op verw erkte vis (bv. in o lie o f saus).
1
1. I N L E I D I N G .
T ijd e n s de o p sla g van pelagische vissen, h o o fd za k e lijk
m akreelachtigen,
k u n n en b a c te rië n h e t v rije am inozuur histidine, dat in d eze v issen overv lo ed ig
v o o rh an d en is, d o o r d ecarb o x y lerin g in histam ine o m zetten. D it is vooral h et geval
w anneer de v is g e d u re n d e een zekere tijd aan te hoge te m p e ra tu re n w erd blootgesteld.
H istam ine is to x isc h en de v orm ing van dit biogeen am ine d ie n t d an ook v erm ed en te
w orden d o o r g e p a ste voo rzo rg sm aatreg elen tijdens de b e w e rk in g en de opslag v an de
vis (P an en Ja m e s, 1985).
H ista m in e v o rm in g dient gecontroleerd te w orden. D e E U heeft in een
h y g iën e ric h tlijn n o rm e n vastgelegd voor de h ista m in e co n c e n tra tie (zie bijlage). O p
negen m o n ste rs m ag de g em iddelde concentratie de 10 m g /1 0 0 g niet overschrijden.
T w ee m o n ste rs m o g e n m ax im u m 20 m g/100 g bevatten (E U , 1993).
V o o r a c cu ra te en reproduceerbare resultaten is v lo eisto fch ro m ato g rafie
aangew ezen. H ie rv o o r kan atm osferische scheiding op k o lo m gevolgd door
d eriv atiserin g m e t o -p h talald eh y d e (O PA ) w orden to eg ep ast. D it is een van de
officiële m e th o d e n v a n de A O A C (H elrich, 1990). M eestal e c h te r w ordt h o gedrukch ro m a to g ra fie (H P L C ) gebruikt. H iervoor w ordt v oor o f n a de scheiding van
h istam ine e e n d e riv a tise rin g toegepast. In de m eeste g e v a lle n b etreft bet hier
d an sy lch lo rid e (M ie tz en K arm as, 1977), O P A (V id al-C a ro u et al., 1990) o f
b e n z o y lc h lo rid e (Y en en H sieh, 1991).
R e c e n te lijk w e rd ook de im m uno-enzym atische d e te c tie van histam in e
voorgesteld. C o m m e rc ië le testkits zijn hiervoor beschikbaar. D e z e m eth o d en blijk en
evenw el n o g r e la tie f o m sla c h tig te zijn (Etienne et al., 1995)
V o o r sn el, o riën teren d sem i-k w an titatief on d erzo ek k an
d u n nelaagchrom ato g rafie (D L C ) w o rd e n toegepast. N a scheiding m et d iv e rse lo o p m id d elen w ordt
h istam ine m e e sta l c o lo rim e trisc h m et ninhydrine ( L in et al., 1977 ; L ieber en T aylor,
1978) o f flu o rim e trisc h n a derivatisering m et O P A bepaald (A u re s et al., 1968).
N a g u ib et al. (1995) stelden recentelijk een b id im e n sio n a le D C L -m eth o d e
v o o r w aarbij h ista m in e en andere biogene am ines na d eriv a tiserin g m et dan sy lch lo rid e
zow el k w a lita tie f ais k w a n tita tie f snel en eenvoudig k o n d en w o rd e n bepaald. E r w erd
beslo ten d e z e te c h n ie k op haar bruikbaarheid ais se m i-k w a n tita tie v e screen in g -test te
on d erzo ek en en w a a r n o d ig aan te passen.
2. M A T E R I A A L E N M E T H O D E N
2.1 R e a g e n tia :
E xtractie : m e th a n o l p .a., trichloorazijnzuur (T C A )
(PC A ) 6 % (m /v ).
7,5 % (m /v ) o f perch lo o rzu u r
D e riv a tise rin g : 50 m g d ansylchloride (5 -d im e th y la m in o -l-n a fta le e n su lfo n y lc h lo rid e )
in 10 m l a c eto n o p lo ssen .
2
H istam inestandaard : S to ck o p lo ssin g : 165,7 m g h istam inehydrochloride in 100 ml
w aterstofchloride 0,1 M oplossen. W erkoplossingen : verdunningen m et gebruikte
extractiem iddel m aken.
L oopm iddel : benzeen /trieth y lam in e 80/20
D L C -platen : H P T L C p laten 10 x 10 cm K ieselgel 60 (M erck)
2.2. E x tra c tie v a n h is ta m in e :
M et m ethanol :
D it
is
de
ex tractietechniek
die
in
de
A O A C -m eth o d e
m et
kolom chrom atografie w ordt g ebruikt (H elrich, 1990). V ijf g vis w ordt m et 30 m l
m ethanol g eh om ogeniseerd en 15 m in bij 55°C in w arm w aterbad verw arm d. N a
filtratie w orden aan 1 m l ex tract 1 m l buffer pH 9 en 2 m l dan sy lch lo rid e-o p lo ssin g
toegevoegd. E r w ordt dan 1 uur bij 55°C in een d ro o g sto o f verw arm d. O p te m erken
valt dat aangezien glas h istam in e adsorbeert, plastic buizen dien en te w o rd en gebruikt.
M et trich lo o razijn zu u r :
T ien g vis
gehom ogeniseerd.
m l buffer pH 9
procedure is zoals
w o rd t m et 30 m l T C A -oplossing van 45°C in een p lastic bekertje
N a filtratie w ord en aan 1 m l extract 80 pi n a triu m h y d ro x id e 4 M , 1
en 2 m l dansylchloride-oplossing toegevoegd. D e rest van de
bij de m ethanolm ethode.
M et perchloorzuur :
Z elfde procedure ais v o o r T C A . E r w ordt evenw el 150 pi n atriu m h y d ro x id e 1
M toegevoegd (pH 9 controleren).
2.3. D u n n c la a g c h r o m a to g ra f ie :
V ijf pi w o rd t op de concentratiezone van de plaat aangebracht. H istam inestandaarden o v ereenkom end m et 5 en 10 m g/100 g w orden eveneens gespot. N a
drogen w o rd t de p laa t in de ch rom atografietank gedurende 20 m in o n tw ik k eld en
opnieuw gedroogd. D e id en tificatie gebeurt onder U V -licht (366 nm ).
3. R E S U L T A T E N E N D IS C U S S IE
3.1 E x tr a c tie p r o c e d u r e
N ag u ib et al. (1995) p assen een extractie m et trich lo o razijn zu u r (T C A ) toe.
H ierbij w o rd t aan v is n a ho m o g en isatie m et T C A en filtratie n atriu m h y d ro x id e en
natrium chloride toegevoegd. H istam ine w ordt v o o raf m et b u tan o l/ch lo ro fo rm en
heptaan geëxtraheerd v o o r de dansylering. A lhoew el bru ik b aar, w e rd e n toch
regelm atig m inder goede sch eid in g en bekom en, vooral m et v is in olie o f saus. E en
vereenvoudiging v an de tec h n iek w aarbij n a hom ogenisatie m e t T C A de pH m et
buffer op 9 w erd gebracht, g a f betere resultaten.
A is extractiem iddel w erd o o k PC A i.p.v. T C A uitgetest. D e resu lta ten w aren
dezelfde ais v o o r T C A .
3
D e e x tra ctie m et m eth an o l b leek eveneens b e v re d ig en d te w erken (zie 3.4).
H et vo o rd eel v a n d eze tec h n iek is dat bij b evestigend o n d e rz o e k m et de A O A C m ethode (H elrich , 1990) m et h etzelfde extract verder kan w o rd e n gew erkt.
3.2. D a n sy le r in g
V oor h et to e v o e g e n v a n dansylchloride dient de pH te w orden gecontroleerd.
D eze m o et 8,8 - 9 b ed rag en . Bij grotere afw ijking w o rd t g e e n kleur (fluorescentie)
bekom en.
3.3. D L C -p la te n
S ilicag el H P T L C -p late n blek en scherpere en snellere scheidingen te geven dan
de norm ale p la te n die d o o r N a g u ib et al. (1995) w erden geb ru ik t. D e looptijd bedroeg
20 i.p.v. 35 m in. D eze laatste kun n en evenw el ook w orden aangew end.
3.4. S ch e id in g v a n h ista m in e (fig. 1)
Ertractie met methanol
0.6
0.5
o
o
o
o
O
O
0.4
0.3
0.2
£
0.1
-
0.0
-
0.1
Concentratiezone
- 0.2
Blanco
Histamine
Vis
Vis + hist.
Extractie met trichloorazijnzuur of
perchborzuur
0.6
0.5
0.4
0.3
K
0.2
0.1
0.0
-
Concentratiezone
0.1
- 0 .2
Blanco
Histamine
Vis
Vis + hist.
Fig. 1. Dunnelaagchromatogrammen met vis en histamine
4
M et de drie e x tra ctiem id d ele n g e e ft dansylchloride een v lek op de startlijn en bij R f
0,55. PC A , T C A en n a triu m h y d ro x id e geven geen vlek. M et de m ethanolextractie
geeft histam ine een sterk gele v le k bij R f 0,25. M et T C A en PC A is dit ook h et geval
m aar er k o m en tw ee zw a k k e v lek k e n bij (R f 0,15 en 0,32). D e blanco geeft alleen de
dansylchloridevlekken. H istid in e, m et verw ante chem ische structuur, geeft geen vlek
en stoort aldus niet.
V is geeft een d u id e lijk e v lek op R f 0,15 en en m et T C A o f P C A m eestal een
aantal lichte v lek k en tu ss e n R f 0 ,07 en 0,20, zeer w aarschijnlijk veroorzaakt door
verbindingen m et am in o g ro ep (bv. v rije am inozuren).
W anneer aan w ezig , is h ista m in e duidelijk te detecteren v a n a f een concentratie
van 5 m g/100 g. D eze d e te c tie g re n s ligt vrij hoog, m aar gezien de w ettelijke norm en
respectievelijk 10 en 20 m g /1 0 0 g b edragen is deze concentratie ruim voldoende om
verdachte m onsters te k u n n e n op sp o ren . H et ju iste gehalte aan histam ine dient dan
eventueel m et andere te c h n ie k e n (bv. H P L C ) te w orden bepaald.
3.5. T o e p a s sin g op v i s s e r ijp r o d u c te n
De m ethode w e rd op een aantal visserijproducten uit de handel toegepast.
Deze w aren :
- diepgevroren vis :
m akreel en h arin g
- ingeblikte vis :
sardienen en an sjo v is in o lijfo lie en in niet gespecificeerde plantaardige olie,
m akreelfilets in o lijfolie, so ja o lie en tom atensaus, haringfilets in m osterdsaus, tonijn
in eigen nat en in p ro v e n c a a lse saus.
N ergens w erd h ista m in e gedetecteerd. Bij toevoeging van 5 m g/100 g
histam ine w erd een d u id e lijk e v lek b ekom en (fig. 1). M et m ethanol w as deze iets
zw akker dan m et T C A o f P C A .
L ite r a tu u r
A ures, D., F lem ing, R. e n H a k a n so n , R. (1968) : M icro-analysis o f tissue am ines and
o f enzym es in v o lv ed in th e ir m eta b o lism . Journal o f C hrom atography 33, 480-493.
EU (1993) : R ich tlijn v a n de R a a d v an 22 ju li 1991 tot vaststelling van g ezo n d h eid s­
voorschriften v o o r de p ro d u c tie en het in de handel brengen v an v isse rij­
p roducten.P ublicatieblad v a n de E u ro p ese G em eenschappen van 24.09.91 N r L
268/15.
Etienne, M ., L uçon, M ., N o ë l, J., L oréal, H. en Fleurence, J. (1995) : T est de tri p ar
détection im m u n o en z y m a tiq u e de l ’histam ine dans le poisson. IF R E M E R , N an tes,
France, 28 p.
5
H elrich, K. (E d .) (1 9 9 0 ) : O fficial m ethods o f analysis o f th e A sso c ia tio n o f O fficial
A nalytical C h e m ists, 15th edition. A ssociation o f O fficial A n a ly tic al C h em ists, Inc.,
A rlin g to n , V irg in ia , U S A , p. 876.
L ieber, E. en T a y lo r, S. (1978) : T hin -lay er ch ro m ato g rap h ic screen in g m eth o d s for
h istam ine in tu n a fish . Jo u rn a l o f C hrom atography 153, 143-152.
Lin, J., B a ra n o w sk i, J. en O lcott, H. (1977) : R apid th in -la y e r ch rom atographicden sito m etric d e te rm in a tio n o f histam in e in tuna. Journal o f C h o m a to g ra p h y 130,
426-430.
M ietz, J. en K a rm a s, E. (1977) : C hem ical quality index o f c a n n e d tu n a as determ ined
by high p e rfo rm a n c e liq u id chrom atography. Journal o f F o o d S c ien c e 42, 155-158.
N ag u ib , K ., A y e sh , A. en S halaby, A. (1995) : Studies o n th e d eterm in atio n o f
b io genic a m in e s in foods. 1. D ev elo p m en t o f a T L C m eth o d fo r the determ in atio n o f
eight b io g en ic a m in e s in fish. Journal o f A griculture and F o o d C h em istry 43, 134139.
Pan, B .S. e n Ja m e s, D. (eds) (1985). H istam ine in m arin e p ro d u c ts : p ro d u ctio n o f
bacteria, m e a su re m e n t and p red ic tio n o f form ation. FA O F ish e rie s T echnical Paper,
(252) ; 62 p.
V id al-C aro u , M ., V e c ian a -N o g u é s, M . en M ariné-F ont, A . (1990) : Spectroflu o ro m etric d e te rm in a tio n o f histam in e in fish and m eat p ro d u c ts. Jo u rn al o f the
A sso ciatio n o f O fficial A n aly tical C hem ists 73, 565-567.
Y en, G. en H sie h , C. (1991) : S im ultaneous analysis o f b io g e n ic am in es in canned
fish by H P L C . Jo u rn a l o f F o o d Science 56, 158-160.
6
B IJL A G E
R ichtlijn van de R aad van 22 ju li 1991 to t vaststelling van gezo n d h eid sv o o rsch riften
voor de pro d u ctie en het in de handel bren g en van visserijproducten (9 1 /4 9 3 /E E G ),
gew ijzigd d oor R ichtlijn 9 5 /7 1/EG van 22 decem ber 1995, art. 1.6.
B ijlage - H o ofdstuk V : G ezondheidscontrole en controle op de pro d u ctie-eisen
II. Speciale voorw aarden
1. O rganoleptische controles
A is op grond van de organoleptische beoordeling enige tw ijfel bestaat o v e r de
versheid van de visserijproducten, kunnen chem ische o f m icrobiologische co n tro les
w orden uitgevoerd.
3. C hem ische controles
A. E r w orden m onsters genom en die in een laboratorium w orden ond erzo ch t,
teneinde de volgende param eters te controleren :
a. ...
b. H istam ine
Per partij m oeten negen m onsters w o rd en genom en :
- de gem iddelde concentratie m ag niet hoger zijn dan 100 ppm ;
- bij ten h o o g ste tw ee m onsters m ag de concentratie m eer dan 100 ppm , d o c h niet
m eer
dan 200 ppm bedragen;
- bij geen enkel m onster m ag de concentratie m eer dan 200 p p m bedragen.
D eze m axim um concentraties gelden alleen voor visso o rten die b e h o re n to t de
fam ilies Scom bridae, Clupeidae, Engraulidae en C oryphenidae. D e v issen v a n deze
fam ilies die een enzym atische rijping in pekel hebben ondergaan, m o g e n echter
hogere h istam ineconcentraties bevatten, die evenw el het du b b ele van b o v e n g e n o em d e
w aarden n ie t m ogen overschrijden. D e onderzoeken m o eten w orden v e rric h t m et
behulp van w eten sch ap p elijk erkende m eth o d en die hun deu g d elijk h eid h e b b e n
bew ezen, zoals de H P L C (hogedruk-vloeistofchrom atografie).