Transcript De anaerobe dechloreringsroute van hexachloorbenzeen in

De anaerobe dechloreringsroute
van hexachloorbenzeen in
verrijkingscultuur.
Werkdocument nr. 91.091X
M.J.A. Swart
Afstudeerverslag, mei 1991
Uitgevoerd bij:
In opdracht van:
RIZA
Afdeling AOC Milieuchemie
Postbus 17
8200 AA Lelystad
Hogeschool /Ukmaar
Sector Techniek-chemie
Afstudeerrichting Miliekunde
Plantage 2
1943 LM Beverwijk
Stagementor: J.E.M. Beurskens
Stagebegeleider: B. Polma
ERRATUM:
Bij het schrijven van dit rapport is een fout gemaakt. In paragraaf 4.8 siaat in het
schema dat 1,2,3,4-TeCB wordt omgczel in 1,2,3-TCB. Dit is fout. 1,2,3,4-TeCB wordt
namelijk omgezet in 1.2.4-TCB.
Het schema moet er dus als volgt uit zien:
y
,1235-TeCB-
^1245-TeCB
1234-TeCB
De anaerobe dechloreringsroute
van hexachloorbenzeen in
verrijkingscultuur.
Werkdocument nr. 91.091X
M.J.A. Swart
Afstudeerverslag, mei 1991
Uitgevoerd bij:
In opdracht van:
RIZA
Afdeling AOC Milieuchemie
Postbus 17
8200 AA Lelystad
Hogeschool Alkmaar
Sector Techniek-chemie
Afstudeerrichting Miliekunde
Plantage 2
1943 LM Bevenvijk
Stagementor: J.E.M. Beurskens
Stagebegeleider: B. Polman
VOORWOORD
Dit afstudeerverslag is het resultaat van een experimenteel onderzoek naar de
dechloreringsroute van HCB. Het afstudeerverslag vormt een onderdeel van de
stageperiode van de Hogeschool Alkmaar, sector Techniek-Chemie, afstudeerrichting
Milieukunde. Het onderzoek is uitgevoerd bij het RIZA te lelystad.
Bij deze wil Koos Beurskens hartelijk danken voor de begeleiding tijdens mijn stage en
specifiek voor de begeleiding tijdens het schrijven van dit afstudeerverslag. Tevens wil
ik Connie Dekker bedanken voor de practische begeleiding tijdens het uitvoeren van
het experiment.
Martien Swart
Lelystad, 1991.
SAMENVATTING
Met behulp van een verrijkingscultuur is getracht de anaerobe microbiele dechloreringsroute van HCB op te helderen. De micro-organismen blijken in staat om de
meeste chloorbenzenen te dechloreren. Hoog gechloreerde benzenen worden sneller
gedechloreerd dan laag gechloreerde benzenen. Pentachloorbenzeen (QCB) wordt
veruit het snelst gedechloreerd, gevolgd door 1,2,3,4-tetrachloorbenzeen (1,2,3,4TeCB), hexachloorbenzeen (HCB) en 1,2,3,5-tetrachloorbenzeen (1,2,3,5-TeCB). De
micro-organismen blijken echter niet in staat om laag gechloreerde benzenen (m.u.v.
1,2,3-trichloorbenzeen (1,2,3-TCB)) reductief te dechloreren binnen de tijdsduur van
dit experiment.
Als primaire dechloreringsroute is gevonden: HCB —> QCB — > 1,2,3,5-TeCB —>
1,3,5-TCB. 1,2,3,5-TeCB wordt ook omgezet in 1,2,4-TCB. De gevormde hoeveelheid
1,2,4-TCB is echter klein t.o.v. de gevormde hoeveelheid 1,3,5-TCB. Van de omzetting
van 1,2,3,5-TeCB in 1,2,4-TCB is in de literatuur nog niet eerder melding gemaakt. Als
secundaire dechloreringsroute is gevonden: HCB —> QCB —> 1,2,4,5-TeCB —>
1,2,4-TCB.
De verrijkingscultuur is ook in staat om 1,2,3,4-TeCB om te zetten in 1,2,3-TCB. Van
deze omzetting is in de literatuur nog niet eerder melding gemaakt. De omzetting
maakt echter geen deel uit van de dechloreringsroute van HCB.
INHOUD
VOORWOORD
SAMENVATTING
1.
INLEIDING
1
2. THEORIE
2.1 De dechloreringsroute
2.2 Dechlorering
2.3 Eerste orde kinetiek
2
2
3
5
3.
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
6
6
7
8
8
8
9
MATERLALEN EN METHODEN
Chemicalien en hulpstoffen
Proefopzet
Bereiding van de bacteriecultuur
Monstername
Analyse van chloorbenzenen
Kwantificering van chloorbenzenen
4. RESULTATEN EN DISCUSSIE
4.1 Voorexperiment
4.2 Periode A
4.3 Periode B
4.4 Periode C
4.5 Onzichtbare metabolieten
4.6 De steriele
4.7 Afbraaksnelheden
flessen
10
10
10
11
13
22
22
23
4.8
De dechloreringsroute van HCB
24
5.
CONCLUSIE
25
REFERENTIES
26
Bijlage
Bijlage
Bijlage
Bijlage
Bijlage
Bijlage
I
II
III
IV
V
VI
: overzicht van de flesnummers en de chloorbenzenen.
: gebruikte afkortingen en symbolen.
: regressielijnen.
: HCB concentratie in periode A
: massabalansen.
: structuurformules van chloorbenzenen.
1.
INLEIDING
Chloorbenzenen zijn, mede door hun persistence, zeer schadelijke stoffen. De laatste
decennia zijn gechloreerde benzenen zeer intensief gebruikt o.a. als organische
oplosmiddelen en insecticiden. Ze zijn ook geproduceerd als intermediair tijdens de
productie van chemicalien. Dit alles heeft er toe geleid dat deze stoffen wijd verspreid
zijn geraakt in het milieu. Chloorbenzenen zijn o.a. gevonden in oppervlaktewater,
grondwater en sediment (1).
Onderzoekers hebben zich tot nu toe voornamelijk gericht op de aerobe microbiele
omzetting van de chloorbenzenen. De aerobe afbraak van chloorbenzenen blijft echter
beperkt tot de laag gechloreerde benzenen (2,3,4,5). De laatste jaren krijgt de
omzetting onder anaerobe omstandigheden steeds meer aandacht. Hoog gechloreerde
benzenen kunnen onder anaerobe omstandigheden vrijwel allemaal gedechloreerd
worden (6,7). De anaerobe dechlorering van de laag gechloreerde benzenen is veel
moeilijker. Hiervan zijn maar enkele experimenten bekend (8,9). In de gepubliceerde
studies is het aantal chloorbenzenen telkens beperkt tot enkele (8) of zelfs maar e£n
(7). De dechlorering van de complete reeks van chloorbenzenen door 6en microbiele
populatie is nog niet bestudeerd. Ook is de dechlorering van 1,2,3,4-tetrachloorbenzeen nog nooit bestudeerd. In dit afstudeerverslag wordt de dechlorering van alle
chloorbenzenen (behalve MCB) bestudeerd m.b.v. een verrijkingscultuur. De dechlorering vindt plaast onder anaerobe condities met een verrijkingscultuur die verkregen
is m.b.v. HCB.
Het doel van dit onderzoek is:
- Het ophelderen van de dechloreringsroute van HCB door micro-organismen.
verkregen uit het Ketelmeersediment.
- Het bepalen van de microbiele dechloreringssnelheden van de chloorbenzenen.
zodat een relatieve persistentie kan worden bepaald.
.
2. THEORIE
2.1 De dechloreringsroute
Dechloreringsexperimenten met CB's zijn door verschillende onderzoekers onderzocht
(voor structuren van CB's, zie bijlage VI). De belangrijkste literatuur referenties zijn
die van Fathepure et al (7) en Bosma et al (8). Fathepure et al hebben de microbiele
dechloreringsroute van HCB in een anaeroob milieu onderzocht. Hierbij werd gebruik
gemaakt van rioolzuiveringsslib. Er werd uitgegaan van drie CB's, te weten HCB,
1,2,3,5-TeCB en 1,3,5-TCB. De route werd afgeleid van de dechloreringsproducten
van deze drie CB's. De gevonden route wordt weergegeven in fig. 1. Bij de vorming
van DCB's uit TCB's werd 1,4-DCB duidelijk het minst gevormd.
o
r
1.2 oca
0
^°— £*-— 6
K0C1
a
lilS
T-CB
li.4 -TC»
IJ-OCB
Figuur 1: Dechloreringsroute van HCB volgens Fathepure et al (7).
Ook Bosma et al (8) hebben zich bezig gehouden met microbiele reductieve dechlorering. Ze hebben de reductieve dechlorering in anaeroob milieu van alle TCB's en
DCB's onderzocht. De dechlorering was hier specifiek. 1,2,3-TCB en 1,3,5-TCB
werden alleen gedechloreerd naar 1,3-DCB. 1,4-DCB was het enige dechloreringsproduct van 1,2,4-TCB (zie fig. 2). 1,3,5-TCB werd hier wel omgezet, terwijl dit bij
Fathepure et al (7) niet het geval was. Deze omzetting van 1,3,5-TCB is vrijwel de
enige anaerobe microbiele omzetting die bekend is in de literatuur. 1,3,5-TCB staat
bekend om zijn persistentie. Veel onderzoekers vonden tijdens hun dechloreringsexperimenten geen omzetting van 1,3,5-TCB. Hierdoor was 1,3,5-TCB geen interessant
studieobject. Er is dan ook weinig onderzoek naar 1,3,5-TCB verricht.
Figuur 2: Dechlorering van TCB's en DCB's volgens Bosma et al (8).
Bij het experiment met de DCB's bleken alle DCB's omgezet te worden naar MCB,
terwijl dit bij het experiment met de TCB's niet het geval was. Opvallend is ook dat
1,3-DCB en 1,4-DCB pas werden gedechJoreerd na bijna complete omzetting van 1,2DCB.
Er zijn weinig experimenten bekend waarbij laag gechloreerde benzenen als TCB's en
DCB's onder anaerobe omstandigheden worden gedechloreerd. Vaak blijft de
dechlorering onder anaerobe omstandigheden beperkt tot de hoger gechloreerde
benzenen. Laag gechloreerde benzenen, met uitzondering van 1,3,5-TCB, kunnen in
een aeroob milieu wel goed afgebroken worden (2,3,4,5). Voor een totale afbraak van
HCB zou eerst een anaeroob milieu gecreerd moeten worden, waarin de CB's zoveel
mogelijk worden gedechloreerd. Daarna moet een aeroob milieu gecreerd worden
waarin de afbraak voltooid kan worden.
2.2 Dechlorering
Chloorbenzenen zijn chemisch vrij stabiel. Fotochemische afbraak speelt in aquatische
milieu's geen rol. Afbraak moet dus geschieden m.b.v. organismen die enzymen
bezitten die de verbinding kunnen afbreken. De aerobe afbraak van hoog gechloreerde aromaten is echter beperkt omdat er twee vrije ringposities naast elkaar aanwezig
dienen te zijn voor ringopening. Dat wil zeggen, er moeten twee waterstofatomen
naast elkaar aan de benzeenring zitten. Ringopening vindt namelijk plaats d.m.v.
hydroxylering. Om twee vrije ringposities te creeeren moeten er een of meerdere
chlooratomen van de benzeenring gehaald worden. Dit kan d.m.v. reductieve dechlorering. Hierbij wordt een chlooratoom vervangen door een waterstofatoom. Reductieve dechlorering vindt echter alleen plaats in een anaeroob milieu. Door chlooratomen
van de benzeenring te halen kunnen twee vrije ringposities naast elkaar ontstaan,
zodat aerobe afbraak (te beginnen met ringopening) theoretisch kan plaatsvinden.
Het chloorbenzeenmolecuul fungeert in een anaeroob milieu meestal niet als koolstofbron voor het micro-organisme, maar als electronenacceptor. In een aeroob medium
worden de electronen, die vrijkomen aan het eind van de ademhalingsketen, afgegeven aan moleculair zuurstof. In een anaeroob medium is echter geen zuurstof
aanwezig. De vrijgekomen electronen van de ademhalingsketen worden nu afgegeven
aan b.v. SO«2", N 0 3 , of aan een chloorbenzeen. Het accepteren van een electron door
het chlooratoom vormt de aanzet tot reductieve dechlorering. Aangezien chloor sterk
electronegatief is, is het een goede electronenacceptor.
Ook vanuit thermodynamisch oogpunt blijken gechloreerde verbindingen goede
terminale electronenacceptoren te zijn. Vogel et al. (10) lieten zien dat gechloreerde
alifatische verbindingen een hogere reductiepotentiaal hebben dan b.v. N0 3 ", SO/".
Dit betekent dus dat er bij de reductie van gechloreerde verbindingen, in anaeroob
milieu, meer energie vrijkomt dan bij de reductie van N03", S042" of soort gelijke
verbindingen. Dit verklaart waarom gechloreerde verbindingen als electronenacceptor
kunnen dienen in anaeroob milieu i.p.v. N0 3 ' of S0 4 2 '.
Bij de reductie neemt het potentiaalverschil af naarmate de benzeenring meer
chlooratomen bevat (11). Dit betekent dat hoger gechloreerde benzenen sneller en
vollediger worden gedechloreerd dan lager gechloreerde benzenen en dat er geen
verschil is tussen de verschillende isomeren. Dit is echter gedeeltelijk waar. Hoger
gechloreerde benzenen worden inderdaad sneller omgezet dan lager gechloreerde
benzenen (7,8). Er is echter wel verschil tussen de verschillende isomeren. De plaats
van de chlooratomen t.o.v. elkaar is namelijk ook van belang (zie fig. 3). Dechlorering
vindt namelijk plaats via nucleofiele substitutie (6,11,12). De negatieve lading die
ontstaat bij dechlorering wordt hierbij gecompenseerd door de electronegatieve
substituenten. Dit houdt in dat:
- hoog gechloreerde benzenen makkelijker worden gedechloreerd dan laag
gechloreerde benzenen.
- dechlorering makkelijker gaat wanneer de chloorsubstituenten dichter bij elkaar
zitten,
- de chloor substituenten op de 2-positie het snelst worden verwjjderd.
Figuur 3:
De relatie tussen de afbraaksnelheid en de positie van de chlooratomen
1) ortho-DCB 2) meta-DCB 3) para-DCB (12).
Het algemeen aanvaarde dechloreringsmechanisme m.b.v. nucleofiele substitutie
verloopt als volgt (11,12): De aromatische verbinding accepteert een electron. De
negatief geladen intermediair gaat een binding aan met een proton, hierna volgt de
additie van een tweede electron en het vrijkomen van het chlooratoom (ziefig.4).
Cl
Cl
Cl
6 ] +e ~*~ if)) — - rol
ci-\^ci
<yc\
Cl^CI
H
CI^CI
le
?
ci
ci
cr +
(Q\
l
J
--
H <^ CI
0]
CI^CI
H
Figuur 4: Mechanisme van nucleofiele substitutie (12).
23 Eerste orde kinetiek
De dechlorering van CB's is goed te beschrijven m.b.v. l'-orde kinetiek. Deze gaat uit
van de volgende vergelijking.
S, = S0 * e"""'
(I)
S, = Concentratie op t=t.
S0 = Concentratie op t=0.
k - snelheidsconstante.
t = tijd.
Na omschrijving levert dit:
ln S, = ln S0 - k*t (II)
Door 'In S,' uit te zetten tegen Y kan 'k' gevonden worden als de richtingscoefficient
van de grafiek. Dit is eenvoudig te bepalen m.b.v. lineaire regressie. Uit vergelijking
(II) is ook de halfwaarde tijd (tH) af te leiden. Op tw is de concentratie S, de helft van
Soln (!/2*S0) = ln S0 - k % (III)
t« = ID_2 (IV)
k
3. MATERIALEN EN METHODEN
3.1 Chemicalien en hulpstoffen
Naam
Fabrikant en specificaties
1,2-dichIoorbenzeen
1,3-dichloorbenzeen
1,4-dichloorbenzeen
1,2,3-trichloorbenzeen
1,2,4-trichIoorbenzeen
1,3,5-trichloorbenzeen
1,2,3,4-tetrachloorbenzeen
1,2,3,5-tetrachloorbenzeen
1,2,4,5-tetrachloorbenzeen
Pentachloorbenzeen
Hexachloorbenzeen
Isooctaan
Aceton
Milli-Q water
Methanol
Injectiespuit 10 ml en 50 ml
ICN Biomedicals, 99%, code 23074
Fluka AG, 99%, code 35350
Fluka AG, 99%, code 35370
Merck-Schuckart, 99%, code 808285
Merck-Schuckart, 98%, code TR 129
Merck-Schuckart, 99%, code 821153
Fluka AG, 99%, code 86990
Aldrich Europa, 99%, code 15348-6
Janssen, 99%, code 13,185-7
Dr. S. Ehrenstorfer, 99%
Riedel-De Haen AG, 99%
Promochem, nanograde, code 6051
Merck, reinst, 99%, code 815 K04168213
Injectienaald
Microfilter (0,22 nm)
Incubatiefles (1 L)
Lactaat
resazurine
Viton stop
Baker, HPLC Reagent, code 8402
Becton Dickinson, steriel, code H811 ES en
H851 ES
Becton Dickinson, steriel, code G 21,2"
Millipore, steriel, code SLGV-025BS
Schott, code GL45
Baker, 60%, code 7391
Difco laboratories, code 0704-12
Eriks b.v.
3.2 Proefopzet
Aan het definitieve experiment is een kort voorexperiment voorafgegaan. De verrijkingscultuur die aanwezig is op het RIZA, is gekweekt op HCB met een concentratie
van 20 ng/l en een koolstofsubstraat (lactaat). Bij het bepalen van de dechloreringsroute wordt HCB toegevoegd, waarbij de uiteindelijke concentratie 50 /ig/1 bedraagt.
Het voorexperiment is bedoeld om te kijken of de bacterien tegen een dergelijk hoge
concentratie bestand zijn. Hiertoe wordt aan een fles met verrijkingscultuur HCB (50
•xg/1) toegevoegd en wordt de concentratie hiervan gevolgd in de tijd. De monsters
werden genomen volgens de bij 'monstername' (3.4) beschreven methode.
Het definitieve experiment is opgedeeld in drie perioden. Perioden A, B en C genoemd. In elke periode wordt chloorbenzeen toegevoegd.
Periode A:
In deze periode worden de flessen met medium en lactaat, geent met de
microbiele mengpopulatie. Tevens wordt er HCB toegevoegd (20
Mg/l).Er kan hier adaptatie aan de heersende omstandigheden plaatsvinden en tevens kan door groei van de microbiele populatie de dechlorering steeds sneller verlopen.
Aan 13 flessen is ent toegevoegd zoals beschreven is bij 'monstername'
(3.4) en 13 flessen worden steriel gehouden (geen ent toevoegen). De
concentratie van HCB wordt steekproefsgewijs gevolgd in de tijd totdat
deze nul is. Wanneer gedacht wordt dat alle HCB verdwenen is uit alle
flessen, wordt van elke fles een monster genomen en geanalyseerd. Dit,
om zeker te zijn dat al het HCB weg is.
Periode B:
In deze periode kan aan de hand van de dechloreringssnelheid een beeld
verkregen worden van de vergelijkbaarheid van de verschillende flessen.
Nadat alle HCB tijdens periode A is verdwenen wordt opnieuw HCB
toegevoegd (20 Mg/l)- Aan de steriele flessen wordt geen HCB toegevoegd. Opnieuw wordt de concentratie van HCB steekproefsgewijsgevolgd in de tijd.
Periode C:
In deze periode worden de dechloreringssnelheden van de verschillende
chloorbenzenen bepaald en wordt de dechloreringsroute van HCB
bepaald.
De flessen worden gespiked in gelijke concentratie (mol/1) met de
verschillende chloorbenzenen (uitgaande van 50 /ig/1 HCB). De concentratie van HCB moet vrij hoog zijn. Dit omdat anders de dichloorbenzenen, bij een gelijke concentratie in mol/1, niet meer gemeten kunnen
worden.
Per chloorbenzeen zijn er dus twee flessen. Een steriele fles en een
geente fles. In totaal zijn dit 22 flessen. (Monochloorbenzeen wordt niet
meegenomen omdat die niet gemeten kan worden). De steriele flessen
worden nu wel gespiked. Doordat er gespiked is in gelijke concentraties.
is er een vergelijking mogelijk tussen de verschillende flessen.
3 3 Bereiding van de bacteriecultuur
Het medium wordt bereid uit een aantal stockoplossingen. Als eerste wordt het
basismedium gemaakt. Dit bestaat uit een fosfaatbuffer (pH=7,0), milli-Q water en
een zuurstof indicator (resazurine). De zuurstof indicator veroorzaakt een kleuromslag
van kleurloos naar roze wanneer een zeer lage concentratie zuurstof aanwezig is.
Het basismedium wordt 10 minuten gekookt om de zuurstof zo veel mogelijk te
verdrijven. Vervolgens wordt het onder doorborrelen van stikstof afgekoeld, in flessen
gegoten en met gesloten dop geautoclaveerd. Nadat de flessen geautoclaveerd zijn
worden de benodigde mineralen, spore-elementen en vitaminen steriel toegevoegd.
Steriel toevoegen houdt in dat de oplossingen gefiltreerd worden over een steriel
microfilter en toegevoegd worden met een steriele spuit en een steriele naald. Het
septum wordt gesteriliseerd door dit af te branden met ethanol. Vervolgens worden
de koolstofbron (lactaat) en de gechloreerde verbinding (HCB) steriel toegevoegd. De
uiteindelijke concentratie van het HCB in de fles bedraagt ongeveer 20 /ig/1. Als
laatste wordt 30 ml ent toegevoegd (van fles 25, geent op 7-ll-'90). De flessen worden
hierna in het donker weggezet in een incubator bij een temperatuur van 25 °C.
De verrijkingscultuur is verkregen door herhaalde malen Ketelmeer sediment over te
enten in een anaeroob medium met lactaat en HCB. In de huidige verrijkingscultuur
is geen sediment meer aanwezig. Een uitgebreid verslag van de werkwijze is beschreven in 'Voorschrift anaerobe incubaties' (13).
3.4 Monstername
Uit de incubatiefles wordt steriel 10 ml monster getrokken. Dit wordt gedaan door het
septum eerst af te branden met ethanol. Vervolgens wordt een steriele naald door het
septum gestoken en wordt 10 ml monster opgezogen in een steriele injectiespuit. Het
monster wordt overgebracht in een gecalibreerde puntbuis. Hieraan wordt 2 ml
isooctaan toegevoegd en 1.5 uur uitgeschud in een schudmachine. Hierna wordt het 1
uur bij -20 °C in de vriezer gezet om de emulsie te breken. Het monster dat in de
isooctaanlaag zit kan nu direct in de gaschromatograaf worden ingespoten.
3.5 Analyse van chloorbenzenen
De concentraties van de chloorbenzenen worden bepaald met behulp van capillaire
gaschromatografle. De analyse vindt plaats met behulp van een Hewlett Packard
5890A gaschromatograaf, welke is voorzien van een CP sil 19 CB kolom (lengte: 50
m; interne diameter: 0.25 mm). De gaschromatograaf is gekoppeld aan een HP 7673A
automatische sampler. De extracten bevinden zich in isooctaan. Hiervan wordt 2 /il
via een splitless injectiesysteem, met een splittijd van 30 seconden, bij een temperatuur van 225 °C op de kolom gebracht. De scheiding berust op een verschil in
kookpunt en polariteit van de componenten.
B
Het temperatuurprogramma dat wordt doorlopen ziet er als volgt uit:
-
2 min. 60 °C, met 10 °C/min. naar 140 °C, 5 min. 140 °C, met 5 °C/min. naar
225°C, 90 min. 225 °C; runlengte is 122 min.
De detectie vindt plaats bij een temperatuur van 300 °C met behulp van een 63NiECD detector. Als dragergas wordt helium gebruikt. Verder is de gaschromatograaf
nog gekoppeld aan een HP Vectra QS/20 datastation. Het datastation is voorzien van
HP Chemstation 3365 software voor piekindentificatie en kwantificering van de
chloorbenzenen.
3.6 Kwantificering van chloorbenzenen
De concentraties van de chloorbenzenen worden bepaald met behulp van de externe
standaard methode. Met behulp van de piekoppervlakken van de standaard worden
de responsiefactoren van de verschillende coraponenten bepaald. De externe standaard moet wel in hetzelfde oplosmiddel zitten als het monster, omdat koolwaterstoffen de respons van een ECD beinvloeden, hoewel ze niet gedetecteerd worden. Bij de
kwantificering van de chloorbenzenen wordt uitgegaan van een lineair verband tussen
de concentratie en het piekoppervlak. Het lineair bereik van de ECD is echter klein
door verzadigingseffecten bij hogere concentraties. De fouten die gemaakt worden,
door uit te gaan van lineairiteit, blijken 15% en 25% te zijn bij concentratie verschillen van respectievelijk een factor twee en drie ten opzichte van de externe standaard.
Bij een maximaal toelaatbare fout van 15% mag de monsterconcentratie dus niet
meer dan een factor twee verschillen ten opzichte van de standaardconcentratie.
4. RESULTATEN EN DISCUSSIE
4.1 Voorexperiment
In figuur 5 is te zien dat de HCB concentratie, van 140 /ig/1, binnen ± 14 dagen
gedaald is tot nul. De micro-organismen zijn dus in staat om een dergelijk hoge
concentratie HCB te dechloreren.
HCB afbraak
VcorajpertmorTl
concentratie (nmol/I)
1*0 M
120
100
so
\
\
60
\
40
20
0
1
200
V
l
400
r.
I
600
800
10
tijd (uren)
HCB
Figuur 5: Daling van de HCB concentratie in de tijd.
4.2 Periode A
De HCB afbraak wordt steekproefsgewijs bijgehouden door regelmatig de geente
flessen 1,3,5 en 9 en de steriele flessen 2,4,6 en 8 te meten. In figuur (6,a) is de HCB
concentratie van de geente flessen uitgezet tegen de tijd. De HCB concentratie van de
flessen 1,3 en 5 is met twee weken tot nul gedaald. Alleen fles 9 doet het minder
goed. Deze heeft vier weken nodig om de HCB concentratie tot nul te laten dalen.
Om te controleren of de concentratie van HCB van alle geente flessen tot nul gedaald
is, wordt na vier weken van alle flessen de HCB concentratie gemeten. Deze concentratie van HCB blijkt van alle flessen nul te zijn, behalve fles 21, (zie bijlage IV, tabel
A) zodat periode B ingezet kan worden. Met fles 21 wordt niet meer verder gewerkt.
Van de steriele flessen zijn na vier weken alleen de flessen 2,4,6 en 8 gemeten. Deze
flessen worden representatief geacht voor de andere steriele flessen. In geen van de
steriele flessen blijkt de concentratie HCB tot nul te zijn gedaald (zie bijlage IV, tabel
B).
De daling van de HCB concentratie in het eerste stuk (t=0 t/m t=166 uur) is te
wijten aan sorptie (zie fig. 6b). Chloorbenzenen sorberen goed aan de glaswand, waardoor een verlies van HCB optreedt. De steriele flessen zullen hierdoor altijd een
lichte daling in HCB concentratie vertonen. De oplosbaarheid van HCB is i 5 /ig/1.
De flessen zijn echter gespiked met 20 /ig/1 HCB. In principe kan hierdoor krisallisatie
optreden waardoor bij bemonstering van de waterfase hooguit de maximaal oplosbare
10
hoeveelheid ( ± 5 /ig/1) kan worden gemeten. Tevens kan er verlies van HCB optreden door verdamping naar de headspace.
a)
HCB afbraak
b)
Cjedni
HCB afbraak
slenei
concentratie (ug/1)
concentratie (ug/l)
30
30
25
20
^ ^ - - - ^ - - ^
10 -
5
200
300
—-«
-
400
100
zoo
tijd (uren)
tijd (uren)
fles 1
fles 3
fles 5
—•—
- » •
" 0 -
fles 9
fles 2
—*—
-&••
fles 4
-©-
fles 6
•o-
300
*00
fles 8
-A-
Figuur 6: a) HCB afname in geente flessen. b) HCB afname in steriele flessen.
Het verschil in HCB afname van de geente en de steriele flessen is dusdanig groot,
dat de HCB afname in de geente flessen aan microbiele activiteit mag worden
toegeschreven. Dit wordt tevens ondersteund door de vorming van omzettingsproducten in de geente flessen. Hier zal in periode C nader op worden ingegaan. Hoewel de
HCB afname in fles 9 langzaam gaat, is de concentratie HCB hierin op t=4 weken
gedaald tot nul. De steriele flessen zijn dit niet. Dus ook de afname in fles 9 mag
worden toegeschreven aan microbiele activiteit. De micro-organismen hebben een
lange tijd (2-4 weken) nodig om HCB te dechloreren, omdat ze zich moeten aanpassen aan hun milieu en het substraat (HCB) en omdat populatie groei moet optreden.
De dechloreringssnelheid kan niet bepaald worden aangezien er geen betrouwbare
regressie uitgevoerd kan worden over drie punten.
43 Periode B
In de onderstaande tabel (Tabel I) zijn de dechlorerings-snelheidsconstanten van de
verschillende flessen uitgezet. Voor elke fles is het verdwijnen van HCB zeer goed te
beschrijven m.b.v. T-orde kinetiek. De correlatiecoefficient (r2) voor de regressievergelijking is voor elke fles groter dan 0.9.
Er is een zekere mate van spreiding te zien in de HCB dechlorerings-snelheidsconstanten. Dit is te verklaren doordat er kleine verschillen in de flessen zitten wat
betreft de samenstelling en celdichtheid. De ene fles is net weer iets optimaler voor
de micro-organismen dan^de andere fles.
11
Tabel I:
DechJorerings-snelheidsconstante van de verschillende flessen.
kj : dechlorerings-snelheidsconstante.
Fles nr.
1
3
5
11
13
17
19
23
24
25
27
kd(uur'1)
0.0525
0.0514
0.0347
0.0508
0.0345
0.0812
0.0680
0.0393
0.0221
0.0441
0.0683
jf
0.967
0.946
0.987
0.962
0.931
0.998
0.998
0.996
0.986
0.944
0.993
De gemiddelde dechlorerings-snelheidsconstante voor HCB, gebaseerd op alle geente
'flessen, is 0.050'uur'1 (s.d. ± 0.017*uur'). De halfwaarde tijd voor het dechloreringsproces is ± 14 uur. Hieruit blijkt duidelijk dat de omzetting van HCB nu vele malen
sneller verloopt dan in periode A. In periode A was de halfwaarde tijd immers 1-2
weken. Dat het dechloreringsproces in periode B veel sneller gaat is voornamelijk te
wijten aan de grotere celdichtheid in deze periode.
12
MteWMtfM
li
.....
4.4 Periode C
In de onderstaande tekst zal er naar de dechloreringsroute van HCB worden toegewerkt. Vaak zullen flesnummers genoemd worden waarin het experiment met de
desbetreffende CB is uitgevoerd. In bijlage I staat een overzicht van de fles nummers
met de bijbehorende CB.
Van elke CB zal worden aangegeven welk(e) dechloreringsproduct(en) deze oplevert
en in welke mate. Aan het eind zal in een schema worden aangegeven hoe de
dechloreringsroute van HCB verloopt.
HCBfflesD
HCB afbraak (I)
concentratie (nmol/l)
HCB afbraak (II)
concentratie (nmol/f)
140
200
300
100
400
tijd (uren)
HCB steriel
QCB
1235-TeCB
A
1245-TeCB
HCB" 1234-TeCB ~ ° ~
Figuur 7:
123-TCB
—I—
200
300
tijd (uren)
124-TCB
135-TCB
- -A
400
• •©•
HCB dechlorering en productvorming. I) HCB, QCB en TeCB's.
II) TCB's
Het HCB verdwijnt redelijk snel en is na ± 16 dagen (382 uur) helemaal verdwenen
(zie fig. 71). Er is geen drempelconcentratie zichtbaar waaronder HCB niet meer
gedechloreerd wordt. De dechlorerings-snelheidsconstante van HCB is berekend
m.b.v. de regressielijn (zie bijlage III, fig. 1) en bedraagt 0.017'uur' 1 met een r2 van
0.998.
Onmiddelijk na het toevoegen van HCB wordt QCB gevormd. QCB komt maar
weinig opzetten, wat doet vermoeden dat deze snel weer wordt omgezet in TeCB's.
De TeCB's komen pas na ± 24 uur opzetten. Van de TeCB's zijn alleen 1,2,3,5-TeCB
en 1,2,4,5-TeCB als omzettingsproducten zichtbaar. 1,2,3,5-TeCB verdwijnt ook weer,
terwijl 1,2,4,5-TeCB zich ophoopt. Pas na ± 10 dagen is er een lichte afname te
constateren. TeCB's worden omgezet in TCB's. 1,2,3-TCB wordt helemaal niet
gevonden. Van de overige TCB's wordt 1,3,5-TCB veel sneller gevormd dan 1,2,4TCB (zie fig. 711). Waarschijnlijk wordt 1,2,3,5-TCB dus hoofdzakelijk omgezet ing
1,3,5-TCB.
13
QCB (fles 3)
QCB afbraak (I)
QCB afbraak (II)
concentratie (nmol/1)
concemratie (nmol/l)
300
2S0
200
150
100
:
.*•••
n
sot_£'
200
400
100
tijd (uren)
QCB steriel
1235-TeCB
- A
1234-TeCB
1245-TeCB
~
— B-
QCB
Figuur 8:
200
300
«00
tijd (uren)
123-TCB 124-TCB 135-TCB
—-—
-*••••©
OCB dechlorering en productvorming. I) QCB en TeCB's.
II) TCB's.
Het QCB verdwijnt zeer snel. Opvallend is dat QCB veel sneller wordt afgebroken
dan HCB. Bijna drie keer zo snel. Na ± 7 dagen (166 uur) is QCB helemaal
verdwenen (zie fig. 81). Ook hier is er geen drempelconcentratie waaronder QCB niet
meer gedechloreerd wordt. De dechlorerings-snelheidsconstante is ook berekend
m.b.v. de regressielijn (zie bijlage III, fig. 2) en bedraagt 0.044'uur"1 met een r2 van
0.973.
QCB wordt omgezet in TeCB's. 1,2,3,5-TeCB wordt snel gevormd in een redelijk
grote concentratie (bijna 100 nmol/1 maximaal). Daarna verdwijnt het ook weer snel.
1,2,4,5-TeCB komt ook snel opzetten, daalt vervolgens enigzins en blijft dan vrijwel
constant. Na ± 70 uur is een lichte afname in de concentratie te constateren. Er
wordt nu geen 1,2,4,5-TeCB meer gevormd omdat QCB daar vrijwel verdwenen is. De
dechloreringssnelheid is dus niet groter of gelijk aan de vormingssnelheid aangezien
1,2,4,5-TeCB anders snel zou moeten verdwijnen zodra QCB verdwenen is. Een
grotere dechloreringssnelheid had anders de lage opkomst van 1.2,4,5-TeCB kunnen
verklaren.
1,2,3,4-TeCB wordt helemaal niet gevonden. Dit duidt er op dat 1,2,3,4-TeCB niet
gevormd wordt of dat de omzettingssnelheid (of dechloreringssnelheid) van 1,2,3,4TeCB groter of gelijk is aan z'n vormingssnelheid waardoor 1.2,3.4-TeCB niet gevonden wordt.
14
1,2,3,5-TeCB wordt van de TeCB's dus het meest gevormd en wordt ook het snelst
weer gedechloreerd. Dit is ook in overeenstemming met de resultaten die verkregen
zijn bij de HCB dechlorering en die zijn weergegeven in fig. 71.
De afbraak van de TeCB's heeft tot gevolg dat 1,2,4-TCB en 1,3,5-TCB zich langzaam
ophopen (zie fig. 811). Na ± 180 uur blijven ze constant. Van beide TCB's wordt
ongeveer evenveel gevormd. 1,2,3-TCB wordt niet gevonden. Hier geldt dezelfde
reden als voor het niet vinden van 1,2,3,4-TeCB. Bij de bespreking van fles 1 werd al
gesuggereerd dat 1,2,3,5-TeCB voornamelijk wordt omgezet in 1,3,5-TCB. Fig. 71 en II
lijken deze suggestie te bevestigen. In fig. 811 is duidelijk de vorming van 1,3,5-TCB te
zien. 1,3,5-TCB kan niet worden gevormd uit 1,2,3,4-TeCB of uit 1,2,4,5-TeCB. 1,3,5TCB moet dus wel het dechloreringsproduct zijn van 1,2,3,5-TeCB. Zodra 1,2,3,5,TeCB is verdwenen blijft de 1,3,5-TCB concentratie dan ook constant. Van 1,2,4-TCB
wordt evenveel gevormd als van 1,3,5-TCB. Dit kan verklaard worden doordat 1,2,4TCB een dechloreringsproduct is van zowel 1,2,4,5-TeCB als 1,2,3,5-TeCB.
Samenvattend kan gezegd worden dat QCB zeer snel omgezet wordt in 1,2,3,5-TeCB
en 1,2,4,5-TeCB, waarbij de voorkeur uitgaat naar 1,2,3,5-TeCB.
1.2.3.4-TeCB ("fles 5)
1234-TeCB afbraak
concentratie (nmo
300
250
100
200
300
* > < •
tijd (uren)
1234-TeCB
—*—
123-TCB
- - A - -
124-TCB 1234-TeCB sterie
• - <•>••
- a -
Figuur 9: 1,2,3,4-TeCB dechlorering en productvorming.
1,2,3,4-TeCB verdwijnt redelijk snel, maar er lijkt een drempelconcentratie te zijn (zie
fig. 9). Bij een concentratie van ± 10 nmol/1 wordt 1,2,3,4-TeCB niet meer verder
gedechloreerd. De dechlorerings-snelheidsconstante van 1,2,3,4-TeCB is berekend
m.b.v. de regressielijn (zie bijlage III, fig.3) en bedraagt 0.014*uur' met een r2 van
0.978. Deze is vrijwel gelijk aan die van fles 1 met HCB.
15
De dechlorering van 1,2,3,4-TeCB levert 1,2,4-TCB op als enig product. Ook uit de
massabalans blijkt dat 1,2,4-TCB het enige dechloreringsproduct is van 1,2,3,4-TeCB.
Deze klopt namelijk vrij goed (zie bijlage V, tabel III). Er is een lichte afname in de
massabalans te constateren. Dit kan verklaard worden door de langzame 1,2,4-TCB
dechlorering tot DCB's. Dit verklaard ook de lichte afname van 1,2,4-TCB in figuur 9
na -t 240 uur.
1,2,3-TCB wordt niet gevormd 6f de omzettingssnelheid (of dechloreringssnelheid) van
1,2,3-TCB is groter of gelijk aan z'n vormingssnelheid, waardoor 1,2,3-TCB niet
gevonden wordt. 1,3,5-TCB kan met uit 1,2,3,4-TeCB gevormd worden en is dus niet
van belang.
Samenvattend kan gezegd worden dat 1,2,4-TCB het dechloreringsproduct is van
1,2,3,4-TeCB.
1,2,3,5-TeCB ffles 25)
1235-TeCB afbraak
concentratie (nmol/l)
250
S.
»---v
roo •
/•*- — »
>^
- ^ /
jp'~*
[-\~-"
150
fy"\
-
i
100
—•-,
\
i
\
?
7
50
0
, A
A,-
A
0
*• M
100
\N
*
^
-4V
200
1
300
A
400
tijd (uren)
1235-TeCB
123JTCB
1235-TeCB steriel
124-TCB
135JCB
Figuur 10: 1,2,3,5-TeCB dechlorering en productvorming.
1,2,3,5-TeCB blijkt goed te dechloreren. De concentratie van 1,2,3,5-TeCB neemt snel
af maar blijft steken bij ± 25 nmol/1. Dit lijkt een drempelconcentratie te zijn (zie fig.
10). De dechloreringssnelheid is ongeveer hetzelfde als van HCB en 1,2,3,4-TeCB (zie
bijlage III, fig. 1 en 3). De dechlorerings-snelheidsconstante is weer berekend m.b.v.
de regressielijn (bijlage III, fig. 4) en bedraagt 0.01 T u u r ' met een r2 van 0.948.
De dechlorering van 1,2,3,5-TeCB levert twee producten op. Dit zijn 1,2,4-TCB en
1,3,5-TCB (zie fig. 10). 1,3,5-TCB hoopt zich sterk op. terwijl van 1,2,4-TCB maar
heel weinig gevormd wordt. Zodra 1,2,3,5-TeCB verdwenen is (na ± 160 uur), blijft
de 1,3,5-TCB concentratie constant. Dit geeft aan dat 1,3.5-TCB een dechlorerings16
product is van 1,2,3,5-TeCB. 1,2,3,5-TeCB wordt vrijwel geheel omgezet in 1,3,5-TCB.
Slechts een fractie wordt omgezet in 1,2,4-TCB. Deze resultaten bevestigen de eerder
geuitte vermoedens dat 1,2,3,5-TeCB voornamelijk in 1,3,5-TCB wordt omgezet.
1,2,3-TCB wordt met gevonden. Hiervoor geldt dezelfde reden als bij 1,2,3,4-TeCB.
De massabalans klopt, zeker in het laatste gedeelte, heel goed (zie bijlage V, tabel
IV). Dit houdt in dat er geen andere omzettingen hebben plaatsgevonden waardoor
een verlies aan producten kan ontstaan.
Samenvattend kan gezegd worden dat 1,2,3,5-TeCB vrijwel geheel wordt omgezet in
1,3,5-TCB. Slechts een fractie wordt omgezet in 1,2,4-TCB.
1.2.4.5-TeCB ffles i n
1245-TeCB afbraak
concentratie (nmol/l)
300
200
400
tijd (uren)
1245-TeCB 124-TCB 1245-TeCB steriel
Figuur 11: 1,2,4,5-TeCB dechlorering en productvorming.
Er blijkt een vrij grote spreiding in de metingen te zijn (zie fig. 11) Niettemin bestaat
het vermoeden dat 1,2,4,5-TeCB heel langzaam wordt gedechloreerd. Dit wordt met
name ingegeven door de lichte toename van 1,2,4-TCB. Een eventuele drernpelconcentratie is niet te bepalen binnen deze tijdsduur. Ook is de dechlorerings-snelheidsconstante niet berekend, omdat de dechlorering dan over een langere tijd
gevolgd moet worden. 1,2,4-TCB is het enige product dat theoretisch kan ontstaan
wanneer 1,2,4,5-TeCB gedechloreerd wordt.
Bij alle TCB's en DCB's is de dechlorerings-snelheidsconstante niet berekend, omdat de
concentraties van deze CB's te weinig afnam binnen de tijdsduur van het experiment.
17
•
' •
- •
• • • " •
~
--
. . . . . . .
1.2.3-TCB rfles 131
123-TCB afbraak
concentratie (nmol/I)
300
400
200
tijd (uren)
123-TCB
12-DCB
13-DCB
123-TCB steriel
-*-
«*•
•©•
-Er-
Figuur 12: 1,2,3-TCB dechlorering en productvorming.
De concentratie van 1,2,3-TCB neemt geleidelijk af (zie fig. 12). Dit wordt nog eens
bevestigd door de langzame toename van de 1,3-DCB concentratie (een dechloreringsproduct van 1,2,3-TCB). Over een eventuele drerapelwaarde kan geen uitspraak
worden gedaan binnen de tijdsduur van het experiment (0-382 uur).
Als enig dechloreringsproduct wordt 1,3-DCB gevonden. 1,2-DCB wordt niet gevonden, wat op zich niet hoeft te betekenen dat het niet gevormd wordt. In het eerste
stuk van de grafiek zitten wat onverklaarbare fluctuates in de concentraties van de
CB's, maar in het laatste stuk van de grafiek klopt de massabalans vrij redelijk (zie
bijlage V, tabel II). Dit bevestigd dat 1,2,3-TCB wordt omgezet in 1,3-DCB. Uit de
massabalans blijkt ook dat 1,3-DCB, en eventueel 1,2-DCB, niet of nauwelijks worden
omgezet in MCB's binnen dit tijdsbestek.
18
1.2.4-TCB ffles 17)
124-TCB afbraak
concentratie (nmol/1)
300
2O0
tijd (uren)
124-TCB 12-DCB 13-DCB 14-DCB 124-TCB steriel
-*-
-A--
"O-
-a-
— £,-
Figuur 13: Incubatie van 1,2,4-TCB.
1,2,4-TCB wordt niet gedechloreerd door de micro-organismen. De concentratie van
1,2,4-TCB blijft gedurende het hele experiment constant (± 200 nmol/1) (zie fig. 13).
Dit wordt nog eens bevestigd door het feit dat er geen dechloreringsproducten
worden gevonden.
1.3.5-TCB ffles 19)
135-TCB afbraak
concentratie (nmol/l)
300
400
200
tijd (uren)
135-TCB
13-DCB
-A-
135-TCB steriel
•-G--
Figuur 14: Incubatie van 1,3,5-TCB.
19
1,3,5-TCB wordt ook niet gedechloreerd. Ondanks de ietwat grillige lijn van 1,3,5-TCB
in de grafiek is er geen sprake van een daling in de concentratie van 1,3,5-TCB. Deze
blijft constant op ± 210 nmol/1 (zie fig. 14). Dat 1,3,5-TCB niet wordt gedechloreerd,
wordt nog eens bevestigd door het feit dat er geen significante hoeveelheid 1,3-DCB
wordt gevonden. 1,3-DCB is het enige product dat kan ontstaan wanneer 1,3,5-TCB
gedechloreerd wordt.
1,2-DCB (fles 27)
12-DCB afbraak
concef-tratie (nmol/l)
300
250
200
*oo
tijd (uren)
12-DCB
12-DCB steriel
Figuur 15: Incubatie van 1,2-DCB.
De lijn van 1,2-DCB in de grafiek (zie fig. 15) is zeer grillig. Er blijkt een grote
spreiding in de metingen te zijn. Enige daling in de 1,2-DCB concentratie is niet te
constateren. De concentratie van 1,2-DCB blijft schommelen tussen ± 180 en 210
nmol/1. Blijkbaar kan 1,2-DCB door de micro-organismen niet gedechloreerd worden.
20
1,3-DCB (fles 23)
13-DCB afbraak
concentratie (nmol/l)
500
400
300
200
100
100
200
tijd (uren)
13-DCB
13-DCB steriel
Figuur 16: Incubatie van 1,3-DCB.
De concentratie van 1,3-DCB daalt in de eerste 500 uur van ± 400 nmol/1 naar ± 200
nmol/1, waarna het constant blijft (zie fig. 16). De steriele fles vertoond echter
hetzelfde beeld, zodat van dechlorering door de micro-organismen geen sprake is.
1,4-DCB Tfles 24)
14-DCB
concentratie (nmol/1)
500
400
300
100
200
300
tijd (uren)
14-DCB
14-DCB steriel
Figuur 17: Incubatie van 1,4-DCB.
21
400
De lijn van 1,4-DCB in de grafiek is in het begin zeer grillig (zie fig. 17). Na ± 50 uur
is er een lichte daling in de concentratie te zien. Echter, door de grote spreiding van
de meetpunten in het begin kan er geen uitspraak worden gedaan over eventuele
dechlorering van 1,4-DCB. Mocht er omzetting plaatsvinden, dan gaat deze zeer
langzaam.
4.5 Onzichtbare metabolieten
Bij de QCB dechlorering wordt 1,2,3,4-TeCB helemaal niet gevonden. Dit duidt er op
dat 1,2,3,4-TeCB niet gevormd wordt of dat de omzettingssnelheid (of dechloreringssnelheid) van 1,2,3,4-TeCB groter of gelijk is aan z'n vormingssnelheid waardoor
1,2,3,4-TeCB niet gevonden wordt. Zoals blijkt uit de theorie is de vorming van
1,2,3,4-TeCB uit QCB de meest onvoordelige en zal 1,2,3,4-TeCB dus ook het minst
en het langzaamst gevormd worden. Het verwijderen van een chlooratoom dat
gelegen is tussen twee andere chlooratomen is gunstiger dan het verwijderen van een
chlooratoom dat maar den of geen chlooratoom naast zich heeft. Daarom is het
hoogst onwaarschijnlijk dat de vormingssnelheid van 1,2,3,4-TeCB groter of gelijk is
aan z'n dechloreringsnelheid. Stel nu dat QCB omgezet wordt in 1,2,3,4-TeCB en dat
dit vervolgens wordt omgezet in 1,2,4-TCB. De eerste stap is de snelheidsbepalende
stap. Eventueel gevormd 1,2,3,4-TeCB zal direct worden omgezet in 1,2,4-TCB en dus
niet gevonden worden. Op grond van de theorie is dus geen uitsluitsel te geven over
het al of niet vormen van 1,2,3,4-TeCB uit QCB. Echter, de massabalans voor de
QCB dechlorering klopt in het begin vrij goed (zie bijlage V, tabel I). Dit duidt er op
dat 1,2,3,4-TeCB noet gevormd wordt. Later treedt er een verschil op dat onder
andere aan vorming van DCB's uit TCB's
Deze redenering gaat ook op voor 1,2,3-TCB dat met gevonden wordt bij de 1,2,3,4TeCB- en 1,2,3,5-TeCB dechlorering en voor 1,3-DCB dat niet gevonden wordt bij de
1,2,3-TCB dechlorering. De massabalansen staan respectievelijk in bijlage V, tabel II,
III en IV.
4.6 De steriele (lessen
De meeste steriele flessen vertonen een lichte daling in de CB concentratie (zie fig. 7
t/m 17). Naarmate de CB meer gechloreerd is, is de daling duidelijker te zien. Zoals
al gezegd bij de bespreking van periode A, is een lichte daling in de concentratie van
de CB's in de steriele flessen te verklaren door sorptie aan de glaswand en de dop en
door verdamping naar de headspace. Sorptie aan micro-organismen (zoals die
plaatsvindt in de geente flessen) is hier niet van toepassing. Verdamping naar de
headspace is een langzaam proces en ook sorptie kan maar een geringe concentratiedaling veroorzaken.
Een sterke daling in de CB concentratie, zoals te zien is in fig. 71 en 81 is hiermee
niet te verklaren. Een mogelijke verklaring hiervoor kan zijn dat de CB's in zo'n hoge
concentratie worden toegevoegd dat ze kristalliseren, waardoor een veel lagere
concentratie gemeten wordt. De oplosbaarheid van HCB is tenslotte maar ± 5 /ig^l
(14).
22
Naarmate het CB molecuul minder chlooratomen bevat, wordt de oplosbaarheid
groter en de kans op kristallisatie minder. Uit de figuren 7 t/m 17 is dan ook te zien
dat de daling in de CB concentratie van de steriele flessen steeds minder wordt
naarmate het CB molecuul minder chlooratomen bevat Dit gegeven ondersteund de
gedachte dat de sterke daling in de CB concentratie van de steriele flessen in het
begin, een gevolg is van kristallisatie.
Dat de daling in de CB concentratie van de steriele flessen in de eerste 100 uur geen
gevolg is van microbiele activiteit blijkt ook uit het feit dat er geen dechloreringsproducten zijn gevonden in de steriele flessen. Ook in de andere steriele flessen zijn geen
dechloreringsproducten gevonden.
4.7 Afbraaksnelheden
Om de dechloreringssnelheden van de verschillende flessen onderling te kunnen
vergelijken is een normalisatiefactor (n) berekend uitgaande van de langzaamste fles.
Van de TCB's en de DCB's zijn de dechlorerings-snelheidsconstanten niet berekend
(zie biz 17) zodat de k, ook niet berekend kan worden. Door de dechloreringssnelheidsconstanten uit periode C (zie bijlage III) te delen door 'n' kunnen de
verschillende chloorbenzenen onderling vergeleken worden, wat betreft hun dechloreringssnelheid. Dit is samengevat in de onderstaande tabel.
Tabel II:
Dechlorerings-snelheidsconstante en halfwaarde tijd van de verschillende
flessen.
1-4B
n
Kc
t*s
K
:
:
:
:
:
dechloreririigs-snelheidsconstante uit periode B
genormaliseerde dechlorerings-snelheidsconstante
dechlorerings-snelheidsconstante uit periode C
halfwaarde tijd
genormaliseerde dechlorerings-snelheidsconstante uit periode C.
Fles nr. k^pfuurM
1
3
5
11
13
17
19
23
24
25
27
0.0525
0.0514
0.0347
0.0508
0.0345
0.0812
0.0680
0.0393
0.0221
0.0441
0.0683
n
k^fuur'l
2.376
2.326
1.570
2.230
1.561
3.674
3.077
1.778
1.000
1.995
3.090
40.77
0.017 (HCB)
0.044 (QCB)
15.75
0.014 (1234-TeCB) 49.51
0.007
0.019
0.009
0.011 (1235-TeCB) 63.01
0.005
23
t^/unr)
k T fuur"
Uit de tabel komt naar voren dat hoog gechloreerde CB's sneller anaeroob gedechloreerd worden dan laag gechloreerde CB's. Toch mag niet gezegd worden dat, hoe
meer chlooratomen aan de benzeenring, hoe sneller de dechlorering plaatsvindt. Uit
de genormaliseerde dechlorerings-snelheidsconstanten blijkt duidelijk dat QCB veruit
het snelst gedechloreerd wordt. Gevolgd door 1,2,3,4-TeCB, HCB en 1,2,3,5-TeCB.
De overige CB's worden niet of heel langzaam gedechloreerd. Het grote verschil in
dechloreringssnelheid van HCB tussen periode B en C is niet duidelijk. Men zou
verwachten dat dit ongeveer even snel moet gaan
4.8 De dechloreringsroute van HCB
In het onderstaande figuur is de dechloreringsroute van HCB uitgezet, afgeleid van de
resultaten uit § 4.4. Opgemerkt moet worden dat 1,2,3,4-TeCB wel is uitgezet in het
schema, maar geen onderdeel uitmaakt van de dechloreringsroute!
^1235-TeCB
H C B - ^ QCB^-1245-TeCB1234-TeCB
• ! 23-TCB
M 3-DCB
Figuur 18: Dechloreringsroute van HCB, afgeleid van de verkregen resultaten.
In de theorie werd al aangegeven dat het moeilijk is om laag gechloreerde benzenen
reductief te dechloreren. Ook bij dit experiment blijken de micro-organismen niet in
staat om de laag gechloreerde benzenen anaeroob te dechloreren. Met uitzondering
van 1,2,3-TCB. Dit wordt omgezet in 1,3-DCB. De dechloreringsroute zoals weergegeven in fig. 18 is ook gevonden door Fathepure et al (7), met uitzondering van de
omzetting van 1,2,3,5-TeCB naar 1,2,4-TCB. Van deze omzetting door micro-organismen is in de literatuur nog niet eerder melding gemaakt.
Uit fig. 11 komt naar voren dat 1,2,4,5-TeCB zeer langzaam gedechloreerd wordt
vanaf t=0. Een adaptatietijd lijkt niet aanwezig. Uit fig. 71 blijkt dat 1,2,4,5-TeCB pas
gedechloreerd wordt nadat HCB en 1,2,3,5-TeCB vrijwel verdwenen zijn. Dit zou een
geval van inhibitie kunnen zijn. Door welke CB de eventuele inhibitie wordt bewerkstelligd is niet duidelijk. Ook is niet duidelijk waarom inhibitie optreedt. Inhibitie is al
eens eerder gevonden voor anaerobe dechlorering van de DCB's. 1,3-DCB en 1,4DCB werden pas gedechloreerd nadat 1,2-DCB vrijwel helemaal was verdwenen (8).
24
5. CONCLUSIE
De anaerobe microbiele dechloreringsroute van HCB die gevonden is m.b.v. dit
experiment staat weergegeven in fig. 18. De primaire dechloreringsroute is: HCB —>
QCB - > 1,2,3,5-TeCB - > 1,3,5-TCB.
De secundaire dechloreringsroute is: HCB - > QCB - > 1,2,4,5-TeCB ~ > 1,2,4-TCB.
Van de omzetting van 1,2,3,5-TeCB in 1,2,4-TCB is in de literatuur nog niet eerder
melding gemaakt. Ook werd 1,2,3,4-TeCB omgezet in 1,2,3-TCB. Van deze omzetting
is in de literatuur ook nog niet eerder melding gemaakt. Deze omzetting maakt echter
geen deel uit van de dechloreringsroute van HCB.
Na een adaptatie tijd van ongeveer een maand blijken de micro-organismen in staat
om HCB snel te dechloreren. Ze blijken echter niet in staat om laag gechloreerde
benzenen (m.u.v. 1,2,3-TCB) reductief te dechloreren binnen een tijdsperiode van 380
uur. Hoog gechloreerde benzenen worden dus sneller gedechloreerd dan laag
gechloreerde benzenen. Toch mag niet gezegd worden, hoe meer chlooratomen aan
de benzeenring, hoe sneller de dechlorering plaatsvindt. QCB wordt namelijk veruit
het snelst gedechloreerd, gevolgd door 1,2,3,4-TeCB, HCB en 1,2,3,5-TeCB.
De dechloreringsroute van HCB is hier voor een groot deel opgehelderd. Om ook de
omzettingen van TCB's naar DCB's en MCB te kunnen bestuderen, zal de dechlorering over een langere tijdsperiode gevolgd moeten worden. Dan is echter nog niet te
zeggen of dechlorering gevonden wordt. Het kan zijn dat de micro-organismen
helemaal niet in staat zijn om laag gechloreerde benzenen te dechloreren. Ook niet
binnen een langere tijdsduur.
25
REFERENTIES
1)
Beurskens, J.E.M., Overzicht van organische microverontreinigingen in Ketelmeersediment, intern rapport RIZA, 1988.
2)
Meer, J.R. van der, Roelofsen, W., Schraa, G. en Zehnder, A.J.B., Degradation
of low concentrations of dichlorobenzenes and 1,2,4-trichloro- benzenes by
Pseudomonas sp. strain P51 in non-sterile soil columns, FEMS Microbiol. Ecol.,
1987, 45: 333 - 341.
3)
Schraa, G., Boone, M.L., Jetten, M.S.M.,Neerven, A.R.W. van, Colberg, P.J. en
Zehnder, A.J.B., Degradation of 1,4-dichIorobenzene by Alcaligenes sp.
strain A175, App. Env. Microbiol., Dec. 1986, 52-6: 1374 - 1381.
4)
Bont, J.A.M. de, Vorage, M.J.A.W, Hartmans, S. en Tweel, W.J.J, van den,
Microbial degragdation of 1,3-dichlorobenzene, App. Env. Microbiol., Okt.
1986, 52-4: 677 - 680.
5)
Spain, J.C. en Nishino, S.F., Degradation of 1,4-dichlorobenzene by a Pseudomonas sp., App. Env. Microbiol., Mei 1987, 53-5: 1010 - 1019.
6)
Tiedje, J.M., Boyd, S.A. en Fathepure, B.Z., Anaerobic degradation of
chlorinated aromatic hydrocarbons, Developments in Industrial Microbiology,
1987,27: 117- 127.
7)
Fathepure, B.Z., Tiedje, J.M. en Boyd, S.A., Reductive dechlorination of
hexachlorobenzene to tri- and dichlorobenzene in anaerobic sewage sludge,
App. Env, Microbiol., Feb. 1988, 54-2: 327 - 330.
8)
Bosma, T.N.P., Meer, J.R. van der, Schraa, G., Tros, M.E. and Zehnder,
A.J.B., Reductive dechlorination of all trichloro- and dichlorobenzene isomers,
FEMS Microbiol. Ecol., 1988, 53: 223 - 229.
9)
Tsuchiya, T. en Yamaha, T., Reductive dechlorination of 1,2,4,-trichlorobenzene by Staphylococcus epidermis isolated from intestinal contents of rats, Agric.
Biol. Chem., 1984, 48-6: 1545 - 1550.
10)
Vogel, T.M., Criddle, C.S. en McCarty, P.L, Transformations of halogenated
aliphatic compounds, Env. Sci. Techn., 1987, 21-8: 722 - 736.
11)
Farwell, S.O., Beland, F./-L en Geer, R.D. Reduction pathways of organohalogen compounds. Part I. Chlorinated benzenes, Electroanal. Chem. and
Interfacial Electrochem., 1975, 61: 303 - 313.
12)
Dekker, C.G.C., Microbiele afbraak van chloorbenzenen onder natuurlijke
omstandigheden, intern rapport RIZA, 1988.
26
13)
Dekker, C.G.C., Voorschrift anaerobe incubaties, intern rapport RIZA, 1991.
14)
J. Phys. Chem .Ref. Data, 1981, 10-4: 1193
27
BIJLAGE I
Overzicht van chloorbenzenen en fles nummer
Fles nr.
1
2
3
4
5
6
9
10
H
' 12
13
14
15
16
19
21
22
23
24
26
27
Chloorhp.n-^n
HCB (geent)
HCB (steriel)
QCB (geent)
QCB (steriel)
1,2,3,4-TeCB (geent)
1,2,3,4-TeCB (steriel)
1,2,3,5-TeCB (steriel)
1,4-DCB (steriel)
n.v.t.
1,2,4,5-TeCB (steriel)
1,2,4,5-TeCB (geent)
1,2,3-TCB (steriel) '
1,2,3-TCB (geent)
1,2,4-TCB (steriel)
1,3,5-TCB (steriel)
1,2-DCB (steriel)
1,2,4-TCB (geent)
1,3-DCB (steriel)
1,3,5-TCB (geent)
n.v.t.
n.v.t.
1,3-DCB (geent)
1,4-DCB (geent)
1,2,3,5-TeCB (geent)
bestaat niet
1,2-DCB (geent)
BIJLAGE II
Gebruikte afkortingen en symbolen
CB
HCB
QCB
TeCB
TCB
DCB
MCB
kd
k,
=
=
=
=
=
=
=
=
=
Chloorbenzeen
Hexachloorbenzeen
Pentachloorbenzeen
Tetrachloorbenzeen
Trichloorbenzeen
Dichloorbenzeen
Monochloorbenzeen
dechlorerings-snelheidsconstante
genormaliseerde dechlorerings-snelheidsconstante
BIJLAGE III
HCB afbraak
regressielijn
waterconcentratie (nmol/I)
k-=0,017/uur
r = 0.998
300
400
Figuur 1: HCB regressielijn
QCB afbraak
regressielijn
waterconcentratie (nmol/I)
300
k = 0,044/uur
r = 0.973
200
tijd (uren)
QCB
Figuur 2: QCB regressielijn
300
400
1234-TeCB afbraak
regressielijn
waterconcentratie (nmol/I)
300
k • 0,014/uur
r = 0,978
200
tijd (uren)
300
400
1234-TeCB
Figuur 3: 1234-TeCB regressielijn
1235-TeCB
regressielijn
waterconcentratie (nmol/I)
k = 0,011 / u u r
250>
-\
r 2 = 0.948
200
\
150
100
"
\
>
N;*
50
*^~-^-_
^"*-——-•—
*
0
100
200
tijd (uren)
1235-TeCB
F i g u u r 4 : 1235-TeCB regressielijn
300
400
BIJLAGE IV
Tabel A: HCB concentratie na 4 weken
van de geSnte flessen.
Tabel B: HCB concentratie na 4 weken
van de steriele flessen.
Fles nr.
Fles nr.
'.
1
3
5
9
11
13
17
19
21
23
24
25
27
Concentratie HCB
(ug/i)
0
0
0
0.20
1.72
0.19
0.07
0.25
7.49
0.20
0
0.13
0.27
2
4
6
8
Concentratie HCB
(ug/i)
3.23
5.48
4.94
5.77
BIJLAGE V
Tabel I:
punt
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Massabalans van QCB dechlorering (fles 3).
QCB
260.968
223.444
149.554
141.428
82.911
24.298
0.193
0
0
1234-TeCB 1235-TeCB 1245-TeCB 124-TCB 135-TCB totaal
48.172
56.577
372.153
0
0
6.436
354.342
12.384
43.046
2.064
18.221
55.183
40.94
349.625
45.704
55.657
2.019
55.751
358.723
53.212
49.969
57.179
56.935
0
401.062
55.954
97.233
76.017
2.944
86.003
76.491
336.172
107.645
47.896
1.334
78.508
69.744
252.281
123.736
0
58.608
0
287.114
140.712
40.347
106.055
0
0
114.367
134.374
278.511
29.77
0
0
1,2,3-TCB en de dichloorbenzenen werden
op geen van de meetpunten gevonden.
Tabel II:
Massabalans van 1,2,3,4-TeCB dechlorering (fles 5).
Concentratie chloorbenzeen op de meetpunten (nmol/I).
punt
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1234-TeCB 123-TCB
212.186
219.927
227.251
226.344
137.871
112.416
34.041
8.811
7.136
6.985
0
5.346
0
5.886
0
0
1.059
0.816
0
0
124-TCB
28.798
34.58
97.126
108.348
108.216
125.577
184.805
207.403
191.254
189.325
totaal
240.984
259.853
324.377
340.578
246.087
237.993
219.905
217.03
198.39
196.31
Dichloorbenzenen werden op geen van de meetpunten gevonden.
Tabel III:
Massabalans van 1,2.3,5-TeCB dechlorering (fles 25).
Concentratie chloorbenzeen op de meetpunten (nmol/I).
punt
1235-TeCB 123-TCB
250.423
233.023
205.736
185.777
146.553
95.22
89.505
39.908
25.911
23.56
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
124-TCB
135-TCB totaal
8.764
11.582
19.908
24.494
16.182
18.993
16.867
22.598
23.987
31.879
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
37.369
71.684
141.649
158.151
165.305
181.3
185.478
248.112
241.774
249.567
296.556
316.289
367.293
368.422
328.04
295.513
291.85
310.618
291.672
305.006
Dichloorbenzenen werden op geen van de meetpunten gevonden.
Tabel IV:
Massabalans van 1.2.3-TCB dechlorering (fles 13).
Concentratic chloorbenzeen op de meetpunten (nmol/I).
pun;
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Il23-TCB 112-DCB
235.084
2*6.233
185.103
* 53.042
229.55-.
187.054
'75.16
" 55.63
'.54.897
• 60.19
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
!l3-DC3
Itotaal
!
i
I 109.156
50 452
27.665
•51.308
: 318.2-*
j 266.6c£
. 212.S6S
231.25
i
!
22o.724
| 200.511
;
189.682
188.33s
1 94 36 ! 200325
19 171
i
13.457
24 722
22 658
29.463
40.146
BIJLAGE VI
Cl
Cl
Cl
Cl
Clr^^CI
Cl
Cl
Cl
HCB
Cl
ClrO^CI
Cl
QCB
Cl
1234-TeCB
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
1235-TeCB
1245-TeCB
123-TCB
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
124-TCB
Cl
Cl
Cl
135-TCB
12-DCB
Cl
Cl
Cl
Cl
13-DCB
14-DCB
MCB