Transcript Bio-farmaceutische bepaling van geneesmiddelen Deel IIc

Bio-farmaceutische bepaling
van geneesmiddelen
Deel
IIc,
vervolg
H. Lingeman
g e m o d i f i c e e r d e polaire silica f a s e n .
Afdeling Analytische Chemie en
De elutie vindt plaats door organische
h e t g e e n b e t e k e n t dat er n o g v o l -
Toegepaste Spectroscopie
o p l o s m i d d e l e n te gebruiken m e t e e n
d o e n d e g r o e p e n o v e r blijven die tij-
Vrije Universiteit De Boelelaan 1083,
h o g e elutiesterkte ( m e e r polair).
d e n s e e n extractie k u n n e n s t o r e n .
Indien IE-SPE w o r d t t o e g e p a s t zal
e e n v o u d i g v a s t te stellen o m d a t
1081 HV Amsterdam
g r o e p e n a f g e s c h e r m d kan w o r d e n ,
De pKa v a n e e n s i l a n o l g r o e p is niet
Vervolg 2.8
het duidelijk zijn dat i o n o g e n e inter-
deze sterk w o r d t b e ï n v l o e d t d o o r
Interacties en selectiviteit
acties een p r o m i n e n t e plaats inne-
zijn o m g e v i n g . W e l kan w o r d e n
m e n . Deze electrostatische interac-
gesteld d a n bij e e n p H < 2 silica
Bij gebruik v a n a p o l a i r e fasen (RP-
ties zijn veel sterker (50-200 Kcal/
o n g e l a d e n en bij e e n p H > 2 silica
SPE) geldt dat v o o r n a m e l i j k z w a k k e
M o l ) d a n d e eerder besproken
negatief g e l a d e n is e n d a t d e lading
interactiekrachten (2 Kcal/mol), zoals
h y d r o f o b e interacties w a a r d o o r a n a -
t o e n e e m t bij h o g e r e p H . O m d a t de
dispersie of v a n der W a a l s krachten,
lieten veel beter w o r d e n v a s t g e h o u -
interactiekrachten v a n i o n o g e n e bin-
een rol s p e l e n . De reden dat het
d e n , m a a r w a a r d o o r ook de elutie
d i n g e n groter zijn d a n v a n h y d r o f o b e
r e t e n t i e v e r m o g e n v a n de m e e s t e
veel moeilijker verloopt. IE fasen
interacties, levert dit m e e s t a l e e n
RP-SPE m a t e r i a l e n t o c h t a m e l i j k
k u n n e n z o w e l op silica als o p e e n
complex retentiemechanisme op.
g r o o t is k o m t d o o r d a t deze krachten
p o l y m e e r zijn g e b a s e e r d en o p het
H e t g e v o l g h i e r v a n is d a t het r e t e n -
m e e s t a l c u m u l a t i e f zijn. De vaste
oppervlak zijn of sterke of zwakke
t i e g e d r a g moeilijk is t e v o o r s p e l l e n
fasen die in dit geval w o r d e n gebruikt
ion-wisselingsgroepen a a n w e z i g .
e n dat p i e k v e r b r e d i n g e n piektailing
bestaan uit g e m o d i f i c e e r d silica
De analieten m o e t e n een i o n o g e e n
kan o p t r e d e n .
(b.v., C-18 - > C - 1 , P H , C N , CH) of
of ioniseerbaar karakter h e b b e n ,
p o l y m e r e m a t e r i a l e n (b.v. S D B ) .
terwijl deze in het a l g e m e e n in een
O m de o n g e w e n s t e i n v l o e d e n v a n
De analieten zullen in het a l g e m e e n
w a t e r i g e matrix m e t een lage ion-
d e a a n w e z i g e residuele silanolgroe-
een relatief apolair karakter h e b b e n ,
sterkte (< 0,1 M ) a a n w e z i g m o e t e n
p e n t e v e r m i n d e r e n k u n n e n silica
terwijl d e matrix in veel gevallen een
zijn. Verder is het belangrijk dat in
f a s e n , zoals g e z e g d , w o r d e n a f g e -
polair c.q. ' w a t e r i g ' karakter heeft.
het m o n s t e r g e e n t e g e n i o n e n m e t
s c h e r m d . Dit kan g e b e u r e n m e t
Elutie v a n de analieten zal plaats
e e n h o g e selectiviteit a a n w e z i g zijn.
b e h u l p v a n e e n c o v a l e n t e reactie
v i n d e n m e t m e t h a n o l of e e n oplos-
Elutie v a n de analieten kan plaats-
of m e t b e h u l p v a n e e n d y n a m i s c h e
m i d d e l m e t n o g h o g e r e elutiesterk-
v i n d e n d o o r de pH te v e r a n d e r e n of
reactie. R e a g e n t i a die in dit laatste
t e , dit afhankelijk v a n de oplosbaar-
door het toevoegen van een geschikte
g e v a l w o r d e n gebruikt zijn t r i e t h y l -
heid v a n de a n a l i e t e n e n d e inter-
buffer, m e t een hoge(re) ionsterkte
a m i n e of a m m o n i u m a c e t a a t . Een
acties hiervan m e t d e vaste f a s e .
of het gebruik v a n m e e r selectieve
a n d e r alternatief is het a a n p a s s e n
tegenionen.
v a n d e p H . Dit kan o p t w e e m a n i e -
polaire vaste fase s p e l e n polaire
In de praktijk zijn het echter vaak
w a a r d o o r silica zelf o n g e l a d e n is of
interacties zoals d i p o o l - d i p o o l e n H-
m e e r v o u d i g e interacties die het
het kiezen v a n e e n p H w a a r b i j d e
brug v o r m i n g e e n belangrijke rol.
r e t e n t i e m e c h a n i s m e v a n een v e r b i n -
analiet(en) g e e n lading m e e r h e b -
NP-SPE kan gebruikt w o r d e n v o o r
ding verklaren. Een bekend voor-
b e n . Belangrijk is d a n dat er g e e n
analiet(en) die g o e d of redelijk g o e d
beeld is de c o m b i n a t i e v a n apolaire
pH w o r d t gekozen waarbij de ana-
o p l o s b a a r zijn in organische oplos-
en i o n o g e n e interacties. Dit heeft
l i e t e n ) instabiel zijn. Een mogelijk-
m i d d e l e n . De m a t r i x bestaat in dit
v a a k als v o o r d e e l dat het d o o r b r a a k -
h e i d die d e laatste p a a r jaar steeds
geval veelal uit een extract v a n d e
v o l u m e v a n de analieten t o e n e e m t ,
belangrijker w o r d t is het kiezen v a n
analiet(en) in e e n geschikt organisch
m a a r als nadeel dat het e l u t i e v o l u m e
d e juiste v a s t e fase, dit o m d a t f a b r i -
o p l o s m i d d e l zoals d i c h l o o r m e t h a a n ,
eveneens toeneemt.
ren g e b e u r e n : bij e e n pH v a n < 4
Bij gebruik v a n N P - S P E o p e e n
h e x a a n of ethylacetaat. Het g e v o l g
kanten t e g e n w o o r d i g speciaal zuurof b a s e - g e d e a c t i v e e r d e m a t e r i a l e n
hiervan is d a t NP-SPE v a a k w o r d t
Silanol
t o e g e p a s t in c o m b i n a t i e m e t e e n
Een belangrijk p r o b l e e m bij het
activiteit:
op de markt brengen.
LLE p r o c e d u r e o m de selectiviteit
gebruik v a n g e m o d i f i c e e r d e silica
Indien het niet m o g e l i j k is o m de
v a n de t o t a l e analyse te v e r b e t e r e n .
m a t e r i a l e n is dat zelfs na een zeer
activiteit v a n d e s i l a n o l g r o e p e n in
Als vaste f a s e n w o r d e n z o w e l niet
g o e d uitgevoerde a f s c h e r m i n g s
v o l d o e n d e m a t e t e r u g te d r i n g e n is
g e m o d i f i c e e r d silica e n a l u m i n a
(endcappen) procedure slechts
het m o g e l i j k o m d e ionsterkte, v a n
gebruikt a l s m e d e d e c h e m i s c h
m a x i m a a l 7 0 % v a n alle vrije silanol
d e c o n d i t i o n e r i n g s - en wasvloeistof-
fen en v a n het m o n s t e r te v e r h o g e n
ge g e b e u r t a c h t e r e e n v o l g e n s m e t
molecuulgewicht van < 500 kunnen
zodat er g e e n competitie m e t de vrije
w a t e r en acetonitril. Acetonitril kan
de v o l g e n d e richtlijnen w o r d e n t o e -
silanolgroepen m e e r kan o p t r e d e n .
in dit geval w o r d e n gebruikt o m d a t
gepast:
Een v o o r b e e l d o m de activiteit v a n
d e analiet d o o r i o n o g e n e interacties
de vrije s i l a n o l g r o e p e n t e v e r m i n d e -
w o r d t v a s t g e h o u d e n , w a a r d o o r het
ren is beschreven v o o r d e extractie
organisch o p l o s m i d d e l in staat is
van c h l o o r p r o m a z i n e m e t b e h u l p
v e r b i n d i n g e n die d o o r h y d r o f o b e
m e t e e n v e r g e l i j k b a r e structuur, al
van een C-18 cartridge. De vaste
interacties w o r d e n v a s t g e h o u d e n te
SPE f LC p r o c e d u r e s zijn beschre-
fase w o r d t eerst g e a c t i v e e r d m e t
v e r w i j d e r e n . Elutie v a n s a l b u t a m o l
v e n . De aard v a n d e f u n c t i o n e l e
methanol gevolgd door een condi-
g e b e u r t m e t m e t h a n o l dat 0 , 5 %
g r o e p e n e n d e t o t a l e polariteit
tionering m e t e e n w a t e r i g e oplos-
a m m o n i u m acetaat bevat.
v a n het m o l e c u u l zijn hierbij de
sing v a n t e t r a m e t h y l a m m o n i u m
1. Bestudeer d e literatuur of er v o o r
d e a n a l i e t ( e n ) , of v e r b i n d i n g e n
belangrijkste f a c t o r e n .
h y d r o x i d e ( T M A H ) . Het doel v a n
Hergebruik
van
fasen:
deze stap is o m d e s i l a n o l g r o e p e n
Indien cartridges w o r d e n b e w a a r d in
te neutraliseren en d e analiet(en)
hun originele ( v a c u ü m ) verpakking
alleen m e t behulp v a n niet-specifieke
k u n n e n ze g e d u r e n d e lange tijd w o r -
Het g a a t hier b i j v o o r b e e l d o m de
hydrofobe interacties vast t e h o u d e n .
d e n b e w a a r d . Indien d e v e r p a k k i n g
o p l o s b a a r h e i d e n d e ionisatie
m o g e l i j k h e d e n v a n het m o l e c u u l .
2. Bestudeer d e fysisch-chemische
e i g e n s c h a p p e n v a n d e analiet(en).
Hierna w o r d t het monster opgebracht
is g e o p e n d is het belangrijk dat d e -
en w o r d t er m e t w a t e r g e w a s s e n .
activering o n d e r invloed v a n v o c h t
Kennis o m t r e n t deze p a r a m e t e r s
A a n beide vloeistoffen w o r d t T M A H
w o r d t v e r m e d e n . Eén v a n de m o g e -
geeft a a n w e l k r e t e n t i e m e c h a n i s -
t o e g e v o e g d o m t e v o o r k o m e n dat
lijkheden is het v e r w i j d e r e n v a n d e
m e (b.v. i o n - w i s s e l i n g , h y d r o f o b e
het a m i n e v a n d e cartridge w o r d t
lucht uit de verpakking en vervolgens
interactie) er g e b r u i k t kan w o r d e n .
g e s p o e l d . In de v o l g e n d e stap w o r d t
het b e w a r e n o n d e r v a c u ü m .
de cartridge o n d e r stikstof g e d r o o g d
3. D e polariteit v a n d e m a t r i x bepaalt
en w o r d t de analiet m e t c h l o r o f o r m
SPE cartridges kunnen zoals g e z e g d
m e t n a m e w e l k e fase er gebruikt
g e ë l u e e r d . C h l o r o f o r m is g e k o z e n in
w o r d e n hergebruikt, d o o r ze na e e n
kan w o r d e n . Bij w a t e r i g e monsters,
dit geval o m dat T M A H hierin slecht
elutie o p n i e u w te c o n d i t i o n e r e n /
m e t neutrale a n a l i e t ( e n ) , kan bij-
oplost. Een selectieve o p z u i v e r i n g
a c t i v e r e n , m a a r bij de extractie v a n
v o o r b e e l d het beste e e n h y d r o f o -
vindt v e r v o l g e n s plaats m e t b e h u l p
v o l b l o e d of a n d e r e m o n s t e r s die
be interactie m e t b e h u l p v a n e e n
v a n een geactiveerde silica cartridge.
h o g e concentraties aan e i w i t t e n of
a p o l a i r e fase w o r d e n gebruikt.
v e t a c h t i g e v e r b i n d i n g e n b e v a t t e n is
De a a n w e z i g h e i d v a n vrije silanol-
dit zeker niet aan t e b e v e l e n .
SPE procedures, in e e n aantal g e v a l -
4. Indien v o o r d e analiet(en) al e e n
LC m e t h o d e beschikbaar is d a n
g r o e p e n is niet altijd e e n nadeel in
In d e literatuur w o r d t een p r o c e d u r e
geeft d e s a m e n s t e l l i n g v a n het
LC e l u e n s i n f o r m a t i e o m t r e n t
len kan dit w o r d e n gebruikt o m het
beschreven die gebruikt kan w o r d e n
d o o r b r a a k v o l u m e te v e r h o g e n of
o m C-18 cartridges te r e g e n e r e r e n
d e elutie condities die gebruikt
o m de selectiviteit te v e r b e t e r e n .
nadat deze gebruikt zijn v o o r d e
kunnen worden.
O m g e b r u i k t e kunnen maken van
extractie v a n peptiden uit biologisch
de a a n w e z i g e vrije s i l a n o l g r o e p e n
m a t e r i a a l . Allereerst w o r d e n de car-
m o e t e e n niet a f g e s c h e r m d e silica
tridges g e w a s s e n m e t 4 ml m e t h a n o l
fase w o r d e n gebruikt en m o e t d e pH
of acetonitril, g e v o l g d d o o r 4 m l 8 M
is het belangrijk o m verschillende
v a n de conditionerings buffer m i n i -
u r e u m en 4 m l water. Hierna kan d e
a p o l a i r e f a s e n uit te t e s t e n . De pH
m a a l 3 zijn. O m r e p r o d u c e e r b a a r t e
hele procedure v a n activering e n
is in veel g e v a l l e n een belangrijke
kunnen w e r k e n is het belangrijk dat
conditionering weer opnieuw wor-
p a r a m e t e r o m d e retentie, e n dus
een buffer w o r d t t o e g e p a s t en niet
d e n u i t g e v o e r d . Een v o o r b e e l d is
het d o o r b r a a k v o l u m e , v a n e e n
alleen a a n g e z u u r d water.
beschreven v o o r het peptide o x y t o -
v e r b i n d i n g t e r e g e l e n . In het alge-
5. Indien v o o r d e LC scheiding e e n
RP s y s t e e m w o r d t gebruikt, d a n
Een aardig v o o r b e e l d hiervan is de
cine. Dit kan bijvoorbeeld v a n u i t e e n
m e e n w o r d t e e n s o r b e n s gebruikt
extractie v a n s a l b u t a m o l v a n u i t plas-
celcultuur w o r d e n g e ë x t r a h e e r d m e t
w a a r v a n de polariteit o n g e v e e r
o v e r e e n k o m t m e t die v a n d e a n a -
m a . In dit geval w o r d t niet g e m o d i f i -
b e h u l p v a n RP-SPE. Z o n d e r verlies
ceerd silica gebruikt en w o r d t de
in recovery kan e e n cartridge 5 m a a l
liet(en) in het m o n s t e r v a n t e g e n -
cartridge geactiveerd en g e c o n d i t i o -
w o r d e n gebruikt. De regeneratie
o v e r g e s t e l d e polariteit. Dit bete-
neerd m e t m e t h a n o l en e e n geschik-
v i n d t in dit geval plaats m e t 3 m l
kent dat bij e e n relatief apolair
te buffer. Vervolgens w o r d t het m o n -
methanol.
m o l e c u u l , dat a a n w e z i g is in e e n
ster opgebracht en w o r d t s a l b u t a m o l
w a t e r i g monster, bij v o o r k e u r e e n
v a s t g e h o u d e n d o o r i o n o g e n e inter-
2.9 Methode
acties m e t de a a n w e z i g e silanol-
Bij het o n t w i k k e l e n v a n een SPE
f a s e w o r d t gebruikt, dat relatief
g r o e p e n . Het w a s s e n v a n d e cartrid-
p r o c e d u r e v o o r analiet(en) m e t e e n
polaire w a s v l o e i s t o f f e n en e e n
ontwikkeling
octyl (C-8) of e e n octadecyl (C-18)
relatief apolaire elutievloeistof
een grotere capaciteit m e t zich
worden toegepast.
m e e b r e n g t , m a a r ook grotere
w o r d e n ontwikkeld voor de
e l u t i e v o l u m i n a . Dit is d a n ook de
zuivere s t a n d a a r d o m h i e r m e e de
reden dat vaak de v o o r k e u r w o r d t
detecteerbaarheid, gevoeligheid,
6. Belangrijk is het o m d e recoveries
v a n de a n a l i e t ( e n ) , z o w e l o p g e l o s t
4. Allereerst m o e t e e n m e t h o d e
g e g e v e n aan 100 m g cartridges.
lineariteit, r e p r o d u c e e r b a a r h e i d ,
in w a t e r als in het m o n s t e r m e t
etc. t e b e p a l e n . Indien d e extracten
elkaar te v e r g e l i j k e n . Dit kan in
A n d e r e factoren die belangrijk zijn
vervolgens m e t LC w o r d e n bepaald
e e n aantal g e v a l l e n g r o t e verschil-
bij het ontwikkelen v a n e e n SPE pro-
k u n n e n de g e g e v e n s v a n b e i d e
len g e v e n d o o r d a t d e analiet(en)
c e d u r e zijn:
m e t h o d e n m e t elkaar v e r g e l e k e n
e e n interactie a a n g a a n m e t m a t r i x
c o m p o n e n t e n . Bekende v o o r b e e l d e n zijn de b i n d i n g v a n g e n e e s m i d d e l e n aan p l a s m a e i w i t t e n en
worden.
1. De zuivere standaard v a n de
5. Belangrijk is dat d e selectiviteit o p
analiet(en) m o e t beschikbaar zijn.
t w e e m a n i e r e n w o r d t bekeken in
2. G e g e v e n s m e t betrekking tot de
SPE: Selectiviteit t e n opzichte v a n
d e adsorptie v a n b e s t r i j d i n g s m i d -
structuur en de fysisch-chemische
d e a n a l i e t ( e n ) , d o o r het kiezen v a n
delen aan h u m u s bestanddelen.
eigenschappen van zowel de
d e juiste v a s t e fase e n a d d i t i o n e l e
In d e m e e s t e g e v a l l e n betekent
analiet(en) als de m a t r i x m o e t e n
selectiviteit d o o r het kiezen v a n d e
dit dat de recoveries in echte
beschikbaar zijn. Verder is het
juiste elutievloeistof.
m o n s t e r s significant lager zijn d a n
belangrijk of d e analiet(en) func-
in water. Het o m g e k e e r d e effect is
tionele g r o e p e n bevatten die v o o r
O m e e n SPE p r o c e d u r e te o p t i m a l i -
echter ook w a a r g e n o m e n . Plasma
de extractie gebruikt k u n n e n w o r -
s e r e n , kan e e n radioactief g e l a b e l d e
v e r b i n d i n g w o r d e n gebruikt. D o o r
eiwitten kunnen bijvoorbeeld
d e n e n of deze g r o e p e n a n d e r s
actieve silanol g r o e p e n , a a n w e z i g
zijn d a n de functionele g r o e p e n
d e h o e v e e l h e i d radioactiviteit in d e
o p het s o r b e n s , a f s c h e r m e n w a a r -
die in de matrix a a n w e z i g zijn.
v e r s c h i l l e n d e fracties te b e p a l e n kan
d o o r d e recoveries in p l a s m a
De concentratie of het concentratie-
bijzonder snel e e n p r o b l e e m w o r d e n
h o g e r zijn d a n in w a t e r .
gebied v a n de analiet(en) bepaalt
gelokaliseerd of de e x a c t e recovery
m e d e het r e t e n t i e m e c h a n i s m e dat
worden bepaald.
kan w o r d e n t o e g e p a s t .
Een alternatief v o o r het gebruik v a n
7. De elutie v a n d e analiet(en) v a n d e
cartridge m o e t o p een z o d a n i g e
m a n i e r plaatsvinden dat het m o n ster niet o n n o d i g w o r d t v e r d u n d .
3. Het doel v a n de extractie m o e t
r a d i o g e l a b e l d e v e r b i n d i n g e n is o m
v a n a f het begin duidelijk zijn.
e e n oplossing v a n d e analiet d o o r
Is het alleen v e r w i j d e r i n g v a n
v e r s c h i l l e n d e cartridges te laten
storende c o m p o n e n t e n , is het e e n
lopen en v e r v o l g e n s d e verschillen-
v e r b e t e r i n g v a n de detectie of is
de fracties o p a a n w e z i g h e i d v a n d e
a a n g e p a s t w o r d e n a a n het pro-
het v e r w i j d e r e n v a n v e r b i n d i n g e n
analiet te o n d e r z o e k e n . D e f a s e n die
bleem. Wel moet opgemerkt wor-
die de levensduur v a n de a n a l y t i -
d e analiet v a s t h o u d e n w o r d e n in
d e n dat m e e r sorbens natuurlijk
sche k o l o m v e r m i n d e r e n ?
e e n v o l g e n d e stap g e ë l u e e r d m e t
8. De h o e v e e l h e i d vaste fase kan
Figuur 4 Bepaling van doorbraakvolume met behulp van 'frontal chromatography'
braakvolume met behulp van elutie chromatografie (b).
techniek (a) en bepaling van door-
1 m l h o e v e e l h e d e n m e t h a n o l , 0,1 M
Schema 1
M e t h o d e ontwikkeling m a t r i x afhankelijke SPE
a m m o n i a in m e t h a n o l en 0,1 M
azijnzuur in m e t h a n o l e n dit w o r d t
Waterige matrix
>
RP, IP of IE SPE
net zo lang vol g e h o u d e n t o t d a t er
Polaire organische m a t r i x
>
Na verdunnen met water:
Een derde m o g e l i j k h e i d o m recover-
A p o l a i r e organische matrix
>
N P SPE
ies te b e p a l e n is d o o r gebruik t e
Vaste m a t r i x
>
Solubiliseren door verdunnen met
elutie plaatsvindt.
RP, IP of IE SPE
m a k e n v a n een ' n u l m o n s t e r ' . Dit is
geschikt o p l o s m i d d e l e n v e r v o l g e n s
een m o n s t e r dat al is g e ë x t r a h e e r d
kiezen uit é é n v a n d e h i e r b o v e n
en dus g e e n analiet(en) m e e r m a g
g e n o e m d e categorieën
bevatten.
2.10 Doorbraakvolume en
Schema 2
M e t h o d e ontwikkeling analiet afhankelijke SPE
capaciteit
De h o e v e e l h e i d m o n s t e r die o p e e n
G e ï o n i s e e r d e analiet
cartridge gebracht kan w o r d e n is af-
Polaire analiet
hankelijk v a n e e n aantal p a r a m e t e r s :
A p o l a i r e analiet
>
— >
>
de concentratie v a n alle v e r b i n d i n g e n
die in het m o n s t e r a a n w e z i g zijn,
elutiesterkte v a n d e m a t r i x , keuze
v a n de vaste fase, h o e v e e l h e i d v a n
lossing w o r d t via de cartridge naar
de vaste fase en capaciteitsfactor
e e n U V detector g e p o m p t . Indien
v a n de analiet(en).
er g e e n cartridge a a n w e z i g is d a n
w o r d t de absorptie v a n de analiet o p
Het d o o r b r a a k v o l u m e e n d e capaci-
A
teit v a n d e cartridges zijn h i e r v a n d e
volledig w o r d e n v a s t g e h o u d e n o p d e
SPE cartridges, is ca. 2 0 . Dit betekent
belangrijkste p a r a m e t e r s . D e capaci-
cartridge en zal er g e e n signaal zijn.
dat e e n v e r b i n d i n g m e t e e n k' v a n
teit v a n d e m e e s t e c o m m e r c i e e l ver-
Op een bepaald m o m e n t w o r d t de
10 in w a t e r het d o o r b r a a k v o l u m e
krijgbare cartridges is, bij e e n g o e d e
analiet niet m e e r v o l l e d i g v a s t g e -
slechts 0,7 m l is e n dat dit v o o r e e n
keuze v a n d e cartridge, z e l d e n d e
h o u d e n e n zal deze g a a n d o o r b r e -
c o m p o n e n t m e t e e n k' v a n 100 in
b e p e r k e n d e factor. Het d o o r b r a a k -
ken ( V ) e n zal de absorptie t o e n e -
d e buurt v a n d e 7 m l ligt.
v o l u m e is v a a k w e l e e n kritische
m e n t o t d a t deze gelijk is a a n A
parameter. Deze p a r a m e t e r b e p a a l t
(V ). V
de h o e v e e l h e i d monster, d e h o e v e e l -
als zijnde 1 % v a n A
heid v a n d e analiet in e e n g e g e v e n
v a n A . In het ideale geval is d e
h o e v e e l h e i d v a n een b e p a a l d o p l o s -
g e v o n d e n d o o r b r a a k c u r v e logarit-
o n d e r v e r d e e l d in m e t h o d e n w a a r b i j
m i d d e l , dat o p d e cartridge kan w o r -
misch v a n v o r m e n k o m t het b u i g -
voornamelijk de eigenschappen van
den gebracht, zonder dat het door-
punt o v e r e e n m e t het r e t e n t i e v o l u -
d e analiet(en) e e n belangrijke rol
breekt (afgespoeld w o r d t ) .
m e ( V ) . V is e e n b e k e n d e g r o o t h e i d
s p e l e n e n m e t h o d e n w a a r b i j ook
uit de LC en kan als volgt w o r d e n
d e m a t r i x e e n belangrijke rol speelt.
Zie Figuur 4 hiernaast.
bepaald:
In de schema's 1 en 2 (zie hierboven)
Er zijn een aantal m a n i e r e n o m het
V = V ( 1 +k')
v o o r w e l k e v o r m van SPE kan w o r d e n
gesteld. In het begin zal d e analiet
0
b
m
b
0
wordt meestal gedefinieerd
0
en V
m
als 9 9 %
0
r
Een a a r d i g e w a a r d e v o o r N , v o o r
r
2.11 Algemene
methode
ontwikkeling
SPE p r o c e d u r e s k u n n e n w o r d e n
is a a n g e g e v e n w a n n e e r , als richtlijn,
r
0
gekozen. In het a l g e m e e n kan gezegd
doorbraakvolume te bepalen. Eén v a n
w o r d e n dat v o o r neutrale v e r b i n d i n -
de m o g e l i j k h e d e n is o m gebruik t e
Dit betekent dat V
m a k e n v a n 'frontal c h r o m a t o g r a p h y '
kan w o r d e n indien de k' v a n d e a n a -
g e n RP e n (NP) d e m e e s t e geschikte
(FC). Bij FC w o r d t e e n m o n s t e r c o n -
liet in w a t e r bekend is. De k' in w a t e r
v o r m e n zijn, terwijl v o o r geladen ver-
tinu over de cartridge g e l e i d , tot het
kan v a a k w o r d e n berekend d o o r
bindingen IS ( i o n - o n d e r d r u k k i n g ) , IP
m o m e n t dat d e v e r b i n d i n g e n in dit
extrapolatie. Dit o m d a t er m e e s t a l
(ion-paar) en IE (ion-wisseling) het
monster in het eluens verschijnen
e e n lineair v e r b a n d bestaat tussen
meest voor de hand liggen.
(Figuur 4A). Het d o o r b r a a k v o l u m e
d e log k' en het percentage modifier.
kan m e t b e h u l p v a n e e n e e n v o u d i g e
Een berekening kan o p de v o l g e n d e
In d e praktijk ligt het v a a k iets g e -
opstelling, als w e e r g e g e v e n in
manier worden uitgevoerd, aanne-
n u a n c e e r d e r . Indien b i j v o o r b e e l d
b
ook b e r e k e n d
Figuur 4A, w o r d e n b e p a a l d . De
m e n d e dat e e n 100 m g C-18 cartrid-
een monster opgezuiverd moet
analiet (S) w o r d t in e e n relatief
ge w o r d t gebruikt m e t e e n porositeit
w o r d e n w a a r i n de v e r o n t r e i n i g i n g e n
h o g e concentratie o p g e l o s t in e e n
v a n 0,65 . V
geschikt o p l o s m i d d e l en deze o p -
cartridge o n g e v e e r 120
0
is v o o r e e n 100 m g
p o l a i r d e r zijn d a n d e analiet(en)
w o r d t e e n RP s y s t e e m gebruikt.
kan w o r d e n t o e g e p a s t . I n d i e n het
o m d a t dan d e v e r o n t r e i n i g i n g e n
m e t het d o o d v o l u m e zullen e l u e r e n .
sterker v a s t g e h o u d e n zullen
In dit soort gevallen m o e t v a n te
noodzakelijk is o m N P - S P E t e
w o r d e n d o o r de vaste fase d a n de
v o r e n w o r d e n bestudeerd of het m e t
g e b r u i k e n kan het m o n s t e r g e h o m o -
analiet(en). M e e s t a l w o r d e n d e a n a -
d e t o e g e p a s t e SPE procedure m o g e -
geniseerd w o r d e n met hexaan,
liet(en) v a s t g e h o u d e n o p d e cartrid-
lijk is o m d e b i n d i n g e n tussen d e
d i c h l o o r m e t h a a n of c h l o r o f o r m . Bij
g e terwijl de i n t e r f e r e r e n d e c o m p o -
analiet en de m a c r o m o l e c u l e n los
d e extractie v a n v e t a c h t i g e m o n s t e r s
n e n t e n v a n de k o l o m w o r d e n
te m a k e n zodat e e n n o r m a l e SPE
m o e t m e n er rekening m e e h o u d e n
g e s p o e l d . S o m s is het echter
kan w o r d e n u i t g e v o e r d . Een a n d e r
d a t bij lage t e m p e r a t u u r v e t t e n v a a k
verstandiger o m de omgekeerde
p r o b l e e m dat zich kan v o o r d o e n is
precipiteren. Water oplosbare ana-
m e t h o d e t o e te passen. Een v o o r -
d e h o g e ionsterkte v a n s o m m i g e
l i e t e n ) die m e e s t a l w o r d e n g e ë x t r a -
beeld is d e o p z u i v e r i n g v a n e e n
m o n s t e r s (b.v. urine). Bij gebruik
h e e r d m e t b e h u l p v a n NP-SPE kun-
relatief h y d r o f o o b peptide als cyclo-
v a n RP-SPE zal dit meestal g e e n
n e n ook w o r d e n o p g e z u i v e r d m e t
s p o r i n s Het (plasma) m o n s t e r w o r d t
p r o b l e e m o p l e v e r e n , m a a r bij t o e -
RP-SPE d o o r 5 - 1 0 % v a n e e n anor-
allereerst over e e n C-18 k o l o m m e t j e
passing v a n IP en IE-SPE geeft dit
ganisch zout t o e t e v o e g e n a a n d e
geleid. Z o w e l het cyclosporine als
meestal aanleiding tot bijzonder
waterige matrix. Door hydradatie
een aantal v e r o n t r e i n i g i n g e n w o r d e n
lage recoveries. De extractie v a n
v a n d e i o n e n zal d e h o e v e e l h e i d
nu v a s t g e h o u d e n . In d e v o l g e n d e
w e e f s e l h o m o g e n a t e n m e t een h o o g
w a t e r die v o o r het solubiliseren v a n
stap w o r d e n d e v a s t g e h o u d e n ver-
v e t g e h a l t e brengt w e e r a n d e r e pro-
d e analiet m o l e c u l e n beschikbaar is
bindingen geëlueerd met een m e n g -
b l e m e n m e t zich m e e . O m d a t deze
sterk v e r m i n d e r e n (uitzout effect) en
sel v a n ethylacetaat e n m e t h a n o l en
m o n s t e r s in het a l g e m e e n g o e d in
dit heeft e e n v e r m i n d e r d e oplosbaar-
dit eluens w o r d t o p e e n n i e t - g e m o -
organische o p l o s m i d d e l e n o p l o s s e n ,
heid v a n d e analiet(en) t o t g e v o l g .
dificeerde silica cartridge g e b r a c h t ,
w o r d t nu vaak v o o r adsorptie SPE
w a a r o p alleen d e relatief polaire ver-
(niet g e m o d i f i c e e r d silica) g e k o z e n .
Bij het beschrijven v a n d e m e t h o d e
ontreinigingen w o r d e n vastgehou-
O p deze m a n i e r w o r d e n de
ontwikkeling w o r d e n de hoeveelhe-
d e n en w a a r o p de analiet m o l e c u l e n
analiet(en) v a s t g e h o u d e n , terwijl
d e n die v a n d e v e r s c h i l l e n d e v l o e i -
niet w o r d e n t e g e n g e h o u d e n .
d e vetten in het geheel niet w o r d e n
stoffen w o r d e n g e b r u i k t uitgedrukt
vastgehouden.
in c a r t r i d g e v o l u m i n a . D e vuistregel
is dat het c a r t r i d g e v o l u m e v a n 5 0 -
Een p a r a m e t e r die niet o v e r het
hoofd gezien m a g w o r d e n is d e
De extractie v a n w e i n i g polaire a n a -
100 m g cartridges 1 m l is, d a t v o o r
invloed v a n m a c r o m o l e c u l e n (b.v. ei-
l i e t e n ) in een vaste of halfvaste (b.v.
5 0 0 m g cartridges e e n v o l u m e v a n
w i t t e n , p o l y m e r e n ) o p het extractie-
weefselhomogenaat) matrix kunnen
3 m l w o r d t a a n g e h o u d e n , e n dat het
proces. Vaak w o r d e n sorbentia
w o r d e n uitgevoerd door het m o n s t e r
cartridge v o l u m e v a n d e 1.000 m g
gebruikt m e t e e n p o r i e g r o o t t e v a n
eerst te homogeniseren met methanol,
s y s t e m e n 6 m l is.
6 0 A , veel e i w i t t e n zijn b i j v o o r b e e l d
isopropanol of acetonitril. Dit m e n g -
zo g r o o t dat ze nu d e poriën niet
sel v e r v o l g e n s te v e r d u n n e n m e t
k u n n e n b i n n e n d r i n g e n . Dit betekent
e e n geschikte buffer t o t d a t het per-
dat aan eiwit g e b o n d e n analieten dus
c e n t a g e a a n organische vloeistof
niet vast w o r d e n g e h o u d e n , m a a r
o n g e v e e r 2 5 % is, w a a r n a RP-SPE
De verschillende vormen van SPE
zullen een volgende maal in detail
worden besproken.