Transcript Damya Laoui
FACULTY OF SCIENCE AND BIO-ENGINEERING SCIENCES Laboratory of Cellular and Molecular Immunology, VUB Laboratory of Myeloid Cell Immunology, VIB Regulation of the molecular and functional heterogeneity of tumor-associated macrophages and dendritic cells Damya Laoui Thesis submitted to obtain the degree of Doctor in Bio-Engineering Sciences Promotor: Co-promotor: May 2014 Prof. Dr. Patrick De Baetselier Prof. Dr. Ir Jo A Van Ginderachter Summary Tumors consist not only of neoplastic cells, but should be considered as organ-like structures in which a complex bidirectional interplay exists between transformed cells and the surrounding stroma. Myeloid cells form an important component of the tumor stroma and are characterized by an extreme heterogeneity and plasticity with partially overlapping molecular and functional phenotypes. They are often abundantly present in the tumor microenvironment and are implicated in a wide array of pro-tumoral functions. Hence, this PhD thesis aimed to thoroughly characterize the myeloid cells present in the tumor microenvironment at a molecular and functional level, with a focus on tumor-associated macrophages (TAM) and tumor-associated dendritic cell (TADC) heterogeneity and the role of hypoxia in skewing the TAM phenotype. TAM are exposed to multiple microenvironmental cues in tumors, which collaborate to endow these cells with protumoral activities. Hypoxia, caused by an imbalance in oxygen supply and demand due to a poorly organized vasculature, is often a prominent feature in solid tumors and could thus possibly regulates the TAM phenotype in vivo. In this work, we show that the myeloid infiltrate in mouse lung carcinoma tumors encompasses two morphologically distinct TAM subsets, designated as MHC-IIlo and MHC-IIhi TAM, both of which were derived from tumorinfiltrating Ly6Chi monocytes. MHC-IIlo TAM express higher levels of prototypical M2 markers, such as macrophage mannose receptor (MMR), and reside in more hypoxic regions and contain consequently higher levels for hypoxia-regulated genes than their MHC-IIhi counterparts. When growing better oxygenated tumors in PHD2+/- mice, reduced tumor hypoxia did not alter the relative abundance of TAM subsets nor their M2 marker expression, but lowers hypoxia-sensitive gene expression and angiogenic activity specifically and solely in the hypoxic in MHC-IIlo TAM. Hence, hypoxia is not a major driver of TAM subset differentiation, but rather specifically fine-tunes the phenotype of M2like MHC-IIlo TAM. To visualize and target these hypoxic MMR+ MHC-IIlo TAM, we generated MMRspecific nanobodies (Nb), which are single-domain antigen-binding fragments derived from Camelidae heavy-chain antibodies. Radioactively labeled (99mTc) labeled antiMMR Nb accumulate in intratumoral hypoxic regions and successfully target specifically MMR+ TAM in vivo. Importantly, co-injection of excess unlabeled, bivalent anti-MMR Nb reduce Nb accumulation in extra-tumoral organs to background levels, without compromising tumor uptake. Thus, anti-MMR Nb can be used to selectively target and image hypoxic M2-like TAM in vivo and form a potentially new tool for diagnostic and therapeutic approaches. Besides TAM, tumors contain also TADC, whose phenotype was until now only poorly characterized. Our results denote the co-existence of three ontogenically and functionally discrete TADC subsets in several tumor models of different histological origins, being CD8+-like cDC, CD11b+-like cDC and Mo-DC. In conclusion, this work brings new insights in the biology of macrophages and dendritic cells in cancer, highlighting their molecular and functional heterogeneity and proposing new strategies for future therapeutic interventions. Samenvatting Tumoren dienen beschouwd te worden als orgaanachtige structuren, waarin een complexe bidirectionele interactie bestaat tussen getransformeerde neoplastische cellen en de omgevende tumor stroma. Myeloide cellen maken een belangrijk deel uit van de tumor stroma en zijn gekenmerkt door een extreme heterogeniteit en plasticiteit met gedeeltelijke overlappende moleculaire en functionele fenotypes. Ze zijn vaak aanwezig in grote getallen in de tumor micro-omgeving en zijn betrokken in een brede resem aan protumorale functies. Deze doctoraatsthesis beoogt de grondige karakterisering van myeloide cellen aanwezig in de tumor micro-omgeving op moleculair en functioneel niveau, met specifieke focus op tumor-geassocieerde macrofaag (TAM) en tumor-geassocieerde dendritische cel (TADC) heterogeniteit, en op de rol van hypoxie op de ontwikkeling van het TAM profiel. In de tumor omgeving worden TAM blootgesteld aan veelvuldige omgevingssignalen, die TAM bewapenen met tumorpromoverende functies. Hypoxie is een uitgesproken kenmerk van vaste tumoren, en wordt veroorzaakt door een verstoorde vasculatuur en een onevenwicht in zuurstofbehoefte en –toevoer en zou dus mogelijk het TAM fenotype in vivo kunnen beïnvloeden. In dit werk tonen we aan dat het myeloid tumor infiltraat in muis longcarcinoma’s twee morfologisch verschillende TAM subpopulaties bevat. Beiden zijn afkomstig van tumorinfiltrerende Ly6Chi monocyten, en worden respectievelijk MHC-IIlo en MHC-IIhi TAM genoemd. MHC-IIlaag TAM vertonen een hoge expressie van prototypische M2-geassocieerde merkers, zoals macrofaag mannose receptor (MMR), vertoeven voornamelijk in hypoxische tumorregio’s en drukken bijgevolg hogere niveaus aan hypoxiegereguleerde genen in vergelijking met de MHC-IIhoog TAM. Wanneer men tumoren tot ontwikkeling laat komen in PHD2+/- muizen, een muisgenotype met een betere tumor oxygenatie, bleven de relatieve proporties aan TAM subpopulaties en de expressie van M2 merkers onveranderd, maar was de expressie van hypoxie-gevoelige genen en de angiogene activiteit significant verlaagd uitsluitend in MHC-IIlaag TAM subpopulatie. Hieruit kan besloten worden dat hypoxie niet de drijvende kracht is achter de differentiatie van de Ly6Chi monocyten in MHCIIlaag en MHC-IIhoog TAM, maar eerder betrokken is bij het verfijnen van het fenotype van de M2 MHC-IIlaag TAM. Om deze hypoxische MMR+ MHC-IIlaag TAM te visualiseren en te targeten, werden MMR-specifieke nanobodies (Nb) ontwikkeld. Nb zijn antigen-herkennende enkeldomein antilichaam fragmenten afgeleid van antilichamen van kameelachtigen. Radioactief gelabelde (99mTc) anti-MMR Nb associëren met hypoxische regio’s binnen de tumor mico-omgeving en binden efficiënt en op specifieke wijze de MMR+ TAM in vivo. Bovendien kan een overmaat aan ongelabeld bivalent anti-MMR Nb de Nb accumulatie in extra-tumorale organen reduceren zonder de Nb-binding in de tumor te beïnvloeden. Bijgevolg kunnen anti-MMR Nb gebruikt worden voor de selectieve in vivo beeldvorming en targeting van hypoxische M2 TAM en vormen een potentiele nieuwe tool voor diagnostische en therapeutische doeleinden. Naast TAM omvatten tumoren ook TADC, waarvan het fenotype tot nu toe maar amper is beschreven. Onze resultaten tonen aan dat in verscheidene tumormodellen met uiteenlopende histopathologische oorsprong, drie ontogenetische en functionele verschillende TADC subpopulaties aanwezig zijn, zijnde CD8+-achtige cDC, CD11b+-achtige cDC en Mo-DC. Samengevat brengt dit werk nieuwe inzichten in de biologie van macrofagen en dendritische cellen in kanker, via de identificering en moleculaire en functionele karakterisering van de TAM en TADC heterogeniteit. Verder werd getracht deze bevindingen te vertalen naar een therapeutische en diagnostisch setting, wat potentieel van belang kan zijn voor toekomstige therapeutische strategieën in de strijd tegen kanker.