Transcript Parte III. 6. Enzimas 1. Definición Vmax y Km 2. Modelo del estado estacionario 3. Condiciones óptimas de reacción 4. Curvas temporales 5. La práctica Unidades para reportar en la purificación.

Parte III.
6.
Enzimas
1.
Definición Vmax y Km
2.
Modelo del estado estacionario
3.
Condiciones óptimas de reacción
4.
Curvas temporales
5.
La práctica
Unidades para reportar en la purificación
CINÉTICA
Es el estudio de las velocidades de las
reacciones, aporta las bases para el
entendimiento de cómo ocurre una reacción.
Mecanismo de la reacción

La descripción de una reacción en
términos de las etapas implicadas y la
velocidad de la reacción se denomina
mecanismo de la reacción.
¿Cuántas etapas están implicadas?
¿Cuál es la etapa más lenta y que, por tanto,
limitaría la velocidad de la reacción total?
La primera clave en cuanto al
comportamiento enzimático lo
aportaron:
V. Henri (1903) y posteriormente L. Michaelis
y Maud L. Menten (1913).



Para explicar la relación observada entre la velocidad
inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0)
Michaelis y Menten propusieron que las reacciones
catalizadas enzimáticamente ocurren en dos
etapas:
En la primera etapa se forma el complejo
enzima-sustrato y
En la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar
a la formación del producto, liberando el enzima
libre
Kcat


En este esquema, k1, k2 y k3 son las
constantes cinéticas individuales de
cada proceso y también reciben el
nombre de constantes
microscópicas de velocidad.
Según esto, podemos afirmar que:



v1 = k1 [E] [S]
v2 = k2 [ES]
v3 = k3 [ES]
[ET] = [E] + [ES]

la concentración total de enzima depende de
la cantidad de enzima libre (E) y de la enzima
unida al sustrato (ES).
[ET] es constante a lo largo de la reacción
Como [E] = [ET] - [ES] y sabemos que
v1 = k1 [E] [S]
 resulta que: v1= k1[S]([ET] - [ES])
 entonces
v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

MODELO DEL
“ESTADO ESTACIONARIO”

Por tanto, la velocidad de formación del
complejo enzima-sustrato (v1) es igual a
la de su disociación (v2+ v3)
v1 = v 2 + v 3
k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]
Todo está en términos de [ES]
Despejando [ES], queda que:

siendo

En el estado estacionario, la velocidad
de formación del producto es:

v = v3 = k3 [ES] =

Si K3[ET]= Vmax

Entonces v=Vmax*[s]
Km + [s]
Ec. de Michaelis
Vmax= Velocidad límite que alcanza la enzima
a concentración saturante de sustrato
Definición Km

Es la concentración de sustrato a la cual
se alcanza la mitad de la velocidad
máxima.
En efecto, si KM = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se
reduce a:
v=Vmax*[s]
v = Vmax*[s]
v= [s] * Vmax v=Vmax
Km + [s]
[s]+[s]
2[s]
2

Km y afinidad?

El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato:
A menor Km, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor
Km, menor afinidad.



KM se define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el
complejo ES, mientras que la reacción 1 lo forma.
Así, si KM es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la
tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato),
y si KM es pequeña, el complejo ES es estable, ya que predomina la
tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato).
Qué se necesita para medir la
velocidad de reacción enzimática?


Extracto proteico que muchos casos no
proviene de una purificación exhaustiva
o del aislamiento de la enzima.
La medida se realiza siempre en las
“condiciones óptimas” de pH,
temperatura, presencia de cofactores, etc, y
se utilizan concentraciones saturantes de
sustrato.
Vmax


En condiciones “óptimas” y saturantes
de la enzima, la velocidad de reacción
observada es la velocidad máxima
(Vmax).
La velocidad puede determinarse bien
midiendo la aparición de los productos
o la desaparición de los reactivos.
Condiciones “óptimas de reacción enzimática”
Reacción que cataliza la lactato
deshidrogenasa

La reducción del piruvato para formar lactato es
reversible y dependiente de la presencia de una
coenzima.
Desarrollo experimental




1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0
10 mM Piruvato de sodio
4 mM NADH
Diluciones apropiadas de enzima.
Velocidad de formación de
producto respecto al tiempo
Fase 1, denominada transitoria
Fase 2, de velocidad inicial, la
concentración de producto se
incrementa linealmente conforme
el tiempo transcurre
Fase 3, decremento en la
concentración de sustrato, la
desnaturalización de la enzima
o la inhibición causada por la
alta concentración de producto
de la reacción.
La actividad o velocidad de una enzima se
puede medir como formación de producto o
desparición de sustrato
Piruvato
(mM)
Aquí estamos midiendo la desaparición de sustrato
NADH: Pierde electrones se oxida y
absorbe poco a 340 nm
La actividad de una enzima
tiene unidades de velocidad.
 Abs 
m
 * Vol. ensayo m L * F
 min 
Actividad 
*Vol
1
1
 M cm  * b cm * Vol.enzim a(m L)
fracción
(m L)  m m olmin1
m: es la pendiente de la recta (Abs/t) en unidades de abs / min
: es el coeficiente de extinción molecular para el NADH, 6.22 x 103
M-1 cm-1.
b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm
Volensayo: es el volumen total del ensayo.
F: el factor de dilución
Volenzima: el volumen añadido de enzima a la reacción
Vol fracción: es el volumen obtenido de la fracción purificada
Tabla de purificación de
proteínas
Tabla 3.2. Tabla de purificación de la LDH de músculo esquelético de bovino.
Procedimiento
Homogeneizado
(F1)
Sobrenadante de la
precipitación con
sulfato de amonio
45% (F2)
Precipitado
obtenido de la pp
con sulfato de
amonio 70% (F3)
Primera Fracción
que salió de la
cromatografía*
(FPA)
Segunda Fracción
que salió de la
cromatografía*
(FPB)
Volumen
de la
fracción
(mL)
Proteína
total en la
fracción
(mg)
Actividad
enzimática
(mmol min-1)
Actividad
específica
mmolmin-1mg-1
Veces de
purificación
Rendimiento
1
100
Actividad específica


Las unidades son mmol min-1mg-1
entonces dividir la actividad total dada
en mmol min-1 entre la cantidad de
proteína total de la fracción (mg).
Otras unidades usadas son las unidades
internacionales U que son (µmoles/min)
Grado de pureza también llamado
veces de purificación


El valor se obtiene al dividir la
actividad enzimática específica de
cualquier fracción entre la actividad
específica de la fracción inicial en
este caso la F1.
Se espera que conforme se pierdan
proteínas contaminantes el grado de
pureza se vaya incrementando.
Rendimiento o yield


la actividad total recuperada en la
fracción inicial es el 100%, cuanto es en
cada paso de purificación
Unidades de porcentaje
Actividad total
U= µmol/min
Actividad específica
U/mg