Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)

• Techniek om stoffen bijv. eiwitten in monsters te meten - bijv. insuline in bloed • Berust op binding tussen

antilichaam

(Ab) en

antigeen

(Ag) 96 wells plaat: 8 rijen (A-H) en 12 kolommen (1-12)

Doel van ELISA experiment

Het uitvoeren van een kwantitatieve immunologische bepaling

• Wat heb je hiervoor nodig?

•

Gezuiverd antigeen

. In deze practicumproef is dat

humaan insuline

(Ag) • Een deel wordt gebruikt voor opwekken antilichamen • Een deel (1 mg/ml) wordt gebruikt voor calibratie • Een deel Ag wordt voorzien van biotine groep (AgB)

ELISA procedure

• Competitie tussen biotine gelabeld (AgB) en ongelabeld antigeen (Ag) • Hoeveelheid gebonden AgB wordt bepaald met avidine-gelabeld HRP één putje van een 96-wells plaat

Uitvoering

• Allereerst moet het

percentage werkzame IgG moleculen

worden bepaald. Dit doe je door bij een variabele IgG concentratie (A-H) te bepalen wat de minimale hoeveelheid Ag (1-12) is waarbij alle AgB nog gebonden blijft.

Antilichaam aan putje binden

Bereken de verdunning die je in moet vullen en

noteer

alle informatie!

Percentage werkzame antilichamen

Coat IgG: Voeg 100 µl IgG (Ab) toe aan elk putje Maximale bindingscapaciteit van IgG per putje is 4 µg/ml, dus 100 µl x 4 µg/ml = 400 ng Niet gebonden antilichaam

wegwassen

Alle eiwit bindingsplaatsen bezetten/

blokkeren

Biotine-gelabeld antigeen (AgB) toevoegen

• Per putje 10 µl insuline (AgB), steeds

dezelfde concentratie

• Maximaal 1 ng per putje zodat niet alle antilichamen zijn gebonden

Ongelabeld antigeen (Ag) toevoegen

• in elk putje 100 µl ongelabeld antigeen (Ag) • in elke kolom een andere concentratie (12 kolommen) • begin met overmaat (bijv. 100 ng) en verdun steeds met factor 2 Ongebonden antigeen

wegwassen

Avidine peroxidase toevoegen

• Avidine bindt zeer sterk aan biotine • Peroxidase is een enzym Ongebonden avidine-peroxidase

wegwassen

Substraat voor peroxidase toevoegen

Peroxidase zet substraat om in kleurstof waarvan de

absorptie

gemeten kan worden

Stoppen kleurreactie

Absorptiewaarden voor kleurstof

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H 0,186 0,297 0,655 1,248 1,713 0,037 0,193 0,366 0,645 1,227 0,053 0,123 0,184 0,352 0,590 0,031 0,056 0,118 0,189 0,252 0,000 0,000 0,015 0,046 0,185 0,000 0,000 0,000 0,043 0,103 0,043 0,000 0,000 0,047 0,020 0,000 0,000 0,000 0,012 0,040 1,710 1,649 1,690 1,696 1,683 1,692 1,664 1,668 1,686 1,644 1,668 1,627 1,673 1,665 1,002 1,402 1,652 1,641 1,634 1,666 1,668 0,508 0,799 1,167 1,508 1,713 1,702 1,635 0,222 0,371 0,567 0,763 0,870 0,956 0,981 0,137 0,205 0,341 0,351 0,475 0,476 0,516 0,101 0,081 0,169 0,169 0,182 0,240 0,201 0,023 0,054 0,085 0,063 0,141 0,113 0,102 AgB (ng/well) Ag (ng/well) Ag + AgB (ng/well) 0,83 0,83 0,83 0,83 80,00 40,00 20,00 10,00 80,83 40,83 20,83 10,83 0,83 5,00 5,83 0,83 2,50 3,33 0,83 1,25 2,08 0,83 0,63 1,46 0,83 0,31 1,14 0,83 0,16 0,99 0,83 0,08 0,91 0,83 0,04 0,87 IgG ng/well 250,000 125,000 62,500 31,250 15,625 7,813 3,906 1,953 Daar waar de absorptie afneemt treedt competitie op!

Reken uit hoeveel procent van het antilichaam aan het antigen heeft gebonden: (Ag+AgB)*15/(Ab)*100 %

Voorbeeld van een testcurve

Absorbance against dilution of Ag at one IgG dilution (one row of the Excel sheet)

1,800 1,600 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00

Ag + AgB added per well (ng)

60,00 70,00 80,00 90,00 Neem daarna een nieuwe plaat voor het maken van een optimale calibratiecurve

Test voor een optimale calibratiecurve

A B C D E F G H gem.

1 0,150 0,159 0,203 0,149 0,158 0,234 0,234 0,221 0,189 2 0,234 0,200 0,269 0,252 0,201 0,206 0,223 0,201 3 0,322 0,340 0,309 0,334 0,325 0,340 0,354 0,271 0,223 0,324 4 0,424 0,386 0,369 0,383 0,401 0,377 0,423 0,398 5 0,564 0,515 0,536 0,541 0,484 0,560 0,494 0,527 0,395 0,528 6 0,635 0,654 0,619 0,706 0,702 0,680 0,627 0,628 7 0,860 0,894 0,847 0,886 0,901 0,859 0,814 0,832 0,656 0,862 8 1,143 1,077 1,127 1,063 1,142 1,141 1,057 1,126 1,110 1,405 Ag + AgB (ng/well) Ag (ng/well) 80,8 80,00 62,4 61,54 48,2 47,34 37,2 36,41 28,8 28,01 22,4 21,55 17,4 16,57 13,6 12,75 9 1,393 1,359 1,382 1,433 1,386 1,431 1,420 1,439 10,6 9,81 10 1,818 1,777 1,757 1,764 1,772 1,791 1,801 1,774 1,782 1,797 11 1,771 1,771 1,837 1,772 1,781 1,826 1,789 1,825 12 1,764 1,776 1,817 1,821 1,772 1,774 1,768 1,799 1,786 8,4 7,54 6,6 5,80 5,3 4,46 IgG AgB Ag ng/well dilution 250,0 1,0 ng/well 0,83 ng/well 80,0 1,0 1,3

Test voor de calibratiecurve

test for a calibration curve of 6 points

2,000 1,800 1,600 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0

Ag + AgB added per well (ng)

60,0 70,0 80,0 90,0

Ag concentratie in monster bepalen

Concentratie Ab

constant

houden Kolom 1-6: calibratie Kolom 7-12: monster

Ag concentratie in monster bepalen

Kolom 1-6: calibratiecurve Kolom 7-12: monster Ab concentratie constant

A B C D E F G H

Ag concentratie in monster bepalen

1 0,293 0,313 0,319 0,358 0,331 0,285 0,346 0,325 2 0,371 0,374 0,410 0,430 0,457 0,450 0,457 0,444 3 0,517 0,560 0,561 0,587 0,565 0,561 0,531 0,559 4 0,650 0,674 0,742 0,732 0,676 0,704 0,723 0,677 5 0,925 0,879 0,872 0,873 0,857 0,934 0,877 0,942 6 1,192 1,161 1,132 1,118 1,211 1,197 1,193 1,174 7 0,366 0,301 0,368 0,355 0,363 0,287 0,274 0,370 8 0,428 0,391 0,382 0,386 0,380 0,376 0,440 0,415 9 0,590 0,589 0,571 0,572 0,537 0,515 0,558 0,495 10 0,695 0,729 0,698 0,690 0,723 0,728 0,700 0,680 11 0,904 0,923 0,886 0,867 0,857 0,947 0,868 0,879 12 1,189 1,205 1,180 1,170 1,197 1,116 1,176 1,140 gem.

0,321 0,424 0,555 0,697 0,895 1,172 0,336 0,400 0,553 0,705 0,891 1,172 Ag + AgB (ng/well) Ag (ng/well) Sample (ng/well) 80,8 80,00 62,4 61,54 48,2 47,34 37,2 36,41 28,8 28,01 22,4 21,55 800,00 615,38 473,37 364,13 280,10 215,46 IgG AgB Ag Sample ng/well dilution 250,0 1,0 ng/well 0,83 ng/well 80,0 ng/well 800,0 1,3 1,3

Optimale calibratiecurve

calibration

1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0,0 y = 25.626

x

-0.9942

10,0 20,0 30,0 40,0 50,0

Ag + AgB added per well (ng)

60,0 70,0 80,0 90,0

Monster curve

Sample

1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00

ng (sample)+ngAgB

600,00 700,00 800,00 900,00

Berekening hoeveelheid insuline in monster

Sample Y-value (absorban ce) Sample X-value (ng sample + 0.83 ng AgB) X-value calibration curve Getallen trendlijn a 25,626 b -0,994 0,891 280,1 29,3 0,035 -3,359 3,379 Ag in sample (ng) 28,5 mg Ag / mL sample 1,017E-01

y = 25,626x -0,994 Y/a ln (Y/a) ln (Y/a)/b e ^ (ln (Y/a) / b)

Opdrachten en verslag

Opdrachten

- Het bepalen van het percentage werkzame IgG moleculen in het gezuiverde IgG preparaat

Vuistregels:

zie kader blz. 15 - Testcurve en kwantitative analyse van het insuline monster

Verslag

- progress report!

- het preparaat dat getest is - het percentage werkzame antilichamen - de testcurves en de curves van ijklijn en monsterverdunningen - de berekening van de concentratie insuline in het monster