Transcript Emissão de luz •Luminescência •Fluorescência •Fosforescência •Quimioluminescência •Bioluminescência Luminescência é o termo que se usa quando a energia da excitação provém da absorção de fótons.

Emissão de luz
•Luminescência
•Fluorescência
•Fosforescência
•Quimioluminescência
•Bioluminescência
Luminescência é o termo que se usa quando a
energia da excitação provém da absorção de
fótons. Inclui a Fluorescência e a
Fosforescência.
Quimiluminescência é um termo geral para
produção de luz quando a energia de
excitação é proveniente de uma reação
química.
Bioluminescência é a denominação de um
fenômeno de quimiluminescência onde a
reação química é realizada em um organismo,
como o vaga-lume por exemplo.
Quimioluminescência
A fluorescência é uma forma de fotoluminescência em
que a emissão de luz desaparece tão logo cessa a
absorção da radiação excitadora. (O tempo de vida de
uma fluorescência é da ordem de 10-8 s).
Fosforescência é semelhante a fluorescência sendo
que o produto excitado é mais estável, de forma a
demorar mais tempo (de um microsegundo até
minutos) até que a energia seja liberada totalmente.
Esse fenômeno está relacionado com o fato dos
interruptores de tomada em sua casa brilharem no
escuro. Em seu polímero, são colocados pigmentos de
fósforo, um elemento que possui propriedades
fosforescentes. Não é por nada que o nome "fósforo",
elemento químico de número atômico 15, vem do
grego, phosphoros, que significa "aquele que brilha", ou
"o que conduz, traz a luz".
Absorção de um fóton e excitação de um elétron .
Inicialmente, os
elétrons em átomos ou
moléculas estão
energeticamente em
um nível “normal” de
energia denominado de
estado básico ou estado
fundamental (“ground
state”). A absorção de
um fóton por uma
molécula de clorofila
excita um elétron,
levando ele de um
estado de baixa energia
(não excitado) para um
estado excitado.
Fluorescência - bases
Moléculas Fluorescentes
Fura-2
Indicador de Ca2+
Iodeto de Propídio
Marcador de DNA
Fluorescência - espectros
Mecanismo
• 1o passo : Absorção (ou excitação)
• 2o passo: Dissipação (VR, ISC, CI, NRET,
Complexação)
• 3o passo: Emissão
– Fluor ou Fosforescência
• Estacionária
• Resolvida no tempo
– Polarizada ou não
 Luminescência
h
h
h
h
h
Molécula no
estado
fundamental
Molécula no
estado
Excitação
excitado
10-15 s
10-12 a 102 s
VR, ISC, CI, CE,
NRET, complexação
h
h
h
h
Emissão
Características Instrumentais
Mecanismo
• O elétron excitado primeiramente relaxa ao
menor nível do estado excitado, emitindo
radiação infravermelha, isto é calor. Após ele
retorna ao estado fundamental, podendo neste
retorno acontecer três processos: a) perda de
calor; B) emissão de um fóton (fluorescência)
ou c) transferência de energia a uma molécula
adjacente, onde outro elétron é excitado. Este
processo é conhecido como transferência por
ressonância, conforme. Esse é o mecanismo
pelo qual a energia coletada por dezenas ou
centenas de moléculas de pigmento podem ser
canalizadas a um centro de reação.
Absorção de um fóton e excitação de um
elétron, com liberação de calor
Retorno do elétron excitado ao estado
fundamental e os três processos que
podem ocorrer neste retorno.
A transferência por ressonância pode ser
demostrada através de um pêndulo.
Sobreposição
de absorção e emissão antraceno
In te n s id a d e (u .a .)
1 ,0
e m is s ã o
e x c ita ç ã o
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0 ,0
250
300
350
400
450
Antrac eno em Tol ueno - Em i s s ão e Ex c i taç ão
C o m p rim e n to d e O n d a (n m )
500
Auto-absorção – antraceno
Intensidade (u.a.)
1 ,0
0 ,8
10
-5
m o l.L
-1
10
-4
m o l.L
-1
10
-3
m o l.L
-1
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0 ,0
340
-3
-4
Ant raceno em Tolueno a 2 x 10 , 10
360
380
400
420
440
460
-5
e 10 M (ANTOLn)
C o m p rim e nto d e O nd a (nm )
480
500
520
Moléculas Fluorescentes
• Geralmente aromáticas polianelares
(rígidas)
• Não possuem grupos muito móveis
(dispersam energia)
• Vários rendimentos quânticos
(eficiência na produção de luz)
Rendimento Quântico
• Ф=
no de fótons emitidos
no de fótons absorvidos
• Aumenta com o número de anéis (<rotação)
• Diminui com o aumento da T e com a
diminuição da viscosidade (>no colisões)
 Picos do pireno
PVAc
5000
PEAD
Temperaturas
020 K
120 K
220 K
280 K
300 K
320 K
410 K
4000
Intensidade (u.a.)
PA66
3000
2000
1000
0
360
370
380
390 360
370
380
390 360
Comprimento de Onda (nm)
370
380
390
Microscópio de Fluorescência
Filtro de emissão
HO
O
O
F
F
OH
Molécula fluorescente
O
Anti-Rabbit IgG
Anti-a-tubulina (Rabbit)
Tecido fixado
Filtro de excitação
Luz branca
Método de “Polarização”
• Lentes de um par de óculos polarizadores dão efeitos
fantásticos a um microscópio básico
• Ex: Cristal entre o polarizador e o analisador. Gama de
cores gravada rodando o polarizador.Técnica usada nas
pesquisas mais caras
Outros métodos de melhoramento óptico
• Contraste diferencial
Organelos em 3D
Maior realidade
• Fluorescência (marcação de estruturas celulares e
identificação de estruturas vivas)
Células endoteliais de artéria
AC: anti-a-tubulina
Agente Fluorescente: Alexa
Fluor 568
lexc: 500 - 600
lem: 580-660
Cromossomo humano em
metáfase
Iodeto de Propídio
(complexado com o DNA)
lexc: 480 - 560
lem: 600-700
Quando o IP se interacala entre as bases
do DNA a fluorescência aumente de 20
a 30 vezes e o pico de emissão é
deslocado 40nm para o vermelho.
F-actina
lem: 520
Mitocôndria
Núcleo
lem: 599
lem: 461
F-actina lem: 520
Mitocôndria lem: 599
Núcleo lem: 461
Sobreposição micrótúbulos e mitocôndrias!
Vermelho: Microtúbulos
Verde: Fibras de actina
Mitochondrion-selective MitoTracker
Red CMXRos
Microtubules were labeled with
mouse monoclonal anti–-tubulin
antibody, biotin-XX goat anti–mouse
IgG (H+L) antibody and Cascade
Blue NeutrAvidin.
Filamentous actin (F-actin)
magenta.
Lipophilic regions of the
cell, including intracellular
membranes, were stained
with green-fluorescent
DiOC6(3).
Nuclei DAPI bluefluorescent
Bovine pulmonary arterial endothelial cells
Degradação foto-induzida
(“Photobleaching”)
Alexa Fluor
Fluorescein
0
30
90
210 s
Marcadores Funcionais - pH
O
O
O
O
O
H
O
O
OH
O
H
Incolor (pH<8,5)
H
Violeta (pH>8,5)
Fenolftaleína
BCECF
Marcadores Funcionais -
2+
Ca
Fura-2
GFP - Proteína Fluorescente Verde
Viva as águas vivas!