МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова Химический факультет Кафедра аналитической химии И. Д. Каргин Определение антибиотиков тетрациклинового ряда в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с послеколоночной реакцией и флуоресцентным детектированием Москва, 2014

Научный руководитель:

д.х.н., проф. А.В. Пирогов

Тетрациклины

Тетрациклин (TC) (444.43 г/моль) Окситетрациклин (OTC) (460.43 г/моль) Доксициклин (DC) (444.43

г/моль)

ПДК = 10 нг / г

2

Применение тетрациклина

• Фармaкологические препараты • Ветеринария • Животноводство ПДК = 10 нг / г

3

Цели работы

• Создание способа чувствительного определения антибиотиков тетрациклинового с флуоресцентным детектированием ряда с использованием микроэмульсий методом ВЭЖХ • Изучение влияния состава микроэмульсий на флуориметрические свойства исследуемых соединений 4

Вода

Структура микроэмульсии

Вода н-октан Типы микроэмульсий: А – «масло в воде» В – «вода в масле» С – биконтинуальная микроэмульсия 5

Свойства микроэмульсий

Макроэмульсии

Расслаиваются с течением времени

Микроэмульсии

Термодинамически стабильные системы Капли относительно большие (1-20 мкм) Небольшие агрегаты (10-200 нм) Внутренняя (15 м 2 /г) поверхность небольшая Внутренняя поверхность очень большая (200 м 2 /г) Высокое (1-10 мН/м) поверхностное натяжение Очень низкое поверхностное натяжение (~10 -3 мН/м) Относительно статические системы Высокодинамичные системы 6

mAU

25 20 15 10 5 0

УФ-детектирование

OTC TC DC 2 4 6 8 10

t R

, мин Zorbax Eclipse XDB-C18 150 × 4.6 мм (5 мкм). Градиентный режим, элюент – (А) 0.01 M р-р щавелевой кислоты, pH 3; (В) MeCN. Градиент: (0-4 мин) 20% (В), (4-10 мин) линейное увеличение до 40% (В). F = 1 мл/мин, Т = 30°C. Спектрофотометрическое детектирование при λ = 359 нм.

Соединение OTC TC DC t R , мин 2.98

3.92

8.98

Ширина пика, мин 0.17

0.21

0.19

R s – 4.9

25.3

A s 0.705

0.785

0.715

c min , нг/мл 110 100 130 7

Режим МЭЖХ

(Б)

mAU

7 5 3 1 -1 (А) OTC + TC DC 3 6 9

t R

, мин Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов (с = 1 мкг/мл каждого). Элюент – (А) - МЭ (3.3% ДДСН, 0.8% н-гептана, 8% н-бутанола), (Б) - МЭ (2% ДДСН, 0.6% н-гептана, 6% н-бутанола).

pH 3, F = 1 мл/мин, Т = 30°C. Спектрофотометрическое детектирование при λ = 359 нм.

Подвижная фаза МЭ 2% ДДСН, 0.6% гептана, 6% н-бутанола MeCN/0.01М р-р щавелевой к-ты Соединен ие

OTC TC DC OTC TC DC

t R , мин

5.95

6.34

15.31

2.92

3.98

8.98

Ширина пика, мин

0.36

0.54

0.78

0.17

0.21

0.19

Rs

– 0.84

13.5

– 4.9

25.3

c min , нг/мл 180 150 220 110 100 130 8

Комплексообразование с катионами металлов

Предполагаемые структуры комплексов тетрациклина с катионами магния и кальция g g 2 1 У комплекса тетрациклина с катионом магния наблюдается сильное увеличение интенсивности флуоресценции ( ̴ 20 раз) Спектры флуоресценции (λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм): 1 – 10 мкг/г ТС в МЭ 2 – 10 мкг/г ТС в МЭ + Mg 2+ (избыток) 9

Выбор pH и концентрации ионов Mg

2+

I

fl , у.е.

120 100 80 60 40 20 0 3 5 6 7 7.5

8 9 20% MeCN, 80% 0.01M р-ра щавелевой к-ты МЭ (2/0.6/6) pH

I

fl, у.е.

140 120 100 80 60 40 20 0 1/1 1/2 1/10 1/20 1/50

Соотношение концентраций TC/Mg 2+

1/100 20% MeCN, 80% 0.01M р-ра щавелевой к-ты МЭ (2/0.6/6)

с(ТС) = 10 мкг/мл, λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм

10

Изучение влияния природы ПАВ на флуоресценцию комплексов ТС с Mg

2+

ДДСН ДКЗ

с(ТС) = 10 мкг/мл, λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм

ЦТАХ

Название ПАВ

Додецилсульфат натрия (ДДСН) Докузат натрия (ДЗН) Цетилтриметиламмония хлорид (ЦТАХ)

Структурная формула

I

fl , у.е.

45 41 37 11

Схема проведения послеколоночной реакции

Насос 1 20% MeCN 80% 0.01 M р-ра щавелевой к-ты рН 3 Ввод пробы ТС Т = 50°С Колонка Элюат Насос 2 0.06 М р-р MgCl 2 МЭ состава: в 4% ДДСН 1.2% н-гептана 12% н-бутанола рН 9 Металлический капилляр L = 2 м D = 0,25 мм V = 980 мкл Реакционная петля рН 7.8

ТС-Mg ФЛ детектор 12

Кинетика реакции комплексообразования

• Реакция тетрациклина с ионами магния в среде микроэмульсии Условия : МЭ (2% ДДСН, 0.6% гептана, 6% н-бутанол), содержащая 0.06 М Mg 2+ , pH 9, с(ТС) = 10 мкг/мл Зависимость интенсивности флуоресценции комплекса ТС с Mg 2+ от времени, λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм.

13

Варьирование температуры и скорости подачи элюента

Скорость подачи элюента и микроэмульсии с магнием одинакова С ростом температуры понижается вязкость МЭ 14

ОФ-ВЭЖХ с послеколоночной реакцией

ТС ОТС DС Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов с концентрациями 0.05 мг/мл. Элюент: А – 0.01 M р-р щавелевой кислоты, pH = 3; В – MeCN. Градиентный режим: 0 мин – 20% А, (0 – 9) мин – 35% А, (9 – 14) мин – 35% А, (14 – 18) мин – 20% А. F = 0.4 мл/мин, Т = 50°C. Послеколоночная реакция – 60 мМ раствор MgCl 2 в МЭ (4% ДДСН, 1.2% н-гептана, 12% н-бутанола). F = 0.4 мл/мин, V = 100 мкл, λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм.

Соединение OTC TC DC t R , мин

7.13

8.23

11.79

Ширина пика, мин

0.39

0.30

0.64

R

–

s

3.2

7.6

A s

0.740

0.825

0.530

с

min , нг/мл

8 5 25 15

Пробоподготовка фармацевтических препаратов

Навеска препарата Навеска 0.030 г Экстракция в микроэмульсии на УЗ бане Центрифугирование Разбавление подвижной фазой Объем МЭ – 10 мл Время экстракции – 5 минут Температура – 60 о С 2 минуты, 16 тыс. об./мин Разбавление в 100 раз смесью 80% 0.01 M р-ра щавелевой кислоты 20% MeCN 16

Анализ тетрациклиновой мази

ТС Хроматограмма тетрациклиновой мази 3%.

17

Время экстракции Экстрагент

Степени извлечения тетрациклина из мазей

рН 5 минут 15 минут Степень извлечения, % (n = 3, P = 0.95) Мазь 1% Мазь 3% Мазь 1% Мазь 3% Микроэмульсия MeCN/ Щавелевая кислота (20/80) Микроэмульсия MeCN/ Щавелевая кислота (20/80) 3 3 7 7 99±1 85±1 97±1 83±1 100±1 87±2 98±2 85±2 102±2 101±2 98±1 97±2 100±1 103±2 96±2 97±1 18

Пробоподготовка молока

5 мл молока + 7.5 мл буферного р-ра 0.1 М р-р ЭДТА в буферном растворе МакИлвейна, рН 4 Ультразвуковая обработка Время обработки – 5 минут Центрифугирование 5 минут, 16 тыс. об./мин ТФЭ 3 мл MeCN, 3 мл H 2 O, 3 мл буф. р-ра 12 мл надосадочной жидкости 3 мл H 2 O, 3 мл буф. р-ра 1 мл MeCN Центрифугирование Разбавление подвижной фазой 2 минут, 16 тыс. об./мин Разбавление 0,01 M р-ром щавелевой кислоты 19

I

, у.е.

0,29 0,27 0,25 0,23 0,21 0,19 0,17 5

Хроматограмма реального объекта (молоко)

ОТС 6 7 8 ТС 9 10 DС 11 12

t R

, мин 20

Хроматограмма реального объекта (молоко)

I,

у.е.

1,4 1,2 ТС 1 ОТС DС 0,8 (Б) 0,6 (А) 0,4 0 2 4 6 8 10 12 14

t R

, мин Хроматограммы холостого образца молока (A) и молока с добавкой тетрациклинов (Б). Концентрации добавок составляли 20, 20 и 40 мкг/л для OTC, TC и DC соответственно.

21

Выводы

1.

Впервые показано, что интенсивность флуоресценции комплексов тетрациклинов с ионами Mg 2+ в микроэмульсионной среде в 1.8 раза выше по сравнению с водно органической средой.

2.

Изучено влияние природы ПАВ в составе микроэмульсии на интенсивность флуоресценции комплексов тетрациклинов. Показано, что максимальная интенсивность флуоресценции наблюдается в МЭ на основе анионного ПАВ — ДДСН.

3.

Впервые предложена схема проведения комплексообразования тетрациклинов с ионами Mg 2+ послеколоночной в среде микроэмульсий.

реакции 4.

Выбраны условия чувствительного и селективного хроматографического определения тетрациклинов в виде комплексов с флуоресцентным детектированием Пределы обнаружения составили 5, 8 и 25 нг/мл для TC, OTC и DC соответственно.

в фармацевтических препаратах (мази и таблетки) и пищевых объектах (молоко).

5.

Выбраны условия извлечения тетрациклинов из молока, степени извлечения составили 87, 82 и 68% для TC, OTC и DC соответственно. Также в ходе дополнительной очистки образцов с помощью ТФЭ картриджа Strata XDB-L достигнута степень концентрирования тетрациклинов, равная 2.5.

6.

В работе показана перспективность использования МЭ для количественного извлечения тетрациклина из лекарственных форм на основе мазей. Степени извлечения составили 99-100%. Время пробоподготовки занимает 15 минут.

22

Спасибо за внимание!

23