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Protocole BlueFISH (référence catalogue BG4142-2)
Caractéristiques des sondes BlueFISH
Les sondes BlueFISH sont fournies dans un tube de 1,5 ml.
L’étiquette mentionne la référence catalogue, la référence du clone (RP), la bande cytogénétique du clone, la
couleur du marquage fluorescent, la date de production et le numéro de lot.
Conditionnement
Sonde : 5 μl par tube (5 tests)
La sonde est fournie concentrée dans le tampon d’hybridation (formamide, 15% sulphate de dextran, SSC, ADN cot-1).
La sonde ADN est directement marquée : 2 fluorochromes proposés : VERT ou ORANGE.
Table des filtres recommandés : voir page 2.
Avertissements et précautions
1. Pour utilisation en recherche uniquement. Pour usage professionnel uniquement.
2. Porter des gants lors de la manipulation des sondes ADN et du contre-colorant DAPI.
3. La sonde contient de la formamide qui est un tératogène. Ne pas respirer les vapeurs. Ne pas mettre en
contact avec la peau. Porter des gants, une blouse de laboratoire et manipuler sous une hotte. Après élimination,
rincer abondamment avec de l’eau.
4. Le DAPI est un carcinogène potentiel. Manipuler avec précaution. Porter des gants et une blouse de
laboratoire.
Après élimination, rincer abondamment avec de l’eau.
5. Toutes matières dangereuses doivent être éliminées selon les réglementations en vigueur dans votre institution
pour l’élimination des déchets dangereux.
Conservation et manipulation
Les sondes sont livrées à température ambiante et doivent être conservées à l’abri de la lumière.
Dés réception, les sondes doivent être conservées à +4°C si utilisation dans le mois suivant leur
production (date indiquée sur le tube). Sinon, les sondes doivent être conservées à -20°C au maximum 6
mois suivant la date de production (date indiquée sur le tube).
Equipement nécessaire non fourni
a) Plaque chauffante avec bloc et contrôle de la température jusqu’à 80°C : Plaque chauffante digitale Stuart
(Référence SD160EUR) ou Hyperchrome d’Euroclone (Référence EHP500AS) – disponibles chez Amplitech.
b) Micropipettes 1μl - 200μl
c) Bain Marie avec contrôle de la température à 72°C
d) Tubes à microcentrifugation (0,5 ml)
e) Microscope à fluorescence (Voir la section Microscope et filtres)
f) Jarres en plastique ou en verre
g) Forceps
h) Huile à immersion pour microscope à fluorescence
i) Centrifugeuse de paillasse
Autres réactifs non fournis
a) Tampon d’hybridation pour la dilution des BlueFISH (solution d’hybridation B de Cytocell – Réf. HB1000L)
b) DAPI (Cytocell - Réf. DES1000L)
c) Rubber cement
Préparation des échantillons
Les sondes BlueFISH peuvent être utilisées sur métaphases ou noyaux interphasiques de chromosomes
humains préparés selon le protocole en vigueur dans le laboratoire.
Protocole FISH de co-dénaturation
Préparation de la lame échantillon
1. Déposer l’échantillon cellulaire sur une lame propre.
2. Plonger la lame dans du 2 x SSC, pH 7.0 pendant 2 minutes.
3. Déshydrater dans une série de bains éthanol (70%, 85% et 100%), 2 minutes dans chaque bain.
Préparation de la sonde BlueFISH
4. Retirer la sonde du congélateur à -20°C et la laisser préchauffer à température ambiante.
5. Bien homogénéiser la sonde en pipetant plusieurs fois.
AmpliTech SARL - 8, Avenue de Flandres Dunkerque – Compiègne France
Tél: 33 (3) 44 23 19 21 Fax: 33 (3) 44 86 55 58 [email protected] www.amplitech.net
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6. Prélever 1 μl de sonde et diluer dans 12 μl de tampon d’hybridation :
Formamide désionisée (40% conc. final), 15% dextran sulfate, 2xSSC pH7.0, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,1% (v/v)
Tween 20) ou Solution d’hybridation B de Cytocell.
NOTE : dans le cas de sondes contenant des régions hautement répétitives (sondes proches des télomères),
pouvant entrainer des cross-hybridations, l’ajout d’1 μl d’ADN Cot-1 (1 μg) peut aider à réduire le bruit de fond.
7. Déposer 12 μl sur la lame échantillon, et couvrir avec une lamelle en verre 22 x 22 mm.
Sceller avec du rubber cément et laisser sécher.
Dénaturation
8. Placer la lame sur une plaque chauffante à 75°C (+/- 1ºC) et dénaturer pendant 5 minutes ou placer sur un
système multi lames programmable (type Hyperchrome).
Hybridation
9. Incuber la lame pendant 16h à 37°C (+/- 1ºC) à l’abri de la lumière dans une chambre humide : chambre
d’hybridation Cytocell (Réf. PCN004) ou dans un système d’hybridation programmable (type Hyperchrome).
Lavages post-hybridation
10. Retirer la lamelle et éliminer toutes traces de rubber cément
11. Laver la lame dans du tampon 0,4 x SSC (pH 7.0) à 72°C (+/- 1ºC) pendant 2 minutes.
12. Egoutter la lame et laver dans du tampon 2 x SSC, 0,05% Tween-20 (pH 7.0) à température ambiante
pendant 30 secondes.
13. Egoutter et bien sécher la lame sur du papier type Whatman avant de déposer 10 μl de DAPI antifading.
Eviter la formation de bulles qui pourraient gêner la visualisation.
14. Couvrir avec une lamelle 22x22 mm et sceller. Laisser la coloration se développer dans l’obscurité pendant
10 minutes.
15. Visualiser avec un microscope à fluorescence.
Détection
Consulter la table des fluorochromes et longueurs d’ondes ci-dessous pour une visualisation optimale des sondes
BlueFISH
FLUOPHORE
Alexa Fluor 488
Spectrum Green
Cy3
Spectrum Orange
COULEUR
VERT
VERT
ORANGE
ORANGE
Ex max (nm)
490
497
550
559
Em max (nm)
529
524
570
588
Stabilité des lames
Les lames FISH sont analysables pendant un mois si elles sont conservées à l’obscurité et à -20°C dans une
boite à l’abri de l‘humidité.
Recommandations
L’utilisation d’un thermomètre calibré est fortement recommandée pour mesurer les températures des solutions,
bains-marie et incubateurs. Ces températures sont essentielles pour une efficacité optimale du produit.
Les concentrations des lavages (stringence), pH et température sont importants. Une faible stringence peut
résulter en une liaison non-spécifique de la sonde et une trop forte stringence peut résulter en une perte de
signal.
NOTE IMPORTANTE
Dans un nombre restreint de cas, les clones situés sur des régions homologues du génome peuvent présenter
une hybridation croisée mineure ou majeure à prendre en compte lors de la sélection du clone. Les hybridations
croisées éventuelles déjà observées par les utilisateurs sont répertoriées par Bluegnome Illumina et
communiquées par AmpliTech lors de la commande. Sous réserve d’accord avec Bluegnome Illumina, un
remplacement pourra être envisagé dans les cas suivants uniquement : - absence totale de signal d’hybridation, hybridation sur une bande cytogénétique autre que celle attendue, - hybridations croisées à plus de 2 endroits
distincts et non encore répertoriées par Bluegnome Illumina (voir dernière table Excel des clones, colonne
commentaires clients), - signal d’hybridation croisée beaucoup plus intense que le signal spécifique.
Attention, aucun remplacement possible pour les sondes périmées (>6 mois à partir de la date de
production inscrite sur le tube).
POUR TOUTE DEMANDE DE REMPLACEMENT : fournir une image FISH (sonde contrôle incluse)
Support Client :
Veuillez contacter AmpliTech, Département Ventes/Marketing pour plus d’informations.
Version 12 REV – JUIN2014
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