Transcript CP - La Fed

TD Noyau, Chromatine,
Chromosome, Caryotype
(S. Delbecq)
N. Boulle
Année 2014-2015
NOYAU
Caractéristique des cellules eucaryotes +++
- Limité par l’enveloppe nucléaire (2 membranes: interne et externe)
- Contient presque la totalité de l’information génétique (le génome nucléaire)
L’ enveloppe nucléaire: délimite le noyau
chromatine
Pollard TD, Earnshaw WC, Biologie Cellulaire , Ed Elsevier
Microscopie électronique:
1ères études ∼1950
L’enveloppe nucléaire
Description:
Enveloppe constituée de 2 membranes:
- membrane externe: en continuité avec le RER
- membrane interne
- espace périnucléaire
Enveloppe
nucléaire
L’espace périnucléaire
Membrane
externe
Membrane
interne
Réticulum
Endoplasmique
Lumière du RE
Espace en continuité avec la lumière du RE:
- contenu similaire
- stockage du calcium
Percée par les pores nucléaires
Interface entre le cytosquelette (cytosol) et
le nucléosquelette (nucléoplasme)
Espace
périnucléaire
Pore
nucléaire
ribosome
Lamina
nucléaire
Exercice 1
Transport nucléo-cytoplasmique
Transport nucléo-cytoplasmique:
Via les pores nucléaires
- Pores nucléaires: seule voie de communication entre le noyau et le cytoplasme
- Passage dans les 2 sens; notion de sélectivité
- Passage de
petites molécules, ions
Protéines
Molécules de taille variable!
ARNm, ARNt, ARNr
ribonucléoprotéines, particules ribosomales…
- Protéines constituant le pore nucléaire: les Nucléoporines (Nup)
Nucléoporines (Nup) : ~ 30 connues
~ 450 protéines en tout (par pore)
Les pores nucléaires
16 bras radiaires (2x8)
16 filaments (8 cytosoliques et 8 filaments de cage)
Remarque: Pore nucléaire → Asymétrique, déformable
Structure 3D des pores nucléaires
Microscopie electronique, cryofracture
Fahrenkrog and Aebi; Nat Rev Mol Cell Biol 2003, 4: 757
8 unités répétées
Les pores nucléaires
notion de sélectivité
Les éléments du transport nucléo-cytoplasmique
Transport à travers le pore nucléaire dans les 2 sens
Élément transporté = cargo
- Signaux d’adressage sur la protéine (cargo) à transporter (NLS, NES, NRS)
- Importines, exportines: Récepteurs de transport
-Les Nucléoporines:
Nucléoporines contenant des séquences répétées riches en phénylalanine / gly (30%):
Domaine FG (Ex: motif FXFG)
Séquences de reconnaissance pour les Importines / Exportines
Interviennent dans le transport à travers le pore nucléaire → sélectivité du pore!
-Système Ran GTP / GDP → orientation du transport à travers le pore
Les signaux d’adressage nucléaires
Signaux d’adressage:
se comportent de manière autonome!
-NLS « classique » (Nuclear Localisation Signal), riche en aa basiques (K, R)
-NES (Nuclear Exportation Signal)
-NRS (Nuclear Retention Signal)
Translocation des protéines cargo sous forme repliées (≠
≠ mitochondrie / peroxysome)
Masquage/démasquage des signaux d’adressage par partenaires d’interaction
REM: 40% des protéines nucléaires n’ont pas de NLS classique
Le système Ran→ orientation du transport NC
Ran = GTPase
Hydrolyse
GAP
Ran
Pi
GAP: GTPaseActivating Protéin
Ran
GTP
GDP
GTP
GEF
Echange
GDP
GEF: Guanine –
nucleotide
Exchange Factor
Le système Ran
• Disposition asymétrique des régulateurs GEF et GAP de part et d’autre de la
membrane nucléaire:
GEF
/ GAP
noyau / cytosol
• Existence d’un gradient Ran.GTP / Ran. GDP entre le noyau et le cytoplasme
Ran
GDP
Ran
GDP
Ran
GTP
Cytosol
Ran
GTP
Noyau
Gradient de Ran à travers l’enveloppe nucléaire
Cytosol
GAP
cytosolique
GEF
GEF
Noyau
nucléaire
Figure 1
QCM 1
Excitation - λ
E=hc/λ
Emission - λ
L’importation :
QCM 3
Nucléoporine
QCM 3
Les Nucléoporines avec domaine FG: exemple de Nup 153
Extrémité flexible
Fixe importines /
exportine
Extrémité amino-terminale de la nucléoporine Nup 153
Extrémité C-terminale de la nucléoporine Nup 153 contenant le domaine FG
Fahrenkrog and Aebi (october 2003) 4: 757
Exercice 1
Figures 2A et 2B
Méthodologies:
production de protéines «recombinantes »
Cellule eucaryote
ADN
Bactérie
Protéine rec.
Protéine
rec.
purifiée
Lysat
Western
blot
IP…
Méthodologies: Interactions Antigène-Anticorps
- TAG
protéine
TAG
Anticorps
anti-TAG
TAG = FLAG,
Histidine6, GST…
- Western-blot
Anticorps dirigé contre la
protéine d’intérêt
Lysat
(protéines)
Lysat
+
Gel
d’électrophorèse
- Immuno-précipitation
(protéines)
Billes de
résine
Méthodologies: Interactions protéine-protéine
- « Pull –down » → Protéines purifiées ou domaines protéiques
- Immuno-précipitation → Protéines produites dans la cellule
Figure 2A
purifiée
Cellules
HEK293
Figure 2A
Bactérie
Importine α
FLAG
FLAG
CP
Histidine6 (His)
Anti-Histag
CP
His
Importine α
FLAG
FLAG
Billes de
résine
lysat
Cellules
HEK293
Figure 2A
CP
Importine α
(1 ou 2 ou 3 ou 4)
FLAG
Billes de
résine
FLAG
Westernblot anti
FLAG
lysat
Imp α
?
Imp α
CP
Pull down
FLAG-impα
α + CP
Billes de
résine
Western blot anti-Histag /
Western-blot anti FLAG
QCM 4
Figure 2A
FLAG
impα4
CP
His
Billes de
résine
QCM 4
Le recyclage des importines :
RanGAP
RanGTP
RanGDP
exportine
Hydrolyse du GTP
→ libération de imp. α
exportine
Imp. α
Imp. α
cytosol
nucléoplasme
RanGTP
! Imp. α a un signal NES
exportine
Imp. α
≠ export direct de l’importine β – Ran GTP
sans exportine
Figure 2B
Figure 2B
Cellules HEK293= co-expression
Billes de
résine
GFP
Importine α4
CP
FLAG
lysat
Westernblot anti
FLAG
(WB antiGFP)
IgG
contrôle
Billes de
résine
Immunoprécipitation
Anticorps
anti-FLAG
Billes de
résine
Western blot anti GFP
IP
Figure 2B - Piste 4
GFP
Importine α4
Anticorps
anti-FLAG
CP
FLAG
lysat
Billes de
résine
Anticorps
anti-FLAG
Billes de
résine
Importine α4
FLAG
FLAG
Importine α4
FLAG
Billes de
résine Western blot anti GFP
QCM 5
Figure 2B
AntiGFP
AntiGFP
Importine α4
FLAG
Billes de
résine
Figures 3A – 3B
CP-GFP
QCM 6
L’exportation :
RanGAP
RanGTP
exportine
RanGDP
exportine
NES
NES
cytosol
nucléoplasme
RanGTP
RanGTP
exportine
exportine
NES
NES
Leptomycine
exportine
CRM1
(LMB)
Figures 3C
Pull-down
Piste 2
Figure 3C
GST
Billes de
résine
Piste 3
Piste 4
Billes de
résine
Billes de
résine
GST
GST
CRM1
CRM1
(exportine)
(exportine)
(146 kDa)
+
CP
GST
(26 kDa)
Histidine6
Pull-down
?
CP
Piste 1
Histidine6
Western blot anti His
Western blot anti GST
QCM 7
Figures 3C
Pull-down
Billes de
résine
GST
CRM1
CRM1
(exportine)
(exportine)
CP
Histidine6
NES
CP
Conclusion
NH2
NLS
COOH
NES
CP (30 kDa)
(protéine de capside du virus Chikungunya)
CP
CP
Impβ
β
exportine
Impα
α4
RanGTP
cytosol
CP
CP
RanGTP
exportine
Impβ
β
RanGTP
Impα
α4
nucléoplasme
Exportine
(CRM1)
Impα 4
QCM 7
Chromosomes - Caryotype
Obtention d’un caryotype
Culture cellulaire: cellules somatiques
Division cellulaire
Synchronisation / blocage
lymphocytes,
cellules foetales (amniocentèse, biopsies trophoblaste)
(Cellules tumorales)
Accumulation de cellules
Colchicine
Prométaphase ou métaphase
Solution hypotonique
Dispersion chromosomique
Fixation, coloration
QCM 7
Obtention d’un caryotype
Structure d’un chromosome métaphasique
Répétition 5’ TTAGGG 3’
sur 5-10 kpb
Se raccourcit à chaque division
Classement des
chromosomes ?
- Taille
- Position du
centromère
Ic= p/(p+q)
- Bandes (G, R…)
Observation après coloration
Classement en 7 groupes (A à G)
Obtention d’un caryotype
Caryotypes:
Classement d’après la longueur et l’index centromérique :
7 groupes de A–>G
métacentriques
A
B
C
submétacentriques
13
14
acrocentriques
F
15
D
E
21
acrocentriques
22
G
C
G
Coloration des chromosomes au Giemsa
Nombre de bandes variable selon le degré de condensation de la chromatine
- Bandes G: sombres, digestion enzymatique ménagée + Giemsa
- Bandes R: sombres, digestion thermique ménagée + Giemsa
• Bandes:
→ Caractéristiques d’une paire chromosomique
→ Reproductible d’une mitose à l’autre
→ Caractéristique d’une espèce donnée
• Métaphase: 200 – 500 bandes
• Caryotype standard = 400-550 bandes (résolution 5-10 Mpb)
FISH: Hybridation In Situ Fluorescente
Hybridation moléculaire (sondes ADN/ARN)
Les différents types de sonde
+
Ne nécessite pas de cellules
en division (noyaux en
métaphase ou interphase)
Bonne résolution
Outil de recherche
Etude ciblée (sonde spécifique)
Cytogénétique moléculaire:
FISH: Fluorescent in situ hybridization:
Les anomalies chromosomiques
- Constitutionnelle (l'ensemble de l'individu porte la même anomalie) ou acquise
- Équilibrée (il n'y a ni perte ni gain de matériel génétique) ou déséquilibrée
- Homogène (toutes les cellules ) ou en mosaïque (certaines cellules)
• Anomalies du degré de ploïdie
Ex: 69, XXX
• Anomalies de nombre : 2n +/- 1,2,3
Exemple: 47, XY, +21
Exercice 2
Exercice 2
der(11)t(1; 11)(q41; p15.5)
Figure 1 :
Caryotype classique (bandes G) de la mère (A) et du patient (B)
QCM 8
Régions NOR
NOR = - Coloration spéciale (nitrate d’argent)
- Constrictions secondaires au niveau des chromosomes acrocentriques
- Centre fibrillaire des nucléoles
QCM 8
N = 5 chromosomes acrocentriques x 2
= 10 régions NOR
Réparties sur plusieurs nucléoles
Constrictions
secondaires
Région NOR
Possibilité de
translocations
robertsoniennes:
fusion centrique des
chromosomes
acrocentriques
QCM 8
Régions NOR - Le nucléole
Organisation des gènes en tandem
(environ 20 copies)
NOR
(organisateur
nucléolaire)
ADNr
ADNr
ADNr
ADNr
ARN Polymérase I
ARNr 45S
+ protéines = Grande particule RNP
Clivage / maturation de l’ARN
(Polymérase III)
Cf cours sur la
transcription (UE1)
Petite sous-unité
ribosomale (40S)
Grande sous-unité
ribosomale (60S)
QCM 8
En Microscopie électronique (MET)
- Centre fibrillaire (1 ou pls) Localisation des NOR
- Composant fibrillaire dense (grande particule RNP)
- Région périphérique granulaire (pré-ribosomes)
Exercice 2
Figure 2
Hybridation Génomique Comparative
CGH : Comparative Genomic Hybridization
Préparation de l’ADN
Hybridation sur support contenant
les sondes (« puce »)
Acquisition des signaux d’hybridation
1 point = 1 sonde
Analyse quantitative des données
Hybridation Génomique Comparative
CGH : Comparative Genomic Hybridization
→ Plus résolutif qu’un caryotype classique : cf nombre de sondes sur le support
Mais on ne voit pas les chromosomes
Anomalie équilibrée ?
QCM 9
Figure 2 : analyse par hybridation génomique comparative (array CGH)
des chromosomes 1 (A) et 11 (B)
centromère
Numérotation des bandes
centromère
11p11
Position approximative des centromères et de la région 11p11?
QCM 10-11
Figure 3 : Analyses par hybridation in situ (FISH).
A : sondes 1q43 (rouge) et 1p13.2 (vert). B : sondes 11p15.5 (rouge) et 11p11.11-11p11.12 (vert).
L’ADN est visualisé à l’aide de DAPI (bleu).
QCM 10-11
Figure 2 : analyse par hybridation génomique comparative (array CGH)
des chromosomes 1 et 11
Sondes utilisées pour la figure 3A (rouge) et 3B (bleu)
centromère
sonde 1p13.2
centromère
11p11
Sonde 11p15.5
Sonde 11p11.11
NB: Position approximative des centromères et de la région 11p11
Sonde 1q43
Conclusion
Mère
Chromosome 1
Chromosome 11
11p
1q
Translocation réciproque entre les chromosomes 1 et 11: t(1; 11)(q41; p15.5)
mère
1
11
père
gamètes
1
11
Fille
Patient