Transcript ADN

PRINCIPES DE BASES DE L’ANALYSE
DES CHROMOSOMES HUMAINS
II. Outils
CONTEXTE CLINIQUE
Jonction entre chromosomique et moléculaire
Dr G. Lefort
II. TECHNIQUE
1) Le caryotype conventionnel en bandes
Nécessite l’obtention de cellules qui se divisent et que l’on va bloquer en
mitoses afin d’obtenir les chromosomes à un stade de condensation
maximum que l’on pourra observer au microscope optique
Inhibiteur de polymérisation
Des microtubules : Colcemid
(Molecular biology of the cell , Alberts)
Traitement des cellules
•
Choc hypotonique : KCL 0,075M 37°
•
Fixation : Méthanol/Acide Acétique
TEHNIQUE DU CARYOTYPE SANGUIN
• Mise en culture 72H
1
2
Milieu de culture + cellules en division :
* Cellules sanguines (lymphocytes + mitogène : Phytohématoglutinine)
•Colchicine : poison du fuseau mitotique . Bloque les cellules en mitoses
•Choc hypotonique et fixations
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culot cellulaire
•Etalement sur lame de verre
4
•Technique de bandes
5
Tampon phosphate 85°+ Giemsa (bandes R)
Ou Traitement par la trypsine (bandes G)
Observation au microscope
Métaphase non classée au microscope
Les chromosomes en bandes
Bandes R
Dénaturation
thermique
ISCN 2013
Idéogramme
Bandes G
Digestion
à la trypsine
TECHNIQUE DES LIQUIDES
AMNIOTIQUES
Laboratoire de cytogénétique
CHU de MONTPELLIER
M PONSET
M-C GUERIN
 MISE EN CULTURE SUR LABTEK
 Réception du LA ( réparti dans 2 tubes coniques).
 Centrifuger le liquide 5 minutes à 1000 tours/minute.
 Aspirer le surnageant en laissant 0,5 ml au dessus du culot cellulaire.
4 Labtek
1 flacon
 SORTIE DES LAMES
 Surveiller les lames au microscope inversé dès le 5ème jour.
 Évaluer les critères de maturation de la culture cellulaire :
Richesse de la lame, aspect et taille des clones, indice mitotique.
Clone jeune
Clone beau
Ébauche
RESULTATS
 Réalisation du caryotype complet : 12 à 25 clones (à partir de 2 à 3 lames)
 Résultats fiables sur liquides clairs et hémorragiques
 Possibilité de réaliser la FISH directement sur LABTEK
II. TECHNIQUE
2) L’hybridation in situ fluorescente ou
FISH
Hybridation in situ fluorescente
FISH : Fluorescent in situ hybridization
• La FISH permet la visualisation d ’une séquence d ’ADN (la
sonde) marquée par un fluorochrome, in situ après
hybridation sur les chromosomes (la cible).
• L ’hybridation de la sonde et de la cible est possible en raison
de la propriété de la double hélice d ’ADN de se dénaturer, et
de se renaturer en hybridant les séquences
complémentaires et de former un duplex sonde cible.
• La FISH permet l ’analyse des chromosomes en mitose et en
interphase (noyaux interphasiques) et ne dépend pas de
l’obtention de bandes.
TECHNIQUE D ’HYBRIDATION IN SITU FLUORESCENTE
Préparation des lames
Etalement des noyaux et chromosomes double brins
Traitement à la pepsine
Fixation à la formaldéhyde
.
Dénaturation de l ’ADN par la formamide 70%
ADN simple brin
72°
Préparation de la sonde
V
V
V
V
V
V
La sonde est en solution dans une solution d’hybridation
Contenant de la formamide et est dénaturée à 75°
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TECHNIQUE D ’HYBRIDATION IN SITU FLUORESCENTE
Hybridation de la sonde simple
brin sur l ’ADN de la lame
Observation au microscope à fluorescence
Types de Sondes pour la FISH
•
Sondes spécifiques des régions centromèriques qui vont s’hybrider sur
des séquences répétées en tandem sur plusieurs centaines de kb
– Enumération des chromosomes.
• Sondes spécifiques des régions subtélomèriques
– Diagnostic de translocation cryptique
•
Sondes séquences uniques spécifiques de loci :
– Sondes commerciales pour les Syndromes microdélétionnels connus
– BACs (ou autres vecteurs Phage, YACs) marqués dans le laboratoire pour
vérification des anomalies de CGH array
•
Sondes de peinture chromosomique obtenues à partir de l’amplification
par DOP PCR de l’ADN d’un chromosomes entier obtenu à partir
d’hybride somatique ou par cytométrie de flux.
Sondes spécifiques des régions centromèriques qui vont s’hybrider sur des
séquences répétées en tandem sur plusieurs centaines de kb. Intérêt pour
l’énumération des chromosomes.
Sondes centromèriques : Spécifique pour tous les chromosomes sauf 13 et 21 et
14 et 22.
La FISH centromèrique est utilisée pour la caractérisation des anomalies de
nombre.
Sonde séquence unique : Sont utilisées pour le diagnostic de délétion cryptique
(syndromes microdélétionnels)
Sondes de « peinture chromosomique » (whole chromosome painting : WCPs)
obtenues à partir de l’amplification par DOP PCR de l’ADN d’un chromosomes
entier obtenu à partir d’hybride somatique ou par cytométrie de flux.
utilisées pour la caractérisation des anomalies de structure.
MultiFish ou FISH 24 couleurs
II. TECHNIQUE
3) Caryotype moléculaire ou
Analyse chromosomique sur puce à ADN (ACPA) ou
Microréseaux d’ADN génomique
CGH array (Comparative Genomic Hybridization)
Microarray
• Il existe différents type de miroarray ou « chips »
• De nombreuses utilisations en biologie moléculaire :
–
–
–
–
–
–
–
Étude des profils d’expression
DNA méthylation
Splicing
miRNAs
Interaction protéines-ADN (Chromatin ImmunoPrecipitation )
Etude des single nucleotide polymorphism : SNP
Etude des Copy Number Variation : CNV (CGH array :
Comparative Genomic Hybridization)
CGH ARRAY
Etudie les CNV : Copy Number Variants
• La CGH array détecte les déséquilibres génomiques appelés
CNV
• Un CNV correspond à une variation quantitative du génome
en comparaison avec un génome de référence diploïde d’1 KB
à plusieurs mégabases.
• Les variations du nombre de copies correspondent à des
délétions, des duplications, des insertions, des remaniements
complexes.
CGH ARRAY
Etudie les CNV : Copy Number Variants
• Les CNV sont présents chez tous les individus et sont une
traduction de la diversité génétique.
• Certains CNV sont retrouvés fréquemment au sein d’une
population donnée (>1%) et correspondent à un
polymorphisme (CNP)
Hybridation comparative
•Technique d’hybridation qui
permet d’analyser les
anomalies chromosomiques
déséquilibrées (gain ou perte)
• Réalisée à partir de l’ADN à
étudier + ADN témoin
• microarray : sondes sur lame
de verre des milliers
d’oligonucléotides représentant
tout le génome
Mesure du ratio des
fluorescence
ADN à tester
ADN témoin
COHYBRIDATION
R = V normal R > V gain
R< V perte
Detection CNV : CGH array
10, 9 MB délétion 60 gènes
7.2 MB duplication
CGH ARRAY
• Difficultés pour établir le caractère pathogène d’un CNV
différents critères sont à établir:
– Caractère de novo ou hérité des parents : FISH des parents
– Taille : un remaniement de grande taille (plusieurs megabases) a plus
de chance de contenir des gènes sensibles au dosage génique
– Type : une délétion est généralement plus délètère qu’une duplication
– Contenu en gènes : établir si les gènes contenus dans la région sont
associés à des syndromes connus
– Bases de données : DGV, DECIPHER, Génome Data Base ,OMIM
– Données de la littérature
CGH ARRAY
• Les CNV diagnostiqués par CGH array doivent être vérifiés par une
autre technique quantitative : FISH, QPCR sur le patient et chez les
parents
• 3/4 délétions
1/4 duplications
• La CGHarray a permis l’identification de nouveaux syndromes de
microdélétions ou microduplications récurrentes
• la CGH array détecte en moyenne 10 à 20% d’anomalie chez les
patients ayant un décalage des acquisitions +/- malformations
• Pour effectuer le conseil génétique il est nécessaire de déterminer le
mécanisme de l’anomalie chromosomique
– Transmission sur un mode déséquilibré d’un dérivé d’une translocation
cryptique parentale
– Ségrégation méiotique d’une insertion parentale équilibrée
– Remaniement récurrent généré par recombinaison homologue non
allélique
CGH ARRAY
• CNV bénin ou polymorphisme
• VOUS : Variant Of Unknown Signification
• CNV pathogène
• Pour effectuer le conseil génétique il est nécessaire de
déterminer le mécanisme de l’anomalie chromosomique
– Transmission sur un mode déséquilibré d’un dérivé d’une translocation
cryptique parentale
– Ségrégation méiotique d’une insertion parentale équilibrée
– Remaniement récurrent généré par recombinaison homologue non
allélique
Algorythme inteprétation CGH array
David Miller and al AM J Human Genet 2010 86 749-764
II. TECHNIQUE
4) Séquençage Haut débit
Next Generation Sequencing
NGS
• Permet le séquençage de millions de molécules d’ADN
simultanément après la préparation d’une banque de
fragments
• Les « reads » sont ensuite alignés sur un génome de référence
• Permet le diagnostic des anomalies moléculaires au niveau
génique (mutations) mais aussi des anomalies
chromosomiques :
–
–
–
–
Délétion
Duplication
Inversion
Insertion
Intérêts/limites du caryotype standard
• Analyse pangénomique
• Permet le diagnostic des anomalies équilibrées
• Faible résolution : 5MB pour 55O Bandes
10 MB pour 400 bandes
• Difficultés d’analyse de certaines régions chromosomiques en
raison de la non discrimination des bandes
• Nécessite l’obtention de cellules en culture
• Long et laborieux
Intérêts/limites de la FISH
• Réalisée sur métaphases et/ou noyaux interphasiques
– Ne nécessite pas l’obtention de cellules en culture
– Permet de compter des centaines de métaphases et noyaux à la
recherche d’une faible mosaïque
• Résolution permettant le diagnostic des syndromes
microdélétionnels
• Permet de confirmer une anomalie suspectée sur le caryotype
standard
• Permet l’analyse pantélomèrique
• Etude ciblée
• Ne permet l’analyse que d’un nombre limité de régions
chromosomiques pour un patient (2 ou 3 sondes)
Intérêts/limites du caryotype moléculaire
• Analyse pangénomique
• Résolution
• A partir de l’ADN même en faible quantité
• Ne diagnostique pas les anomalies équilibrées
• Difficultés pour les anomalies en mosaïque
• Difficultés d’interprétation des CNV (copie number variation)