Transcript AHL - iGEM 2008

送受信チーム
冨永将大・川崎浩平・井山佳美
目標:
gfp発現のタイミングをコントロール
1時間タイマー
1 hour
5時間タイマー
4 hours…
1 hour
Still inactive
active
細胞間コミュニケーション
シグナル分子の蓄積
クオラムセンシング
クオラムセンシング
Sender cell
produce AHL
Receiver cell
AHL gfp expression
pc
luxR
LuxI
pc
luxI
LuxR
AHL
蓄積
plux
gfp
AHLの蓄積
通常AHL通信
LuxI
LuxR
AHL感受性変更通信
？
LuxR
求められること
AHL
AHLs
感度の異なるAHL受信装置の作成
クロストークの利用
Part:BBa_F2620:Specificity
http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity
Quorum sensing
由来生物
Autoinducer
R:Group
Autoinducer
synthase
V.Fisheri
(3OC6)
P.aeruginosa
(3OC12)
P.aeruginosa
＋
(C3)
AHL
基本構造
(C6)
LuxI
LuxR
lasI
lasR
RhlI
RhlR
cinI
cinR
R.leguminosarum
(3OH14C)
Recepter Protein
求められること
RhlI
RhlI
LuxI
LasI?
CinI?
Part:BBa_F2620:Specificity
http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity
シグナル分子(=AHL)の変更
《クロストーク》
Autoinducer synthase
LuxI
lasI
cinI
RhlI
LuxR
plux
gfp
タイムディレイテスト
通信条件
•温度
37℃、30℃
•大腸菌株
JW1908、XL10GOLD
•菌数比
Receiver / Sender = 1
10
100
タイムディレイテスト(クロストーク)
LuxR plux gfp
Receiver
Mix(t=0)
蛍光強度測定
37℃ or 30℃
Senders
LuxI
lasI
RhlI
?
タイムディレイテスト(Cross-talk)
Receiver-JW1908
Senders-XL10Gold
plac
plac
LuxI
lasI
plac RhlI
ptet
LuxR
plux
gfp
cross-talkの効果は？
XL10GOLD , Receiver ： Sender = １ ： １
37℃
30℃
LuxI
LuxI
RhlI
RhlI
LasI
LasIのみ、delay発生＋低い
LasI
タイムディレイテスト(TAG効果)
Senders-XL10Gold
Receiver-JW1908
plac LuxI
ptet
plac
LuxI
LVA
plac RhlI
plac RhlI
LVA
LuxR
plux
gfp
LVA-Tagの効果は？
XL10GOLD , Receiver : Sender =1 ： 1 (30℃)
LuxI
RhlI
Tagなし
Tagつき
Tagの効果：最大値の低下
Tagなし
Tagつき
LVA-Tagの効果は？
XL10GOLD , Receiver ： Sender = １０ ： １
LuxI
Tagなし
（ 3０℃ ）
RhlI
Tagなし
Tagつき
Tagつき
Senderを少なくする→Tagの効果UP＋delay発生
AHL合成が少ないとき効果あり
タイムディレイテスト(温度依存性)
LuxR plux gfp
Receiver
Mix(t=0)
蛍光強度測定
37℃ or 30℃
Senders
LuxI
lasI
RhlI
?
温度の影響は？
XL10GOLD , Receiver ： Sender = 1 : 1
37℃
30℃
LuxI
LuxI
RhlI
RhlI
LasI
LasI：30℃の方が強い
LasI
タイムディレイテスト(株依存性)
Senders-JW1908
Senders-XL10Gold
plac
LuxI
plac
LuxI
plac
lasI
plac
lasI
plac RhlI
plac RhlI
Receiver-JW1908
ptet
LuxR
plux
gfp
株の影響は？
Receiver ： Sender = 1 ： 1 （37℃）
JW1908
XL10GOLD
RhlI
LuxI
RhlI
LuxI
LasI
LasI
タイムディレイテスト(菌数比の影響)
LuxR plux gfp
Receiver
Mix(t=0)
蛍光強度測定
30℃
?
Senders
Receiver / Sender
(R/S) = 1
LuxI
lasI
RhlI
=10
=100
菌数比の影響は？
30℃、JW1908
RhlI
LasI
S/R=10
S/R=1
S/R=10
S/R=100
S/R=1
S/R=100
実験の流れ
テスト準備（8/17~）
バラバラなパーツの組み直し
CrrosTalkテスト（9/2~）
Lux
Las
Rhl
Cin
Lux
Las
Rhl
Cin
タイムディレイテスト（液体培地）
(9/8~9/25）
Today
タイムディレイテスト(固体培地)
（9/26~）
タイムディレイテスト（固体培地spot）
XL10GOLD , Receiver / Sender = 1, 37℃
LuxI
LasI
RhlI
2h後
8h後
5h後
ptet
LuxR
plux
結果予想図
→輪の広がる速度に差が出る
Receiver-JW1908
gfp
New Parts
BBa_K084008
plac RhlI
BBa_K0840012
plac luxI
BBa_K084009
plac RhlI
BBa_K084014
plac luxI
LVA
BBa_K084007
plac lasI
LVA
BBa_K084010
plac
cinI
LVA