Transcript アオコ実習講義

分析系応用実習
環境汚染物質の分析
061130
考える習慣を身につけよう
実習の内容
１） 実習講義・器具点検・試薬調製
２） ①室内環境：ホルムアルデヒドの測定
②水質試験法：溶存酸素 (DO)の測定
３） ①農薬をGCで検出・定量
②室内環境：気温、気湿、カタ冷却力、気動、感覚温度
を算出、騒音、照度、炭酸ガスの測定
４） 重金属の原子吸光光度法による検出・定量
５） アオコの毒素microcystinのHPLC による検出・定量
６） 今回の実験のまとめ・報告会、器具点検
HPLC使用の実習（アルデヒド）のおさら
い
実習書p19参照
①は、ホルムアルデヒド
②は、アセトアルデヒドでした
では・・・
矢印で示されたピークって何？
考え方・・・
検出される化合物の共通点？
検出波長？
疎水性の大きさ？
アオコの異常発生
Microcystis aeruginosa
2005/8/2 長野県諏訪湖
湖沼生態系の循環図
湖沼
アオコ発生
生合成
N, P
OH
2-methylisoborneol
COOH
N
HN
OH
OCH3
Adda
カビ臭物質
O
O
NH
R2
geosmin
R4
O
R3
H
N
O
R1
NH
O
COOH
肝臓毒
（Microcystin類）
毒性発現
肝臓毒性
発がんプロモーター作用
人類
Microcystin 類の構造
6. D-Glu (iso)
実習書p45 参照
COOH
7. Mdha
N
HN
O
OCH3
O
O
NH
1. D-Ala
R3
NH
H
N
R2
R1
5. Adda
O
O
COOH
3. D-b-Me-Asp (iso)
Adda: (2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4(E),6(E)-dienoic acid
D-β-Me-Asp: D-erythro-β-methylasparatic acid
Mdha: N-methyldehydroalanine
R1
R2
R3
R4
MW
m i crocysti n -RR
L-Arg
L-Arg
C H3
C H3
1037
m i crocysti n -YR
L-Tyr
L-Arg
C H3
C H3
1044
m i crocysti n -LR
L-Le u
L-Arg
C H3
C H3
994
microcyst in-LA
L-Leu
L-Ala
CH 3
CH 3
909
3-desmet hylmicrocyst in-LR
L-Leu
L-Arg
H
CH 3
980
7-desmet hylmicrocyst in-LR
L-Leu
L-Arg
CH 3
H
980
Microcystin 類の物理化学的性質
COOH
R4
N
HN
OCH3
NH
R2
Adda
O
O
R3
O
疎水性
H
N
O
R1
NH
O
COOH
親水性
・Adda 部は疎水性、他の部位は親水性を示す
・有機溶媒と水系溶媒の両溶媒に溶けにくい
・光により幾何異性化や分解が起こり、毒性が軽減、消失する
・熱に安定。
Microcystinの生理活性
・肝臓に特異的に蓄積
・タンパク質脱リン酸化酵素 (PP) 1
およびPP2Aの阻害
・肝臓細胞のアポトーシス誘導
・肝臓の出血
・発がんプロモーター作用
Microcystin-LRによるPP1の活性阻害
J. Goldberg et al. Nature, 376, 745 (1995)
Microcystin-LRの生理活性
皮下投与
気管内投与
LD50 75 mg/kg
腹腔内投与
LD50 75 mg/kg
LD50 75 mg/kg
経口投与
LD50 10～15 mg/kg
Microcystinの70種近い同族体のうち、Microcystin-LRの毒性が一番強い。
経口よりも、直接血液等に入る場合に、毒性が発現しやすい。
毒性は、フグ毒テトロドトキシンと同程度、青酸カリの数十倍程度。
Microcystin-LR, YR, RR の比較
疎水性の違いはどこからくるか？実習書p45参照
H
CH3
CO2H
N
HN
H3C
OCH3
NH
CH3
CH3
O
O
O
O
HN
NH
R2
H2N
L-Arg
NH
O
HN
H
N
HN
HN
CH2
H3C
CH3
H
N
O
R1
O
NH2
O
HN
NH
CH3
CO2H O
OH
H3C
L-Leu
microcystin-LR
L-Tyr
microcystin-YR
L-Arg
microcystin-RR
Microcystin類のODS シリカゲルカ
ラム内の挙動
Time
移動相
MCLR
MCLR
ODS
ODS
MCYR
ODS
MCLR
ODS
MCYR
MCRR
保持
：疎水結合
MCRR
MCYR
MCLR
溶出
溶出
溶出
microcystin（MC）の 疎水性： MCRR ＜ MCYR ＜ MCLR
Microcystin 類の検出
OCH3
O
NH
Adda
Adda
共役ジエン
238 nm
Microcystin 類は 238 nm 付近に吸収極大をもつ。この吸収極大は Adda の
構造中の共役ジエン（S-trans ジエン）に由来している。
吸
光
度
Microcystin-LRの
UVスペクトル
217 nm ＋15 nm ＋ 8 nm = 240 nm
ジエン
ジエンに結合する
３つのアルキル基
移動相の40 %
メタノール
波長 (nm)
HPLC 装置
インジェクター
ポンプ
移動相
圧力計
カラム
HPLC 条件
移動相：メタノール：0.05 Mリン酸緩衝液
（pH 3.0）＝6：4
カラム： STRODS-2（Shimadzu）
(4.6×150 mm)
流速：1 mL/min
注入量：20 mL
検出：UV 238 nm
MCLR
MCYR
MCRR
検出器
記録装置
廃液
最新機器分析学 南山堂
HPLC による microcystin-LR, RR, YR の
分離
（保持時間）
溶出順と疎水性の関係は？
疎水性：microcystin-RR microcystin-YR
microcystin-LR
分析系応用実習テキスト p.46
ラン藻に含まれる microcystin の定量
本日配布資料参照
・諏訪湖産ラン藻Suwako97
乾燥藻体
抽出
およびSuwako99
①
（重量を記録）
抽出液
クリーンナップ
②
試験溶液
HPLC
検量線と照らし合わせ濃度を算出→このあと？
今回、検量線作成のためのクロマトグラムは、実際に標準サ
ンプルをHPLCに入れて、各班で作成します。
① 抽出
20mLのシリンジ
乾燥藻体
5 % 酢酸15mL
上清液
遠心分離
遠心管を使用
（撹拌子を入
れるのを忘れ
ずに）
撹拌
（30分）
1300 × g
（約 3000 rpm）
10分
上清液
ガラス繊維
フィルター
抽出ろ液
絶対に遠心管
を振らない！
・有機溶媒（アルコール等）を用いて抽出すると・・・？ なぜ酢酸で抽出してるの？
分析系応用実習テキスト p.44
② クリーンナップ（固相抽出）10mL
抽出ろ液
あらかじめ ODS カートリッジには、メタノール→水（各5mLずつ）を
流しODS 基を活性化させておく、また操作中ODSカートリッジは、
乾燥させないよう、前の溶液をほんの少し残し、次の溶液を入れる
活性化に用いた廃液：マイヤー①
○抽出ろ液をODS カートリッジに通す
水画分廃液：マイヤー②
○水（5mL）
空気
ジョイント
○20 ％ メタノール（5mL）
20％メタノール画分廃液：マイヤー③
○90 ％ メタノール(5mL)
○メタノール（5mL）
各溶液
試験溶液用すり付きナス型フラスコ
（microcystin画分）
溶出液（90％、100％メタノール画分のみ）
ODS カートリッジ
濃縮乾固（ロータリーエバポレーター）
40 ％ メタノール（10mL）に再溶解
適宜希釈、ろ過（メンブレンフィルター）
試験溶液とし、HPLC 分析
溶出液
（マイヤー①～③、ナスコル）
分析系応用実習テキスト p.44
濃度算出
－検量線法－
ピ
ー
ク
面
積
microcystin 標準溶液
：0.4 mg/mL
検量線
（なぜ直線･･･？）
：2.0 mg/mL
：試験溶液
0
0.4
2.0
microcystin 濃度（mg/mL）
まとめ
乾燥藻体
抽出
（5％ 酢酸）
脂溶性が高い物質（色素等）を抽出しにくい。
⇨クリーンナップの操作が容易になる。
⇨ HPLC による定量が正確に行える。
抽出液
クリーンナップ
（ODS カートリッジ）
疎水性の低い物質（不純物）を除去。
⇨ピークの明確化により、HPLC による定量を正確に行え
る。
試験溶液
HPLC
microcystin は種類により疎水性が異なる。
⇨ ODS シリカゲルカラムを使った HPLC を用いて分離、
定量ができる。
検量線と照らし合わせ濃度を算出
実験スケジュール
撹拌抽出（30分間）
HPLC分析：標準溶液の分析
（各班１台割り当て）
質問があれば、待ち時間にODSカートリッジ
使用方法説明
遠心分離（10分間）
固相抽出（ODSカートリッジ）クリーンナップ
エバポレーター → 再溶解 → メンブレンフィルター
HPLC分析：抽出試料の分析
渡すもの（要返却）
・遠心沈澱管・ナス型フラスコ立て
（特に汚れていなければそのまま返却）
4コ
・遠心沈澱管 50 mL
・撹拌子
・テルモシリンジ 10 mL（ODSカートリッジ加圧用）
・ODSカートリッジ用ジョイント（絶対に捨てないで）
・ナス型フラスコ 50 mL（すりのふた付き）
・ガラスシリンジ 2 mL（メンブレンフィルター用）
・ガラスシリンジ用針
・メスフラスコ 10 mL
・白蓋付きバイアル 2ml
（以上９点は洗浄して返却）
2コ
2コ
2コ
2コ
2コ
2コ
2コ
2コ
2コ
渡すもの（廃棄）
・凍結乾燥した諏訪湖産ラン藻（Suwako97）
約100 mg
・凍結乾燥した諏訪湖産ラン藻（Suwako99）
約100 mg
（以上2点はキムワイプ・ろ紙等に吸わせてアオコ用ゴミ箱に廃
棄：試薬台４）
・テルモシリンジ 20 mL（ガラス繊維フィルター用） 2コ
・ガラス繊維フィルター
2コ
・ODSカートリッジ
2コ
・メンブレンフィルター
2コ
（以上4点は医療用プラスチックとして廃棄：入り口横）
溶液および機器
使う溶液（ドラフト）
・5%酢酸
・メタノール
標準品（HPLC前）
・MCRR, YR, LR混合溶液
(2 mg/mL, 0.4 mg/mL)
調製する溶液
・20％メタノール
・90％メタノール
・40％メタノール
使う機器
・マグネチックスターラー
・遠心沈殿管用天秤
・遠心分離機
・エバポレーター
・HPLC
：12本同時（試薬台４）
：2本同時（試薬台４ ）
：4本用＋8本用（試薬台４ ）
：4つ同時（試薬台５ ）
：各班（実習室南側窓際）
廃液
（ナスコル・メスフラスコ・小バイアルのみ）
Microcystin 含有廃液
（準備室前）
Microcystin を含まない
有機溶媒含有溶液（マイヤー①③）
有機溶媒廃液びん
（ドラフト南端）
Microcystin ・有機溶媒
を含まない水溶液（マイヤー②）
流し（各実験台）
Microcystin 含有溶液
発表会について
日時：10月 22日（木） 13：10～
場所：6号館4階 情報メディア教室
10月 21日（水） 実習時間内に各班の担当項目を決定（各班2項目）
発表担当者は当日指名（各班のaから1人、ｂから1人）
発表方法：発表担当者は準備したスライド等を使用して発表を行う。
発表内容：実習テキスト（p.ⅲ）を参照。
発表時間：各項目10分程度、質問を含めて15分以内。
発表を担当しない班は3回以上質問をすること。
レポート・実習試験について
レポート提出：10月28日（水）18：00 6号館1階薬学教育開発センター
レポート返却：11月 4日（水）12：20～18：00 上記同じ場所
実習試験：11月7日（土） 15:00～ 61（AB）、62（CD）教室
レポートの内容
・目的
・実験の流れ（フローシートで）
・検出のための原理
・考察
一項目一枚に収めてください。
それぞれの実験の操作の意味や原理をしっかり考えて書いてください。
スライドショーの最後ですが、クリックしても終了しません