100 MPa - 化学応用工学科
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Transcript 100 MPa - 化学応用工学科
1/39
タンパク質の結晶成長
- 実は結晶成長のモデル系？ -
徳島大学工学部化学応用工学科
鈴木良尚
目次
2/39
1. 結晶成長基礎知識
2. タンパク質結晶を研究する意味
3. 結晶化機構のマクロな解析
（面成長速度）
4. 結晶化機構のミクロな解析
（ステップ前進速度と二次元核生成頻
度）
5. まとめ
3/39
結晶成長とは？
希望の品質・サイズの結晶
を得るためにその結晶の成
長機構を研究する学問
相転移の非平衡統計力学の
一分野
Si wafer, d = 300 mm, (100) oriented
4/39
結晶の生い立ち
核生成
成長
…….
臨界核
G N A
5/39
過飽和度
ln(C / Ce ) / kT
過飽和度大→成長速度大
同じ過飽和度でも成長速度変
化→速度論的要因
6/39
結晶の育ち方
らせん転位
(a) 渦巻き成長
(b) 二次元核成長
7/39
分子の結晶への取り込み過程
Diffusion
Desorption
Adsorption
kink
s
step
w
h
Surface diffusion
目次
8/39
1. 結晶成長基礎知識
2. タンパク質結晶を研究する意味
3. 結晶化機構のマクロな解析
（面成長速度）
4. 結晶化機構のミクロな解析
（ステップ前進速度と二次元核生成頻
度）
5. まとめ
モデルタンパク
質
9/39
Glucose isomerase (from Streptomyces Rubiginosus)
asymmetric unit
tetramer
10/39
背景
*124
Extraction
*89
Purification
*63
Crystal
Growth
*19
PDB holdings: 31306
X-ray: 27188
NMR: 4118
(27-Sep-2005)
Bottle
Neck!!!
Structure
Analysis
*15
*A summary of progress in the Human Proteome Structural Genomics Pilot
Project (http://proteome.bnl.gov/)
モデルタンパク
質
11/39
Glucose isomerase (from Streptomyces Rubiginosus)
asymmetric unit
tetramer
Crystal concentration / g l-1
12/39
Visuri’s work
50
150 MPa
200 MPa
100 MPa
0
0.1 MPa
0
30
t / min
K. Visuri et al.
Bio/Technology
8 (1990) 547.
結晶の生い立ち
核生成
成長
…….
臨界核
G N A
13/39
目次
14/39
1. 結晶成長基礎知識
2. タンパク質結晶を研究する意味
3. 結晶化機構のマクロな解析
（面成長速度）
4. 結晶化機構のミクロな解析
（ステップ前進速度と二次元核生成頻
度）
5. まとめ
15/39
試料調製
4℃
incubation
Seed crystals
40℃
dissolution
Crystal
Suspension
Dilution
0.45 mf
filtration
Starting
Solution
Solution for
Solubility
measurements
グルコースイソメラーゼ結晶
16/39
Space group: I222
Unit cell*: a=9.388 nm, b=9.964 nm, c=10.290
nm (Z=2)
*Carrell, H. L.; Glusker, J. P.; Burger, V.; Manfre, F.; Tritsch, D.; Biellmann, J.-F.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989, 86, 4440-4444.
Morphology of the glucose
isomerase crystal
17/39
18/39
過飽和度
ln(C / Ce ) / kT
過飽和度大→成長速度大
同じ過飽和度でも成長速度変
化→速度論的要因
19/39
{101} 面の成長速度過飽和度依存性
2
R / nm s -1
100 MPa
0.1 MPa
1
0
-2
0
2
20/39
渦巻き成長
K sa 2
R
19
二次元核成長
(Birth & Spread model)
2
k2
2 / 3 1/ 6
R k1 exp( )(exp( ) 1) exp(
)
3
k2
(101)
2
3k T
2
2
21/39
2
R / nm s -1
100 MPa
0.1 MPa
1
渦巻き成長
二次元核成長
0
-2
0
2
22/39
ステップレッジ表面エネルギーの
圧力変化
p / MPa
(101) / kT
0.1
4.1 ± 0.3
100
1.8 ± 0.3
目次
23/39
1. 結晶成長基礎知識
2. タンパク質結晶を研究する意味
3. 結晶化機構のマクロな解析
（面成長速度）
4. 結晶化機構のミクロな解析
（ステップ前進速度と二次元核生成頻
度）
5. まとめ
結晶の面成長速度のみ→不確定要素あ
24/39
り
単位ステップの前進速度および二次元核生
成頻度の測定が必要（しかも高圧力下！）
レーザー共焦点微分干渉顕微鏡#で可能！
#G.
Sazaki, T. Matsui, K. Tsukamoto, et. al. J. Cryst. Growth 2004,
262, 536-542.
目的
25/39
ステップ前進速度の圧力依存性
二次元核生成頻度の圧力依存性
その場観察用高圧容器
26/39
50ｍｍ
50ｍｍ
Φ3ｍｍ
45゜
TERAMECS Co., Ltd.
Max 100 MPa
18.3ｍｍ
Φ30ｍｍ
27/39
高圧容器内の結晶の配置
と顕微鏡の位置関係
Crystal
Sapphire
window
7.6 mm
LCM – DIM
(Olympus, FV300 + IX71
+ U-DICTHC )
Objective lens
(Olympus, SLCPlanFl 40 X,
WD = 7.6 mm, NA = 0.55 )
P = 0.1 MPa, 26.4 ℃, 5.6 mgml-1
28/39
P = 50 MPa, 26.4 ℃, 5.6 mgml-1
29/39
x-y
-100
-50
150
150
130
130
110
110
90
90
70
70
50
50
30
30
10
10
-10 0
30/39
y-z
50
100
z-x
-50
-10 0
-30
100
-30
-50
80
-50
50
60
40
20
0
-50
0
50
100
150
-20
-40
-60
-80
-100
6.935 nm
100
150
31/39
h101 = 7.0 ± 0.7 nm
ステップ前進速度
32/39
kink
v s w h exp(
)(Csurf Ce )
kT
2
2
kink
s
w
h
step
kink
ステップ前進速度の濃度依存
性
50 MPa
V
ave
/ nms
-1
3
2
25 MPa
1
0.1 MPa
0
0
2
-1
C-C / mgml
e
4
33/39
二次元核生成頻度
34/39
G
J s Zf nsat exp(
)
kT
2 2
f
4
h f0
2
1/ 2
2
0
ad
2
wh Csurf exp(
) exp( 2 2
)
sin 2
kT
k T sin 2
35/39
二次元核生成頻度の圧力依存性
6.00E+06
-2
Js / m s
-2
5.00E+06
4.00E+06
3.00E+06
2.00E+06
1.00E+06
0.00E+00
0
20
40
p / MPa
60
36/39
二次元核生成頻度の過飽和度依存性
50 MPa
4 106
2 106
s
J /m s
-2 -2
6 106
25 MPa
0
0.1 MPa
0
0.4
0.8
/-
1.2
1.6
目次
37/39
1. 結晶成長基礎知識
2. タンパク質結晶を研究する意味
3. 結晶化機構のマクロな解析
（面成長速度）
4. 結晶化機構のミクロな解析
（ステップ前進速度と二次元核生成頻
度）
5. まとめ
38/39
結論
Pressure
V(101)
Pressure
Js(101)
タンパク質結晶
→結晶成長機構を探るモデル物
質
39/39
謝辞
本研究の一部は東北大学金属材料研究所研究部共同研究の
一環として行われました。改めて感謝申し上げます。
メンバー
佐崎 元, 中嶋一雄 （東北大学金属材料研究所）
松本雅光, 永澤眞（テラメックス株式会社）
田村勝弘（徳島大学工学部）
x-y
-100
-50
y-z
150
150
130
130
110
110
90
90
70
70
50
50
30
30
10
10
-10 0
50
100
z-x
-50
-10 0
-30
100
-30
-50
80
-50
50
60
40
20
0
-50
0
50
100
150
-20
-40
-60
-80
-100
6.935 nm
100
150
h101 = 7.0 ± 0.7 nm
z-x
z-x
150
150
150
130
130
130
110
110
90
90
70
70
50
50
30
30
10
10
-50
-50
-10
-10 00
-30
-30
-50
-50
5050
100
100
150
150
150
Morphology of the glucose
isomerase crystal
Growth rate of {101} face
0.1
100 MPa
0.1 MPa
2
R / nm s -1
0
1
Ce(0.1 MPa)
=2.6±0.5 mg ml-1
Ce(100 MPa)
=3.1±0.9 mg ml-1
0
0
0
8
4
20
40
C / mg ml-1
60
(a) 0.0 sec
(c) 38.5 sec
(b) 19.2 sec
(d) 57.6 sec
x-y
150
150
130
130
110
90
70
Tetramer間
Tetramer形成
Dimer形成
Tetramer形成
219.67 kJ/mol
kJ/mol
1200.42
3053.98
972.80
50
30
10
-50
-50
-10 0
-30
-50
50
100
150
y-z
150
130
110
90
70
50
30
10
-50
-50
-10 00
-10
-30
-30
-50
-50
50
50
100
100
150
150
Background
Atmospheric
pressure
Unfolding
(denaturation)
Crystal
Enzymatic
activity
Activity
Molecule
Pressure
背景
タンパク質は高圧力下で常圧下とは異なる機
能を発現（αキモトリプシン、タカアミラーゼAな
ど）
→高圧力下での分子立体構造の変化が原
因？
p
Denatured
Native
T
背景
深海微生物の増殖速
度などは高圧力下で最
も高い
→高圧力下で最も高い
活性を持つタンパク質
が存在
絶対高圧性細菌の生育プロファイル
（海洋科学センターDeepstar group）
以上の問題の解決のためには？
高圧力下でのタンパク質の分子構造の原子
レベルでの解明が必要
NMR（Rafaee, et al. J. Mol. Biol. 2003, 327,
857-865）
X線結晶構造解析
モデルタンパク質
Glucose isomerase (from Streptomyces
Rubiginosus, I222, a=9.388 nm b=9.968 nm
c=10.290 nm)
asymmetric unit
tetramer
Future works
3D structure analysis of
the crystal of pressurized protein
(ex situ or in situ)
Effects of pressure on the Enzymatic
activity
Concentration distribution
Growth
Dissolution
24.7℃, 100 MPa
44.1℃, 100 MPa
Bulk concentration → C
Interference
fringes
Crystals
Interference
fringes
Growth
TG
Equilibrium
<
Te
Dissolution
<
TD
Solubility curves
40
Ce / mg ml-1
30
0.1 MPa
100 MPa
20
10
0
290
300
310
T/K
Table 1 List of the pressure effects on the solubility and the growth kinetics
Proteins
Lysozyme (tetragonal form)
Lysozyme (orthorhombic form)
Purafect subtilisin
Thaumatin*
Glucose isomerase
Solubility
Increase
Decrease
Increase
Decrease
Decrease
Growth kinetics
Inhibit
Inhibit
Inhibit
?
(This work)
Table
k1 and k2 for glucose isomerase and hen egg-white lysozyme crystals
Proteins and Coefficients
0.1
Glucose isomerase
{101} faces
k1 / nm s-1
k2
Hen egg-white lysozyme
Tetragonal form [12]
{110} faces
k1 / nm s-1
k2
k2 (k1 fixed)*
{101} faces
k1 / nm s-1
k2
k2 (k1 fixed)*
Orthorhombic form [21]
{011} faces
k1 / nm s-1
k2
Pressure / MPa
50
7±6
18 ± 2
100
0.16 ± 0.08
3±1
0.8 ± 0.6
4±2
4±2
3±4
9±3
5.4 ± 0.2
(7 ± 37)X106
50 ± 10
9.6 ± 0.6
0.1 ± 0.1
1±2
1±2
0.3 ± 0.5
4±3
2.0 ± 0.3
0.9 ± 0.6
6±2
2.59 ± 0.08
5±1
2.0 ± 0.4
1.7 ± 0.6
1.5 ± 0.5
Table 3 List of the molecular surface energy of hen egg-white lysozyme and
Protein
glucose isomerase crystals.
Pressure / MPa
0.1
50
Glucose isomerase
{101} / kT
{101} / kT (k1(0.1 MPa) fixed)
{101} / kT (k1(100 MPa) fixed)
Hen egg-white lysozyme
Tetragonal form
{110} / kT
{110} / kT (k1(0.1 MPa) fixed)
{101} / kT
{101} / kT (k1(0.1 MPa) fixed)
100
4.1 ± 0.3
1.8 ± 0.3
4.1 ± 0.3
3.52 ± 0.04
2.68 ± 0.04
1.8 ± 0.3
1.9 ± 0.4
2.9 ± 0.5
6.6 ± 0.9
1.9 ± 0.4
2.27 ± 0.04
3.02 ± 0.09
1.0 ± 0.7
1.9 ± 0.8
2.5 ± 0.3
1.0 ± 0.7
1.4 ± 0.1
1.58 ± 0.05
Orthorhombic form
{011} / kT
1.4 ± 0.1
1.2 ± 0.2
{011} / kT (k1(0.1 MPa) fixed)
1.4 ± 0.1
1.68 ± 0.02
k1 ( ) a h C
3
ad 2kink
exp(
)
3kT
1/ 3 13/ 3 4 / 3
2 / 3 4 / 3
0
e
Inner cell
crystal
silicone
tubes
spacer
2.0 mm
15 mm
0.9 mm
silicone
tubes
glass slides
spacer
Thermodynamic relations
lnCe
H R
(1/T)
ln Ce
S Rln Xe RT
T
lnCe
V RT
p
van’t Hoff plot
4
0.1 MPa
100 MPa
lnCe
3
2
1
0.00315
0.00325
0.00335
T-1 / K-1
0.00345
Thermodynamic functions
Pressure
Protein
(crystal form)
Lysozyme
(tetragonal)
Lysozyme
(orthorhombic)
Glucose
isomerase
0.1 MPa
50 MPa
100 MPa
H / kJ mol-1:
130±10
110±20
70±10
S / J mol-1 K-1:
460±40
400±60 280±40
V / cm3 mol-1:
-18±46
H / kJ mol-1:
35±3
35±5
S / J mol-1 K-1:
140±10
140±20
V / cm3 mol-1 :
5±18
H / kJ mol-1:
160±40
210±60
S / J mol-1 K-1:
420±100
580±180
V / cm3 mol-1 :
54±31
Growth rate of {101} face
100 MPa
0.1 MPa
R / nm s-1
0.8
0.4
0
0
2
4
6
8
Growth rate and Supersaturation
G Adhesive Growth
Two dimensinal
nucleation Growth
G
Spiral Growth
G
G
=/kT=ln(C/Ce)
: supersaturation
Ce : equilibrium concentration
(a)
Michelson
interferometer
Light source and camera
Objective lens
(super long W.D.)
Adjustable (10mm)
Beam splitter
Reference
mirror
W.D.=25.5mm
High-pressure
vessel
Water
jacket
Interference cell
(b)
Inner cell
Sapphire window
Peltier
element
Seed crystal
Volume of the cell: 36 µl
Quartz glass
Solution
0.9 mm
Silicone tube
Gold mirror