Transcript PowerPoint プレゼンテーション

五十嵐研 雑誌会 No. 1112
逆回転β酸化経路による物質生産
平成２４年５月２３日
石井 正治
微生物による物質生産のための
Driving Force
１．ガス状分子の放出
２．不可逆的反応あるいはポリマー化反応の
存在
３．Futile cycleによるATPの消費あるいはATPシン
ターゼの破壊（ATP生成が関与している場合）
４．外部sinkへの電子授受
５．相分離による生産物除去
Appl. Environ. Microbiol., 77(9) 2905-2915 (2011)
Acetyl-CoA
(Cn-2)Acyl-CoA
CoA-SH
3-Ketoacyl-CoA
(Cn)-Acyl-CoA
FAD
β酸化経路
NADH
FADH2
NAD+
3-Hydroxyacyl-CoA
Enoyl-CoA
H2O
Acetyl-CoA
(Cn-2)Acyl-CoA
CoA-SH
Acetyl-CoA
acyltransferase
3-Ketoacyl-CoA
fadA
3-Hydroxyacyl-CoA
dehydrogenase
NADH
NAD+
β酸化経路
fadB
(Cn)-Acyl-CoA
FAD
Acyl-CoA
dehydrogenase
fadE
3-Hydroxyacyl-CoA
Enoyl-CoA hydratase
fadB
Enoyl-CoA
H2O
FADH2
逆回転
β酸化経路
による
物質生産
Nature 476: 355-361 (2011)
逆回転
β酸化経路
による
物質生産
Thiolase
yqeF, fadA, atoB
Hydroxyacyl-CoA
dehydrogenase
Enoyl-CoA
reductase
fadB
ydiO
Enoyl-CoA
hydratase
fadB
Nature 476: 355-361 (2011)
脂肪酸生合成経路と逆回転 β-酸化経路の比較
n/4 C6H12O6 + ATP →
CnH2n+2O + n/2 CO2 + (n/2 -1)
H2O
n/4 C6H12O6 → CnH2n+2O +
n/2 CO2 + (n/2-1) H2O + n/2
ATP
使用菌株の特徴
１．大腸菌のβ酸化系が含まれている、fadとatoレギュロン
のconstitutiveな発現
fadRとatoC(c) への変異
２．CRP-cAMP複合体によるカタボライト抑制の回避
CrpのcAMP-independent mutant（crp*）の使用
３．β酸化系酵素遺伝子のArcAによる抑制回避
arcA遺伝子除去
RB01: MG1655 fadR atoC(c) crp* ΔarcA
RB02: MG1655 fadR atoC(c) crp* ΔarcA ΔadhE Δpta ΔfrdA
ブタノール生産性
AtoB:
acyltransferase
specific to short
chain acyl-CoA
molecules
YqhD:
aldehyde/alcohol
dehydrogenase
YqeF:
predicted
acyltransferase
FucO: 1,2propanediol
oxidoreductase
EutE: Aldehyde dehydrogenase with high
sequence similarlity to AdhE and YqhD
リアクターを用いてのブタノール生産
14 g/L, 0.33 g/g-Glucose consumed, 2 g Butanol/g-cell dry weight/h
消費グルコース当たりの
モル収率：８４．５％
73.4 mmol Acetyl-CoA/g-cell dry weight/h (12-18h)
既往研究との比較
一寸、待った！！
Acetyl-CoA
(Cn-2)Acyl-CoA
CoA-SH
Acetyl-CoA
acyltransferase
3-Ketoacyl-CoA
fadA
この反応は
不可逆！！
3-Hydroxyacyl-CoA
dehydrogenase
NADH
NAD+
β酸化経路
fadB
3-Hydroxyacyl-CoA
Enoyl-CoA hydratase
fadB
(Cn)-Acyl-CoA
FAD
Acyl-CoA
dehydrogenase
fadE
Enoyl-CoA
H2O
FADH2
個々の反応に関わる酵素タンパク
（此処に至る詳細は不明ではある
が・・）
Reaction (1): Acetyltransferase
YqeF
Reaction (2) and (3): 3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and
Enoyl-CoA hydratase
FadB
Reaction (4): Acyl-CoA dehydrogenase/ Enoyl-CoA reductase
YdiO
Reaction (5): Aldehyde-forming acyl-CoA reductase
MhpF
Reaction (6): Butanol dehydrogenase
FucO
FadA + YqeF由来の活性
YqeF増幅効果
FadAの寄与
FadA + YqeFの寄与
個々の反応に関わる酵素タンパク
（此処に至る詳細は不明ではある
が・・）
Reaction (1): Acetyltransferase
YqeF
Reaction (2) and (3): 3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and
Enoyl-CoA hydratase
FadB
Reaction (4): Acyl-CoA dehydrogenase/ Enoyl-CoA reductase
YdiO
Reaction (5): Aldehyde-forming acyl-CoA reductase
MhpF
Reaction (6): Butanol dehydrogenase
FucO
YdiOの周辺を見てみると・・
ydiO: predicted acyl-CoA dehydrogenase
ydiF: fused predicted acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase: alpha subunit/beta subunit
ydiP: predicted DNA-binding transcriptional regulator
ydiQ: predicted electron transfer flavoprotein subunit
ydiR: predicted electron transfer flavoprotein, FAD-binding subunit
ydiS: predicted oxidoreductase with FAD/NAD(P)-binding domain
ydiT: predicted 3Fe-4S ferredoxin-type protein
fadK: short chain acyl-CoA synthetase, anaerobic
http://mbgd.genome.ad.jp/htbin/MBGD_gene_info_frame.pl?name=eco:B1695
熱力学的解析
疑問点
○著者らは、Acyl-CoA dehydrogenaseが不可逆であることは認識している筈だ。
○Enoyl-CoA reductaseを発現させないと、逆回転しないことも承知していた筈だ。
○しかし、当初、YdiOの発現は特に狙ってはいないようだ。
○YdiOのことを理解した上で、過剰発現は特に狙わなかったのだろうか？
○何故、ｆadE （逆方向の酵素をコードする遺伝子） を破壊しないのだろうか？
○Enoyl-CoAは大腸菌に悪影響を及ぼすのだろうか？
逆回転
β酸化経路
による
物質生産
Thioesterasedriven reaction
Nature 476: 355-361 (2011)
１回転で生成され得る他の物質の生産性
TesA: Thioesterase I
TesB: Thioesterase II
エノイル-CoAの毒性を示唆？
生産性の低さ ⇔ Driving Forceの欠如
複数回の回転では？
使用菌株：RB03 (RB02 [fadBA+] ΔyqhD ΔfucO ΔfadD)
fadD: Acyl-CoA synthetase （欠損させることで脂肪酸の再吸収を防ぐ）
総括
○サイクルの利用：還元的TCAサイクルやカルビンベンソン
サイクルも、ものつくりのプラットフォームになり得るだろう
○Driving Forceを巧く入れ込むことも重要
○フラックスが大きい部分を利用することが根本的に重要
○ものつくりの基盤情報として、フラックス解析を行うことが
重要
○紹介した論文には、多分に幸運が関わっていた？
○そうでないならば、著者らは、文書化していないデータに
基づいた実験デザインを行っている筈だ・・。