Transcript Presentasi Pembuatan Bibit Unggul dengan

PEMBUATAN BIBIT UNGGUL DENGAN
TEKNOLOGI KLONING
OLEH: KELOMPOK 10
Dio Hadinata
Imelda Sinaga
Siti Rrahmadani
Togi Parasean
LATAR BELAKANG
SEJARAH DAN
DEFENISI KLONING
TAHAP/ PROSES
KLONING
KLONING
TEKHNIK KLONING
KOMPONEN
KLONING
SEJARAH KLONING
•
Kloning pada tanaman dalam arti melalui kultur sel mulamula dilakukan pada tanaman wortel. Dalam hal ini sel
akar wortel dikultur, dan tiap selnya dapat tumbuh
menjadi tanaman lengkap.
•
Kloning pada hewan dilakukan mula-mula pada amfibi
(kodok), dengan mengadakan transplantasi nukleus ke
dalam telur kodok yang dienukleasi.
•
Sejak Wilmut et al. berhasil membuat klon anak domba
yang donor nukleusnya diambil dari sel kelenjar susu
domba dewasa, maka terbukti bahwa pada mammalia
pun klon dapat dibuat. Atas dasar itu para ahli
berpendapat bahwa pada manusia pun secara teknis klon
dapat dibuat.











1962 –John Gurdon claims to have cloned frog from adult
cells.
1963 – J.B.S. Haldane coins the term ‘clone’
1966 – Establishment of the complete genetic code
1967 – Enzyme DNA ligase isolated
1969 – Shapiero and Beckwith isolate the first gene
1970 – First restriction enzyme isolated
1972 – Paul berg creates the first recombinant DNA
molecules
1973 – Cohen and Boyer create first recombinant DNA
organisms
1977 – Karl Illmensee claims to have created mice with
only one parent
1979 – Karl Illmensee makes claim to have cloned
threemice
1983 – Solter and McGrath fuse a mouse embryo cell with
an egg without a nucleus, but fail to clone their technique












1984 – Steen Wiladsen clones sheep from embryo cells
1985– Steen Wiladsen clones sheep from embryo cells. Steen
Wiladsen joins Grenad Genetics to comercially clone cattle
1986 – Steen Wiladsen clones cattle from differentiated cells
1986 – First, Prather, and Eyestone clone a cow from embryo
cells
1990 – Human Genome Project begins
1996 – Dolly, the first animal cloned from adult cells, born
1997 – President Bill Clinton proposes a five year moratorium
on cloning
1997 – Richard Seed announces his plans to clone a human
1997 – Wilmut and Campbell create Polly, a cloned sheep with
an inserted
human gene
1998 – Teruhiko Wakayama creates three generations of
genetically identical
cloned mice.
DEFENISI KLONING

Kloning berasal dari kata "Klon" dalam bahasa
Yunani yang berarti ranting yang dapat mereplikasi
sendiri dan akhirnya tumbuh menjadi pohon.

Kloning adalah cara bereproduksi secara aseksual
atau untuk membuat salinan atau satu set salinan
organisme mengikuti fusi atau memasukan inti
diploid kedalam oosit.

Kloning merupakan proses perbanyakan fragmen
gen target dengan mengintroduksi DNA rekombinan
ke dalam suatu sel inang (Brooker) .

Americaan Medical Association mendefinisikan
kloning sebagai produksi dari organisme identik
secara genetik melalui sel somatik transfer
nuklir, walaupun definisi yang lebih luas sering
digunakan untuk memasukkan produksi jaringan
dan organ dari kultur sel atau jaringan
menggunakan sel.

Kloning
dalam
biologi
adalah
proses
menghasilkan populasi serupa genetik individu
identik yang terjadi di alam saat organisme
seperti bakteri, serangga atau tanaman
bereproduksi secara aseksual.
TEKHNIK KLONING
a. Transfer nukleus
Transfer nukleus membutuhkan dua sel yaitu suatu sel donor
dan suatu oosit atau sel telur. Telur matur sebelum dibuahi
dibuang intinya atau nukleusnya. Proses pembuangan nukleus
tadi dinamakan enukleasi. Hal ini dilakukan untuk
menghilangkan informasi genetisnya. Ke dalam telur yang
telah dienukleasi tadi kemudian dimasukkan nukleus (donor)
dari sel somatik.
Penelitian membuktikan bahwa sel telur akan berfungsi
terbaik bila hanya dalam anfertilisasi, sebab hal ini akan
mempermudah penerimaan nukleus donor seperti dirinya
sendiri. Di dalam telur, inti sel donor tadi akan bertindak
sebagai inti sel zigot dan membelah serta berkembang
menjadi blastosit.
Blastosit selanjutnya ditransfer ke dalam uterus induk
pengganti (surrogate mother). Jika seluruh proses tadi berjalan
baik, suatu replika yang sempurna dari donor akan lahir. Jadi
sebenarnya setelah terbentuk blastosit in vitro, proses
selanjutnya sama dengan proses bayi tabung yang
tehnologinya telah dikuasai oleh para ahli Obstetri Ginekologi.
b. Tekhnik Roslin
Kloning domba Dolly merupakan peristiwa penting dalam sejarah
kloning. Tidak saja hal tersebut membangkitkan antusias terhadap
kloning, melainkan juga hal tersebut membuktikan bahwa kloning
binatang dewasa dapat disempurnakan.
Sebelumnya, tidak diketahui bahwa suatu nukleus dewasa ternyata
mampu memproduksi suatu hewan yang komplit. Bila terjadi kerusakan
genetis dan deaktivasi gen yang sederhana maka kedua keadaan
tersebut kemungkinan bersifat menetap.
Hal tersebut di atas bukanlah suatu kasus yang menyusul setelah
penemuan oleh Ian Wilmut dan Keith Cambell tentang suatu metode
yang mana mampu melakukan singkronisasi siklus sel dari kedua sel
donor dan sel telur. Tanpa singkronosasi siklus sel, maka inti tidak akan
berada pada suatu keadaan yang optimum untuk dapat diterima oleh
embrio. Bagaimanapun juga sel donor harus berjuang untuk dapat
masuk ke Gap Zero, atau stadium sel GO, atau stadium sel dorman.
Domba yang baru lahir tersebut memiliki semua karakteristik
yang sama dengan domba yang lahir secara alamiah. Dan telah
diamati bila ada efek yang merugikan, seperti resiko yang tinggi
terhadap kanker atau penyakit genetis lainnya yang terjadi atas
kerusakan bertahap kepada DNA, dikemudian hari juga terjadi
pada Dolly atau hewan lainnya yang dikloning dengan metode ini.
c. Tekhnik Honolulu
Pada Juli 1998, suatu tim ilmuwan dari Universitas Hawai mengumumkan
bahwa mereka telah menghasilkan tiga generasi tikus kloning yang secara
genetik identik. Tehnik ini diakreditasi atas nama Teruhiko Wakayama dan
Ryuzo Yanagimachi dari Universitas Hawai.
Tikus telah sejak lama diketahui merupakan mamalia yang tersulit untuk
dikloning, ini merujuk pada bahwa segera setelah suatu sel telur tikus
mengalami fertilisasi ia akan segera membelah. Domba digunakan pada
tehnik Roslin karena sel telurnya membutuhkan beberapa jam sebelum
membelah, memungkinkan adanya waktu bagi sel telur untuk memprogram
ulang nukleus barunya.
Meskipun tidak mendapatkan keuntungan tersebut ternyata Wakayama dan
Yanagimachi mampu melakukan kloning dengan angka keberhasilan yang
jauh lebih tinggi (3 kloning dari sekitar seratus yang dilakukan) dibandingkan
Ian Wilmut (satu dari 277).
Wakayama melakukan pendekatan terhadap masalah sinkronisasi siklus sel
yang berbeda dibandingkan Wilmut. Wilmut menggunakan sel dari kelenjar
mammae yang harus dipaksa untuk memasuki ke stadia GO. Wakayama
awalnya menggunakan tiga tipe sel yakni, sel Sertoli, sel otak dan sel kumulus.
Sel Sertoli dan sel otak keduanya tinggal dalam stadia GO secara alamiah dan
sel kumulus hampir selalu hadir pada stadia G0 ataupun G1.
KOMPONEN-KOMPONEN KLONING
a. Sumber DNA
Sumber DNA untuk pengerjaan kloning dapat berupa DNA kromosom
yang diisolasi dari inti sel ataupun DNA komplementer yang diperoleh
dari penyalinan mRNA dengan bantuan enzim reverse transcriptase,
disebut complementary DNA (cDNA) .
b. Vektor
Vektor merupakan merupakan wahana pembawa fragmen gen target ke
dalam suatu sel inang. Persyaratan utama suatu molekul DNA dapat
digunakan sebagai vektor, antara lain harus mampu disisipi DNA asing,
dapat diintroduksi ke dalam sel inang, dapat bereplikasi secara
independen di dalam sel inang, dan memiliki penanda seleksi.
Vektor yang sering digunakan untuk penelitian kloning dalam sel bakteri
adalah virus dan plasmid. Vektor lain yang dapat digunakan dalam
kloning adalah kosmid, fagemid, bacterial artificial chromosome (BAC),
dan yeast artificial chromosome (YAC).
c. Enzim endonuklease restriksi
Enzim endonuklease restriksi yang diisolasi dari
bakteri merupakan enzim yang dapat memotong
ikatan fosfodiester untai DNA asing pada sekuen
pengenalan yang spesifik.
d. Enzim ligase
Enzim
ligase
merupakan
enzim
yang
mengkatalisis reaksi pembentukan kembali
ikatan fosfodiester antara potongan fragmen
DNA atau RNA berujung kohesif yang saling
berkomplemen hasil pemotongan dengan enzim
restriksi .
e. Sel inang
Bakteri Escherichia coli (Migula) Castellani & Chalmers,
Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn, dan khamir
Saccharomyces cerevisiae (Meyen) Hansen merupakan
mikroorganisme yang sangat bermanfaat dalam kloning
karena memiliki karakteristik ideal sebagai sel inang bagi
gen yang akan dikloning, antara lain mudah dimanipulasi,
mampu tumbuh dengan cepat dan stabil pada medium
kultur biasa, non-patogen, serta dapat ditransformasi DNA
asing.
TAHAP/ PROSES KLONING
a. Amplifikasi fragmen gen target
Polymerase chain reaction (PCR) merupakan teknik
amplifikasi sekuen DNA spesifik secara in vitro dengan
proses pemanjangan primer pada untai DNA
komplementer .
Reaksi PCR terdiri atas sejumlah komponen esensial,
antara lain enzim DNA polimerase yang termostabil,
sepasang oligonukleotida spesifik yang berperan sebagai
primer, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), kation divalen,
kation monovalen, buffer, serta DNA cetakan.
Sekuen primer membatasi daerah fragmen DNA target
yang akan diamplifikasi, kemudian enzim DNA polimerase
akan menginisiasi sintesis salinannya
persyaratan untuk desain primer yang baik antara lain panjang
primer sekitar 17--28 basa, memiliki kandungan basa GC 40-60%, pada ujung 3’ terdapat basa G atau C, temperature of
melting sekitar 55--80° C, dan tidak terjadi selfcomplementarity.
Reaksi PCR ditempatkan pada mesin thermal cycler yang
dapat mengatur suhu sesuai dengan tiga tahapan dalam
siklus PCR. Tahap awal reaksi PCR merupakan pemisahan
untai ganda DNA (denaturasi) yang dilakukan pada suhu 95°
C, dilanjutkan dengan pemasangan basa primer dengan untai
tunggal DNA cetakan (annealing) pada suhu sekitar 50--65° C,
kemudian pada suhu 72° C, berlangsung sintesis untai DNA
baru oleh enzim DNA polimerase (Fairbanks & Andersen 1999:
278). Setiap siklus pada PCR menghasilkan 2 salinan untai
ganda fragmen target.
Kedua hasil salinan DNA target dari setiap siklus akan menjadi
cetakan bagi siklus berikutnya sehingga reaksi PCR dengan 30
siklus dapat menghasilkan jutaan fragmen DNA target
b. Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor
Penyisipan fragmen DNA atau gen target ke
dalam DNA vektor untuk membentuk molekul
DNA rekombinan melibatkan 2 tahap, yaitu
digesti serta ligasi DNA vektor dan gen target
sisipan. Vektor dan sisipan didigesti dengan
enzim restriksi yang sama sehingga keduanya
memiliki potongan kohesif (sticky ends) serupa
yang akan saling berlekatan.
Enzim ligase mengkatalisis proses perlekatan
basa-basa
nukleotida
yang
saling
berkomplemen.
c. Introduksi vektor rekombinan ke dalam sel inang
Tahap lanjutan pada kloning gen setelah pembuatan
molekul DNA rekombinan (vektor yang disisipi gen sisipan)
adalah introduksi DNA rekombinan ke dalam sel inang.
Sel inang akan tumbuh dan membelah membentuk
banyak koloni yang mengandung DNA target.
Introduksi DNA vektor plasmid yang mengandung gen
sisipan ke dalam sel inang bakteri disebut transformasi;
sedangkan introduksi vektor virus dinamakan transfeksi).
Sel inang terlebih dahulu dibuat menjadi kompeten
sebelum dilakukan proses transformasi sehingga menjadi
permeabel terhadap DNA asing.
Sel kompeten dapat dibuat dengan memberikan
perlakuan fisik atau kimia yang akan meningkatkan
kemampuan sel untuk mengikat dan mengambil DNA.
Proses introduksi DNA ke dalam sel terjadi pada saat
pemberian kejutan panas terhadap sel kompeten
dan DNA dengan menaikkan suhu inkubasi secara
drastis dari 0° C menjadi 42° C selama sekitar 1--2
menit.
Parameter keberhasilan proses transformasi dapat
ditentukan dengan nilai efisiensi transformasi yang
tinggi. Jumlah koloni transforman yang tumbuh pada
permukaan medium seleksi dihitung, kemudian
dimasukkan
dalam
perhitungan
efisiensi
transformasi. Nilai efisiensi transformasi optimal
metode CaCl2 adalah 106 cfu/µg.
d. Seleksi hasil kloning
Keberhasilan proses kloning dapat diketahui
dengan melakukan seleksi. Melalui proses
seleksi, koloni transforman yang membawa DNA
rekombinan target (berhasil dikloning) dapat
dibedakan dari koloni transforman yang tidak
membawa DNA target.
Proses seleksi dapat dilakukan dengan sejumlah
metode, seperti hibridisasi DNA probe, hibridisasi
antibodi monoklonal, dan seleksi nutrien.
Metode yang umum digunakan adalah seleksi
antibiotik dan α-komplementasi (blue-white
screening).
MANFAAT KLONING
1. Untuk pengembangan ilmu pengetahuan
2. Untuk mengembangkan dan memperbanyak
bibit unggul
3. Untuk tujuan diagnostik dan terapi
4. Menolong atau menyembuhkan pasangan infertil
mempunyai turunan
BIOETIKA KLONING
Hingga waktu ini sikap para ilmuwan, organisasi
profesi dokter dan masyarakat umumnya adalah
bahwa pengklonan individu yaitu pengklonan
untuk tujuan reproduksi (reproductive cloning)
dengan menghasilkan manusia duplikat,
kembaran identik, manusia fotokopi yang
berasal dari sel induk dengan cara implantasi
inti sel tidak dibenarkan, tetapi untuk tujuan
terapi (therapeutic cloning) dianggap etis.
SEKIAN
DAN
TERIMAKASIH